鄧穎，熊安秀，劉景珍，祁閃閃，熊昊

（1. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院公共衛(wèi)生科，武漢 430015； 2. 宜昌市中心人民醫(yī)院兒科，湖北 宜昌 443003； 3. 恩施州中心醫(yī)院兒童血液消化心血管腎病中心，湖北 恩施 445099； 4 .華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院兒童血液疾病研究室，武漢 430015； 5.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院血液腫瘤科，武漢 430015）

急性髓細(xì)胞白血病 （acute myeloid leukemia，AML）約占兒童白血病的20%～25%［1］。雖然與急性淋巴細(xì)胞白血病相比，兒童AML的發(fā)病率低，預(yù)后較差。目前，AML的總生存率不到70%，復(fù)發(fā)率高達(dá)25%～35%［2-3］。細(xì)胞遺傳學(xué)被認(rèn)為是AML風(fēng)險(xiǎn)分層的主要依據(jù)，然而在臨床實(shí)踐中，接近半數(shù)的AML患兒細(xì)胞遺傳學(xué)正常，疾病的轉(zhuǎn)歸卻有著顯著的差異［4］。近年來(lái)，隨著二代基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，AML相關(guān)的重現(xiàn)性遺傳學(xué)異常逐漸被發(fā)現(xiàn)，并且在AML診斷、治療和預(yù)后等方面的重要性日益凸顯，但仍有部分患兒未攜帶已知的遺傳學(xué)異常。因此，探究與兒童AML相關(guān)的新的分子生物標(biāo)志物有助于對(duì)AML患兒進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分層。本研究通過(guò)下載和整理有效治療方法適用性研究 （therapeutically applicable research to generate effective treatments，TARGET） 數(shù)據(jù)庫(kù)中兒童AML的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床信息，利用生物信息學(xué)分析手段對(duì)AML相關(guān)的致病基因進(jìn)行挖掘，以期為探索AML的發(fā)病機(jī)制及分子標(biāo)志物的篩選提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 基因表達(dá)數(shù)據(jù)信息

通過(guò)TARGET網(wǎng)站 （https：//ocg.cancer.gov/programs/target） 檢索并下載兒童AML的臨床信息和基因表達(dá)數(shù)據(jù)。TARGET數(shù)據(jù)庫(kù)包含121例AML患兒的臨床信息，其中，女性患兒63例，男性患兒58例。TARGET數(shù)據(jù)庫(kù)中AML患兒的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床信息來(lái)自美國(guó)兒童腫瘤協(xié)作組 （children’s oncology group，COG） 的美國(guó)AML （America acute myeloid leukemia，AAML） 0531 Ⅲ期臨床試驗(yàn)。

1.2 差異表達(dá)基因的篩選

采用R軟件的DESeq2包對(duì)TARGET數(shù)據(jù)庫(kù)AML患兒的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選，篩選條件為差異表達(dá)上調(diào)或下調(diào)≥2倍，即 | log2FC |≥1，且P< 0.05。

1.3 差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析

采用DAVID在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選出的差異基因進(jìn)行基因本體論 （Gene Ontology，GO） 注釋和京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫(kù) （Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG） 信號(hào)通路注釋，分析差異基因參與的生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP） 以及涉及的相關(guān)通路，以P< 0.05 為入選標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)用STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建差異基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖，然后使用Cytoscape 3.7.2 軟件進(jìn)行可視化，并通過(guò)cytoHubba插件篩選hub基因。

1.4 樞紐（hub）基因的驗(yàn)證

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用R語(yǔ)言的survival包計(jì)算hub基因表達(dá)量的最佳cut-off值，并將表達(dá)量

2 結(jié)果

2.1 差異基因的篩選

TARGET數(shù)據(jù)庫(kù)中有121例AML患兒的臨床信息，除7例危險(xiǎn)度分層未知外，其余114例患兒中48例低危，61例中危，5例高危。進(jìn)一步對(duì)114例患兒初診時(shí)骨髓標(biāo)本的基因表達(dá)信息進(jìn)行分析。相較于低?；純海懈呶；純河? 092個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因1 167個(gè)，下調(diào)基因925個(gè) （圖1A）。相較初診患兒，39例復(fù)發(fā)患兒有785個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因184個(gè)，下調(diào)基因601個(gè) （圖1B）。繪制2組差異基因的韋恩圖，共得到差異基因96個(gè)，其中上調(diào)基因38個(gè)（圖1C），下調(diào)基因58個(gè) （圖1D）。

圖1 TARGET數(shù)據(jù)庫(kù)AML患兒差異基因的篩選Fig.1 Screening of DEGs of childhood AML using the TARGET database

2.2 差異基因的GO富集分析和KEGG富集分析

采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)96個(gè)差異基因進(jìn)行GO富集分析。結(jié)果顯示，差異基因在細(xì)胞組分 （cellular component，CC） 主要富集于核小體、細(xì)胞質(zhì)、晚期內(nèi)體膜、核染色體、濃縮染色體外著絲粒，在BP中主要富集于核小體組裝、染色體分離、對(duì)有毒物質(zhì)的反應(yīng)、染色質(zhì)沉默、紡錘組織，在分子功能 （molecular function，MF） 主要富集于蛋白質(zhì)異二聚活性、DNA結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合、微管結(jié)合、MAP激酶酪氨酸/絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性，見(jiàn)圖2A。96個(gè)差異基因的KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，差異基因在酗酒、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、病毒致癌等通路聚集，見(jiàn)圖2B。

圖2 差異基因的富集分析Fig.2 Enrichment analysis of DEGs

2.3 分析與AML相關(guān)的hub基因

通過(guò) STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建96個(gè)差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò) （圖3A）。除去孤立無(wú)關(guān)系的蛋白節(jié)點(diǎn)，通過(guò)Cytoscape 軟件對(duì)差異基因進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)的可視化（圖3B），顏色越紅，關(guān)聯(lián)性越強(qiáng)。在Cytoscape 軟件的cytoHubba模塊，分別使用Betweenness、EPC、MCC、Radiality、Stress等5種計(jì)算方法計(jì)算 PPI 網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的前10個(gè)有較高連接度的hub基因，見(jiàn)表1。得到的15個(gè)hub基因分別是細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白2 （cell division cycle associated 2，CDCA2）、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶1 （cyclin dependent kinase 1，CDK1）、著絲粒蛋白E （centromere protein E，CENPE）、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B （DNA methyltransferase 3 beta，DNMT3B）、二肽基肽酶4 （dipeptidyl peptidase 4，DPP4）、核酸外切酶1 （exonuclease 1，EXO1）、TTK蛋白激酶 （TTK protein kinase，TTK）、FOS原癌基因 （Fos proto-oncogene，F(xiàn)OS）、H2B聚集組蛋白5 （H2B clustered histone 5，H2BC5）、H3聚集組蛋白4 （H3 clustered histone 4，H3C4）、H3聚集組蛋白10 （H3 clustered histone 10，H3C10）、H2A聚集組蛋白19 （H2A clustered histone 19，H2AC19）、H2A聚集組蛋白20 （H2A clustered histone 20，H2AC20）、H2B聚集組蛋白21 （H2B clustered histone 21，H2BC21）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄1（transforming growth factor beta 1 induced transcript 1，TGFB1I1）。

表1 5種計(jì)算方法的前10個(gè)hub基因Tab.1 The top 10 hub genes identified by five centrality methods

圖3 差異基因的PPI分析Fig.3 PPI analysis of DGEs

2.4 hub基因與AML患兒臨床病理特征的相關(guān)性

采用χ2檢驗(yàn)分析AML患兒臨床病理特征 （包括性別、年齡、初診時(shí)外周血白細(xì)胞、中樞浸潤(rùn)、危險(xiǎn)度分層） 與15個(gè)hub基因表達(dá)量之間的相關(guān)性。結(jié)果表明hub基因的表達(dá)與男女比例、年齡分布、是否中樞侵犯等無(wú)相關(guān)性 （均P> 0.05）。DNMT3B、DPP4、CENPE、TTK、CDCA2、EXO1、CDK1的高表達(dá)與危險(xiǎn)度分層呈正相關(guān) （均P< 0.05），H2BC21、H2AC19、H3C10、FOS、H3C4、TGFB1I1、H2BC5、H2AC20的高表達(dá)與危險(xiǎn)度分層呈負(fù)相關(guān) （均P< 0.05）。DPP4、CENPE、TTK、CDCA2基因高表達(dá)組患兒初診時(shí)外周血WBC高于低表達(dá)組 （均P< 0.05），H2BC21、H2AC19、H3C10、FOS、H3C4、H2BC5、H2AC20基因高表達(dá)組患兒初診時(shí)外周血白細(xì)胞低于低表達(dá)組（均P< 0.05），DNMT3B、EXO1、CDK1、TGFB1I1基因高表達(dá)組和低表達(dá)組患兒初診時(shí)白細(xì)胞計(jì)數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （均P> 0.05）。

2.5 hub基因與AML患兒預(yù)后的關(guān)系。

對(duì)15個(gè)hub基因進(jìn)行單因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示，DNMT3B、DPP4、CENPE、TTK、CDCA2、EXO1、CDK1等基因的高表達(dá)和H2BC21、H2AC19、H3C10、FOS、H3C4、TGFB1I1、H2BC5、H2AC20等基因的低表達(dá)是影響AML患兒總生存期的危險(xiǎn)因素。對(duì)以上因素進(jìn)行多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析，結(jié)果顯示，15個(gè)相關(guān)聯(lián)的hub基因中DNMT3B的高表達(dá)、DPP4的高表達(dá)、CENPE的高表達(dá)、H3C10的低表達(dá)是AML患兒總生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表2。

表2 hub基因的單因素和多因素分析構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型Tab.2 Univariate and multivariate Cox regression analyses of the hub genes for constructing prognostic risk models

3 討論

本研究通過(guò)分析TARGRT數(shù)據(jù)庫(kù)AML患兒的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，篩選出與危險(xiǎn)度分層和復(fù)發(fā)相關(guān)的96個(gè)差異基因。GO和KEGG富集分析結(jié)果顯示，差異基因編碼的蛋白主要富集于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，參與的BP主要有DNA結(jié)合、核小體組裝、染色體分離等。

在篩選出的hub基因中，DNMT3B與DNA甲基化的相關(guān)。DNMT3B負(fù)責(zé)DNA的從頭甲基化。雖然在AML中DNMT3B的突變很少見(jiàn)，但DNMT3B的高表達(dá)預(yù)示著高耐藥率和高復(fù)發(fā)率［5-6］。髓過(guò)氧化物酶 （myeloperoxidase，MPO） 是診斷AML的生物標(biāo)志物，其高表達(dá)與更好的預(yù)后相關(guān)。據(jù)報(bào)道，DNMT3B可以上調(diào)AML細(xì)胞MPO啟動(dòng)子的甲基化，抑制MPO的表達(dá)。而且DNMT3B對(duì)MPO啟動(dòng)子的甲基化不受AML常見(jiàn)突變 （FLT3-ITD、CEBPA或NPM1突變） 的影響［7］。此外，DNMT3B高表達(dá)導(dǎo)致DNA超甲基化在T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病和伯基特淋巴瘤中也有報(bào)道［8］。

DPP4表達(dá)于骨髓來(lái)源的細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等［9-11］。在慢性白血病，尤其是慢性B淋巴細(xì)胞白血病中，有大量研究［12-14］證明了DPP4的促癌作用。DPP4的表達(dá)影響臨床分期、治療緩解所需時(shí)間、總生存期、無(wú)病生存期，是負(fù)性的預(yù)后因素。雖然急性白血病樣本中，包括T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病、B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病和AML，白血病細(xì)胞膜DPP4的表達(dá)量與非白血病患者無(wú)差異，但白血病患者血漿sCD26/DPP4明顯高于非白血病患者［15］。

CENPE、CDCA2、CDK1、TTK、EXO1、FOS與細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖密切相關(guān)。在AML中，CDK1的促癌作用相對(duì)明確，但關(guān)于CENPE、CDCA2、TTK、EXO1、FOS的報(bào)道較少。H2BC5、H2AC19、H2AC20、H2BC21、H3C4、H3C10是組蛋白H2和H3的成員，是構(gòu)成核小體的重要組成部分。目前，關(guān)于TGFB1I1、H2BC5、H2AC19、H2AC20、H2BC21、H3C4、H3C10在AML致病機(jī)制中的作用少有報(bào)道。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)TARGET數(shù)據(jù)庫(kù)AML患兒初治時(shí)低危組與中高危組的骨髓差異基因、初治時(shí)與復(fù)發(fā)時(shí)骨髓差異基因的綜合分析，發(fā)現(xiàn)CDCA2、CDK1、CENPE、DNMT3B、DPP4、EXO1、TTK、FOS、H2BC5、H3C4、H3C10、H2AC19、H2AC20、H2BC21和TGFB1I115個(gè)與兒童AML相關(guān)的hub基因。這15個(gè)基因均與預(yù)后相關(guān)，尤其是影響預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素的DNMT3B、DPP4、CENPE和H3C10基因可能成為兒童AML的分子機(jī)制研究以及預(yù)后判斷的新靶點(diǎn)。