陳金明，楊關(guān)根，裘建明，王東，秦靚，沈忠

結(jié)直腸癌CD146基因甲基化與患者臨床病理特征和生存的關(guān)系

陳金明，楊關(guān)根，裘建明，王東，秦靚，沈忠

浙江省杭州市第三人民醫(yī)院肛腸科，浙江杭州 310009

探討結(jié)直腸癌組織中CD146基因甲基化改變與患者臨床病理特征和生存的關(guān)系。應(yīng)用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測方法，分析CD146基因甲基化。采用電化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行定量檢測結(jié)直腸癌患者血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）含量。采用Kaplan-Meier生存曲線計(jì)算結(jié)直腸癌患者生存率。與結(jié)直腸癌組相比，對照組和腺瘤組CD146基因甲基化陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）。CD146基因甲基化與結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度和TNM分期之間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）。CD146基因甲基化與CEA含量之間明顯相關(guān)（<0.05）。Kaplan-Meier生存曲線經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CD146基因甲基化與結(jié)直腸癌患者總體5年生存率之間存在相關(guān)性（<0.05）。CD146基因表觀遺傳學(xué)的改變參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。檢測CD146基因甲基化可作為反映結(jié)直腸癌患者部分惡性生物學(xué)行為和生存期的指標(biāo)。

結(jié)直腸癌；CD146；基因；甲基化；生存

CD146是一種在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的黏附分子，通過結(jié)合不同配體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮關(guān)鍵作用。CD146參與了血管新生、脈管的滲漏和白細(xì)胞的遷移[1]。在多種惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)CD146過表達(dá)，它參與了腫瘤生成和進(jìn)展的各個(gè)環(huán)節(jié)，尤其與腫瘤血管新生和淋巴管的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]。DNA甲基化是常見的表觀遺傳學(xué)改變。在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中，CD146基因表觀遺傳學(xué)的改變，以及與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征和生存的關(guān)系，在文獻(xiàn)中尚未見報(bào)道。本研究旨在探討CD146基因甲基化的改變與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征和患者生存的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集杭州市第三人民醫(yī)院2015年1月至2016年6月外科手術(shù)切除并有完整隨訪資料的結(jié)直腸癌組織標(biāo)本68例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)組織病理學(xué)檢查診斷為結(jié)直腸癌；②首次行結(jié)直腸癌根治性切除術(shù)，術(shù)前未行放化療；③患者或家屬隨訪依從性好。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他臟器惡性腫瘤；②術(shù)前已接受放、化療治療；③合并嚴(yán)重心臟、肺、肝臟、腎臟等基礎(chǔ)疾??；④無法配合隨訪。68例結(jié)直腸癌患者中，男37例，女31例，年齡26～80歲，平均年齡為（57.39±14.58）歲。選取同期手術(shù)切除和結(jié)腸鏡下摘除結(jié)直腸腺瘤的患者26例，其中男15例，女11例，年齡30～73歲，平均年齡為（54.85±11.90）歲。另收集正常結(jié)直腸黏膜標(biāo)本15例作為對照組。隨訪方式采用郵件、電話和門診隨訪，隨訪截止日期為2021年6月30日?？偵鏁r(shí)間（overall survival，OS）定義為手術(shù)后第1天至患者死亡日期或截止日期。至隨訪截止日期，68例隨訪患者中，29例患者死亡。同時(shí)收集所有入組患者的癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）水平。本研究經(jīng)浙江省杭州市第三人民醫(yī)院倫理委員會審批（倫理審批號：Y-KL2020008、Y-KL2020009），所有入選患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 甲基化特異性PCR檢測

CD146在啟動子區(qū)的甲基化狀況：采用酚氯仿抽提，乙醇沉淀法提取組織DNA，用ddH2O溶解，紫外分光光度計(jì)測定其濃度及純度，置于–20℃冰箱保存。取2μg的DNA標(biāo)本用亞硫酸氫鹽處理，然后經(jīng)DNA Wizard純化回收試劑盒（美國Promega公司）純化回收DNA，所得修飾后DNA作為甲基化特異性PCR擴(kuò)增的模板（立即使用或–20℃保存）。分別設(shè)計(jì)CD146特異性甲基化引物（CD146-M）和特異性非甲基化引物（CD146-U），引物序列：①CD146-M上游引物：5’-ATTATATTTAGGTGGGAAGTGCGT-3’，下游引物：5’-CTACGAACCATACAAAAACAACGTA-3’，產(chǎn)物為105bp；②CD146-U上游引物：5’-GGGATTAT ATTTAGGTGGGAAGTGT-3’，下游引物：5’-CTACA AACCATACAAAAACAACAT A-3’，產(chǎn)物為108bp。對亞硫酸鹽修飾后的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃ 5min，95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 40s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 7min。以體外高甲基化DNA（in vitro hypermethylated DNA，IVD）為甲基化陽性對照，用純化的人類HCT 116 DKO非甲基化DNA作為非甲基化對照，以去離子水為空白對照，見圖1。

圖1 CD146基因甲基化在結(jié)直腸組織中的表達(dá)

注：U為非甲基化；M為甲基化

1.3 甲基化特異性PCR產(chǎn)物分析與癌胚抗原檢測

取10μl PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳，130V約20min。判斷標(biāo)準(zhǔn)：若CD146-M引物擴(kuò)增出105bp條帶，而CD146-U引物未擴(kuò)增出條帶，說明CD146基因啟動子區(qū)發(fā)生了完全甲基化；若CD146-M引物未擴(kuò)增出條帶，而CD146-U引物擴(kuò)增出108bp條帶，說明未發(fā)生甲基化；如果兩種引物均擴(kuò)增出相應(yīng)大小的條帶，說明存在部分甲基化。部分甲基化和完全甲基化均視為甲基化。采用電化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行定量檢測，≥5ng/ml為陽性，<5ng/ml為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。結(jié)直腸癌細(xì)胞CD146基因甲基化與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系分析采用2檢驗(yàn)；結(jié)直腸癌細(xì)胞CD146基因甲基化與患者CEA之間的相互關(guān)系采用Pearson相關(guān)性分析。結(jié)直腸癌細(xì)胞CD146基因甲基化與患者術(shù)后生存的關(guān)系分析采用Kaplan-Meier限乘法計(jì)算生存率，繪制累積生存函數(shù)曲線，采用Log-rank法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD146基因甲基化在結(jié)直腸各組織中的陽性率比較

15例對照組發(fā)生CD146基因甲基化2例，甲基化陽性率為13.33%。26例腺瘤發(fā)生CD146基因甲基化6例，甲基化陽性率為23.08%。其中低級別腺瘤為12例，發(fā)生甲基化2例，甲基化陽性率為16.67%；高級別腺瘤為14例，發(fā)生甲基化4例，甲基化陽性率為28.57%。68例結(jié)直腸癌發(fā)生CD146基因甲基化46例，甲基化陽性率為67.65%。與結(jié)直腸癌組相比，對照組、低級別和高級別腺瘤組CD146基因甲基化陽性率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=24.435，0.05）。

2.2 結(jié)直腸癌組織中CD146基因甲基化與患者臨床病理特征的關(guān)系

CD146基因甲基化與患者的性別、年齡、腫瘤直徑和部位、分化程度之間，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05）。但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度和TNM分期之間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）。

表1 CD146基因甲基化與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]

2.3 結(jié)直腸癌組織CD146基因甲基化與CEA、患者生存的關(guān)系

在68例結(jié)直腸癌患者中，CEA陽性38例，陽性率為55.88%。結(jié)直腸癌組織CD146基因甲基化與CEA的相互關(guān)系，經(jīng)Pearson相關(guān)性分析顯示，結(jié)直腸癌組織CD146基因甲基化與CEA之間呈正相關(guān)。（=0.272，0.025）。結(jié)直腸癌患者CD146基因甲基化組和未甲基化組Kaplan-Meier生存曲線經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量的值為3.92，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05），見圖2。

圖2 CD146基因甲基化與結(jié)直腸癌患者5年生存率的關(guān)系

3 討論

結(jié)直腸癌的進(jìn)展是一個(gè)復(fù)雜的、涉及遺傳和表觀遺傳學(xué)改變的多步驟累積的過程。在結(jié)腸上皮、腺瘤和腸癌的演變過程中，伴隨著一定數(shù)量和分布的驅(qū)動基因的突變以及表觀遺傳學(xué)的改變[3]。上述的演變使得腫瘤細(xì)胞能結(jié)合各種不同的功能蛋白，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞適應(yīng)能力的提高并通過達(dá)爾文式的自然選擇造成治療失敗[4]。本研究旨在探討結(jié)直腸癌發(fā)生、進(jìn)展過程中，CD146基因甲基化表觀遺傳學(xué)改變的變化特點(diǎn)，以及與患者臨床病理學(xué)特征、血清CEA和患者生存的關(guān)系，從而初步揭示CD146基因甲基化表觀遺傳學(xué)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的紊亂在結(jié)直腸癌發(fā)生和進(jìn)展過程中的變化特征和預(yù)后價(jià)值。

在本研究中，對照組、腺瘤組和結(jié)直腸癌組中，CD146基因甲基化陽性率分別為13.33%、23.08%和67.65%。對照組、低級別和高級別腺瘤組之間，CD146基因甲基化陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05）。對照組、腺瘤組與結(jié)直腸癌組之間，CD146基因甲基化陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）。表明在結(jié)直腸癌的發(fā)生、進(jìn)展過程中，CD146基因發(fā)生了高甲基化，導(dǎo)致CD146基因表達(dá)降低。在已發(fā)表的人類的部分實(shí)體腫瘤研究中，也發(fā)現(xiàn)了CD146基因高甲基化現(xiàn)象。在前列腺癌的研究中，發(fā)現(xiàn)非瘤變前列腺組織、前列腺上皮內(nèi)瘤變和前列腺原位癌中CD146基因甲基化率分別為12.5%、23.0%和80.0%。前列腺癌中CD146基因啟動子區(qū)發(fā)生了高甲基化[5]。在結(jié)直腸癌中，通過激活Wnt/β-catenin信號通路，降低CD146基因表達(dá)促進(jìn)了腫瘤形成和癌的干性[6]。在乳腺癌的進(jìn)展中，異常的啟動子區(qū)甲基化抑制了CD146基因表達(dá)[7]。

結(jié)直腸癌組織中CD146基因甲基化與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系研究結(jié)果顯示，CD146基因甲基化與患者的性別、年齡、腫瘤直徑和部位、分化程度之間，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05）。但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度和TNM分期之間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）。在前列腺癌的研究中，發(fā)現(xiàn)CD146基因甲基化與Gleason分級和腫瘤分期密切相關(guān)[5]。

本研究結(jié)果表明CD146基因甲基化與CEA之間相關(guān)程度較弱。在早期前列腺癌的血清中，發(fā)現(xiàn)CD146基因甲基化，能作為潛在的生物學(xué)標(biāo)志物[8]。結(jié)直腸癌組織中CD146基因甲基化在腫瘤早期和晚期均有表達(dá)，而CEA大部分在結(jié)直腸癌晚期患者血清中檢測水平較高，這可能是造成兩者之間弱相關(guān)的原因之一。

本研究中CD146基因甲基化與未甲基化組相比，預(yù)后較差。在透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)，CD146基因甲基化率低于正常組織，CD146基因高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)[9]。而在本研究中發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌中CD146基因甲基化率明顯高于正常組織，并且與不良預(yù)后有關(guān)。這可能表明不同類型的實(shí)體腫瘤表觀遺傳學(xué)特性明顯不同。另外，在不同類型的腫瘤中，可能CD146基因與不同的配體結(jié)合發(fā)揮了不同的生物學(xué)功能。結(jié)直腸癌的表觀遺傳學(xué)圖譜包括成百上千的異常甲基化基因和幾十種異常的miRNAs[10]。同時(shí)，胃腸道組織表觀遺傳學(xué)改變作為敏感生物學(xué)標(biāo)志物可用于消化道腫瘤的檢測[11]。

綜上所述，CD146基因表觀遺傳學(xué)的改變參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生、進(jìn)展，檢測CD146基因甲基化可作為反映結(jié)直腸癌患者部分惡性生物學(xué)行為和生存期的指標(biāo)。另外，本研究患者樣本量較少，也未同步檢測血漿CD146基因甲基化在結(jié)直腸癌演進(jìn)中的變化特點(diǎn)，今后需要在增加樣本量的基礎(chǔ)上，對CD146基因甲基化在結(jié)直腸癌演進(jìn)中的臨床應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行更進(jìn)一步的深入探討。

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Relationship between CD146 gene methylation, clinicopathological features, and survival in colorectal cancer

Department of Anorectal Surgery, the Third Hospital of Hangzhou, Hangzhou 310009, Zhejiang, China

To investigate the relationship between CD146 gene methylation, clinico-pathological features, and survival of patients with colorectal cancer.The expression of CD146 promoter methylation were detected by methylation-specific polymerase chain reaction. The content of serum carcinoembryonic antigen (CEA) in patients with colorectal cancer was quantitatively detected by electrochemiluminescence. The survival rate of patients with colorectal cancer was evaluated by Kaplan-Meier survival curves.Compared with the colorectal cancer group, the methylation positive rate of CD146 gene promoter methylation of control group and adenoma group were significantly different (<0.05). There were significant differences between CD146 gene promoter methylation and lymph node metastasis, tumor infiltrating depth, TNM stage (<0.05). There was significant correlation between CD146 gene promoter methylation and CEA content (<0.05). Kaplan-Meier survival curves tested by Log-rank test showedthat there was correlation between CD146 gene promoter methylation and 5-year overall survival rate (<0.05).CD146 gene epigenetic alteration may be related with the occurrence and development of colorectal cancer. The detection for CD146 gene promoter methylation may be helpful to evaluate partial malignant biological behavior and survival of patients with colorectal cancer.

Colorectal cancer; CD146; Gene; Methylation; Survival

R735

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.29.009

杭州市衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（A20200024）；杭州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20201203B201）

沈忠，電子信箱：shenzhong114@sina.com

（2022–12–11）

（2023–09–04）