張躍欣 趙 墨 魏康康 周國平

腦膠質(zhì)瘤起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，屬于常見的顱內(nèi)惡性腫瘤之一，病理類型以星形細(xì)胞瘤最為常見，膠質(zhì)瘤發(fā)病率約為5.26/10 萬［1］。腦膠質(zhì)瘤易浸潤生長，對周圍神經(jīng)組織破壞性較大，大多數(shù)患者確診時已處于中晚期，手術(shù)難以完全切除，故而患者預(yù)后較差［2］。白細(xì)胞介素33（interleukin 33，IL-33）在多種惡性腫瘤中顯著高表達(dá)，參與了多種腫瘤如胃癌［3］、肝癌［4］等惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。蘇博等［5］也同樣發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者癌組織中IL-33 高表達(dá)與患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)。本研究回顧性分析腦膠質(zhì)瘤患者的臨床資料，探討腦膠質(zhì)瘤組織中IL-33 表達(dá)水平及其與預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年1 月1 日至2020 年12月31 日于南陽市中心醫(yī)院神經(jīng)外科就診的140 例腦膠質(zhì)瘤患者作為研究對象（膠質(zhì)瘤組），其中男性80例，女性60 例，年齡52~67 歲，平均（59.33±6.55）歲，依據(jù)WHO 分期參考指南［6］，Ⅰ期28 例、Ⅱ期35 例、Ⅲ期40 例、Ⅳ期37 例，病理類型均為星形細(xì)胞瘤。另選擇我院同期35 例腦外傷行顱內(nèi)減壓手術(shù)患者作為對照組，其中男性15 例、女性15 例，年齡51~66 歲，平均年齡（58.67±7.33）歲。兩組研究對象性別（χ2=2.303，P=0.129）、年齡（t=0.520，P=0.603）相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有可比性。本研究所有研究對象及其家屬均知情同意且簽署知情同意協(xié)議書。本研究經(jīng)過我院倫理委員會批準(zhǔn)（編號：YXLL2019-0109）。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①腦膠質(zhì)瘤診斷符合“中國腦膠質(zhì)瘤分子診療指南”［7］，且通過術(shù)后組織病理學(xué)確診；②我院首次確診，且既往未行放化療治療；③臨床病理數(shù)據(jù)完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他類型的惡性腫瘤；②合并急慢性肝腎功能不全、自身免疫性疾病等；③腫瘤體積太小無無法獲取標(biāo)本者；④隨訪期間發(fā)生失訪者。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化法檢測組織中IL-33的表達(dá) 選取我院病理科腦膠質(zhì)瘤患者石蠟包埋的腫瘤組織切片及腦外傷行顱內(nèi)減壓手術(shù)的正常腦組織切片，連續(xù)切片后進(jìn)行脫蠟、水化及檸檬酸鈉緩沖液加熱抗原修復(fù)等過程處理，于3%H2O2溶液室溫孵育15 min 后，采用PBS洗滌2 次，每次4 min 左右。繼續(xù)使用濃度為10% 的山羊血清封閉30 min，加入一抗后孵育24 h，繼續(xù)PBS洗滌2 次，每次4 min，再次加入二抗孵育1 h，蘇木精染色及中性樹膠封片。以PBS 作為一抗用于陰性對照。參考本課題組前期發(fā)表的文獻(xiàn)［5］，腦膠質(zhì)瘤組織中IL-33 表達(dá)水平根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度及細(xì)胞染色率評估，其中細(xì)胞染色強(qiáng)度分為無著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色，分別計(jì)0 分、1 分、2 分和3 分；細(xì)胞染色率為隨機(jī)采集10 個代表性的視野計(jì)算，陽性表達(dá)率為0%計(jì)為0 分，陽性表達(dá)率≤25% 計(jì)為1 分，25%<陽性表達(dá)率≤50%計(jì)為2 分，50%<陽性表達(dá)率≤75%計(jì)為3 分，75%<陽性表達(dá)率計(jì)為4 分。組織中IL-33 表達(dá)水平為細(xì)胞染色強(qiáng)度得分×細(xì)胞染色率得分，得分>3 分為IL-33高表達(dá)，≤3 分為IL-33 低表達(dá)。兔源性IL-33 單克隆抗體、SP 免疫組化染色試劑盒及二抗（HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG）均購買于上海碧云天生物試劑有限公司（上海，中國）。

1.3.2 臨床病理資料的收集 通過住院系統(tǒng)病歷收集腦膠質(zhì)瘤患者的臨床及病理資料，具體包括性別、年齡、腫瘤部位及直徑、卡諾夫斯基（Karnofsky，KPS）功能狀態(tài)評分、組織學(xué)分級、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等數(shù)據(jù)。其中遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移定義為原發(fā)性腦腫瘤向中樞神經(jīng)系統(tǒng)外轉(zhuǎn)移，且組織活檢證實(shí)轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶的形態(tài)學(xué)特征基本一致［8］。

1.3.3 患者隨訪 所有腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后每月至少進(jìn)行影像學(xué)檢查1 次，終止隨訪日期為2022 年6 月1日或末次隨訪時間，每位患者末次隨訪日期為術(shù)后復(fù)發(fā)時間或死亡時間，若未出現(xiàn)復(fù)發(fā)或死亡，則隨訪到2022 年6 月1 日截止?；颊叱霈F(xiàn)復(fù)發(fā)或死亡定義為不良預(yù)后，其余為預(yù)后良好。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；不良預(yù)后的影響因素采用logistic 回歸分析，診斷效能采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦膠質(zhì)瘤組織中IL-33 的表達(dá) 腦膠質(zhì)瘤組IL-33 高表達(dá)107 例，低表達(dá)33 例，對照組IL-33 高表達(dá)11 例，低表達(dá)24 例，與對照組相比，腦膠質(zhì)瘤組織中IL-33 高表達(dá)率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=25.817，P<0.001）。腦膠質(zhì)瘤組織中IL-33 主要表達(dá)于胞漿中，呈棕黃色顆粒。見圖1。

圖1 腦膠質(zhì)瘤組織IL-33免疫組化染色結(jié)果（×200）

2.2 腦膠質(zhì)組織中IL-33 表達(dá)與臨床-病理特征的關(guān)系 腦膠質(zhì)瘤組織中IL-33 低表達(dá)組與高表達(dá)組在腫瘤直徑、KPS 評分、組織學(xué)分級和是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移上存在差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），在性別、平均年齡和腫瘤部位上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 腦膠質(zhì)瘤患者組織中IL-33表達(dá)水平與臨床-病理特征的關(guān)系

2.3 腦膠質(zhì)瘤患者不良預(yù)后的危險因素分析 到隨訪截止時間，腦膠質(zhì)瘤患者發(fā)生不良預(yù)后85 例，其余預(yù)后良好55 例。logistic 分析結(jié)果顯示，KPS 評分、組織學(xué)分級、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及IL-33 高表達(dá)水平是影響腦膠質(zhì)瘤患者不良預(yù)后的危險因素（P<0.001）。見表2、3。

表2 賦值表

表3 logistic回歸分析腦膠質(zhì)瘤患者發(fā)生不良預(yù)后的危險因素

2.4 腦膠質(zhì)瘤組織中IL-33 表達(dá)水平預(yù)測發(fā)生不良預(yù)后的ROC 曲線分析 以結(jié)果2.3 中腦膠質(zhì)瘤發(fā)生不良預(yù)后的85 例患者組織中IL-33 表達(dá)水平為狀態(tài)變量，以所有腦膠質(zhì)瘤患者組織中IL-33 表達(dá)水平為檢驗(yàn)變量，繪制ROC 曲線發(fā)現(xiàn)，組織中IL-33 表達(dá)水平診斷腦膠質(zhì)瘤患者發(fā)生不良預(yù)后的AUC 為 0.912（95%CI：0.837~0.915），當(dāng)截?cái)嘀禐?.56 時，診斷靈敏度和特異度分別為92.22%和91.45%。見圖2。

圖2 膠質(zhì)瘤組織中IL-33表達(dá)水平預(yù)測發(fā)生不良預(yù)后的ROC曲線分析

3 討論

因?yàn)槟X膠質(zhì)瘤的廣泛侵襲性特點(diǎn)，與周圍正常腦組織邊界不清，難以手術(shù)完全切除，故而復(fù)發(fā)率較高。有研究報(bào)道腦膠質(zhì)瘤患者5 年生存率僅為30% 左右［9］。因此，探討早期與腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后顯著相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物顯得尤其重要。

IL-33 與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，IL-33 可通過活化NF-κB 信號通路后促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞的增殖、遷徙和侵襲［10-11］，同時發(fā)現(xiàn)當(dāng)NF-κB 失活后膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 中MMP2 和MMP9 表達(dá)水平顯著降低，而MMP2 和MMP9 早已證實(shí)為腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的靶基因［12］；另一方面，IL-33 可通過其受體ST2 激活JNK 信號通路后增加腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，同時抗ST2 或沉默IL-33 后顯著增加腫瘤對替莫唑胺的藥物敏感性［13］。本研究結(jié)果顯示，IL-33 在腦膠質(zhì)瘤組織中呈高表達(dá)，且腫瘤直徑越大、KPS 評分越低、組織學(xué)分級越高及存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的腦膠質(zhì)瘤組織中IL-33 表達(dá)水平越高。崔承志等［14］對51 例膠質(zhì)瘤術(shù)后患者進(jìn)行隨訪后同樣發(fā)現(xiàn)，腫瘤直徑、組織學(xué)分級和KPS 評分均是膠質(zhì)瘤患者預(yù)后不良的危險因素。膠質(zhì)瘤瘤體直徑越大，手術(shù)切除后瘤體殘留及術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險較高［15］；另一方面，KPS 評分主要用于反映患者機(jī)體的功能狀態(tài)，KPS 得分越低，提示機(jī)體健康狀態(tài)越差。因此，筆者認(rèn)為IL-33 可能在一定程度上參與了腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展和不良預(yù)后。然而，筆者在對照組中發(fā)現(xiàn)部分病例組織中IL-33 呈現(xiàn)高表達(dá)，這可能與個體差異、組織類型等有關(guān)。

筆者對腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后進(jìn)行動態(tài)隨訪發(fā)現(xiàn)，發(fā)生不良預(yù)后共85 例，logistic 分析結(jié)果顯示，KPS 評分<80、組織學(xué)分級Ⅲ~Ⅳ級、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及IL-33 高表達(dá)是腦膠質(zhì)瘤患者不良預(yù)后的危險因素。腦膠質(zhì)瘤患者KPS 越低，預(yù)后越差，白慶嶺等［16］也證實(shí)術(shù)前KPS<70是腦膠質(zhì)瘤患者發(fā)生不良預(yù)后的獨(dú)立危險因素（P=0.022）；腦膠質(zhì)瘤級高級別（Ⅲ~Ⅳ）與低級別（Ⅰ~Ⅱ）相比，腦膠質(zhì)瘤高級別預(yù)后相對較差［17-18］。同時一項(xiàng)隨訪性研究結(jié)果顯示，高級別腦膠質(zhì)瘤患者中位總生存時間僅僅為36.00（22.85，49.16）個月，3 年和5 年生存率僅僅為40.63% 和17.19%，組織學(xué)分級Ⅲ~Ⅳ是影響腦膠質(zhì)瘤不良預(yù)后的獨(dú)立危險因素（P=0.024）［19］。腦膠質(zhì)瘤患者出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移往往提示預(yù)后不良［20-21］，此外，本研究發(fā)現(xiàn)，與未轉(zhuǎn)移的腦膠質(zhì)瘤患者相比，IL-33 在發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的腦膠質(zhì)瘤患者中表達(dá)水平升高，提示IL-33 可能參與了膠質(zhì)瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移機(jī)制，同時本研究也進(jìn)一步證實(shí)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和IL-33高表達(dá)均是影響腦膠質(zhì)瘤患者不良預(yù)后的危險因素。

對85 例不良預(yù)后和55 例預(yù)后良好的腦膠質(zhì)患者組織切片的IL-33 表達(dá)水平進(jìn)行免疫組化評分，通過ROC 曲線證實(shí)，診斷靈敏度和特異度分別為92.22%和91.45%。

綜上所述，本研究證實(shí)腦膠質(zhì)瘤組織中IL-33 顯著高表達(dá)，且IL-33 高表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后相關(guān)，然而，本研究的局限性在于樣本量較少，日后仍需要大樣本量的臨床研究證實(shí)。