胡逸群,沈文杰,陳晴晴,張愛芳

安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所,安徽合肥 230001)

為緩解農(nóng)藥過度施用與環(huán)境保護之間的矛盾,微生物來源的生防菌劑或制品有較好的開發(fā)前景。假單胞菌屬、芽孢桿菌屬和木霉屬來源的微生物,對多種植物或動物病原菌具有良好的抑菌活性,因此被廣泛用作生物防治劑[1-4]。假單胞菌屬具有代謝多樣性的特點,可產(chǎn)生多種次級代謝產(chǎn)物,如吩嗪類物質(zhì)(phenazines)、硝吡咯菌素(pyrrolnitrin)、2,4-二乙?；g苯三酚(2,4-diacetylphloroglucinol)、黃綠菌素(pyocyanin)和環(huán)脂肽(cyclic lipopeptides,CLPs)等。此外,假單胞菌屬細(xì)菌也能通過誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性的方式,抑制病原菌定殖或生長,對植物具有保護作用[5-8]。銅綠假單胞菌P.aeruginosaUPMP3菌株合成的吩嗪粗提物,可顯著減輕狹長孢靈芝引起的油棕櫚莖基底感染[9]。從蘋果花上分離的P.orientalF9菌株表現(xiàn)出對火疫病菌的良好拮抗特性[10]。此外,大多數(shù)假單胞菌屬菌株可作為植物根際促生菌,分泌生長調(diào)節(jié)劑來增強植物防御病原菌的能力。從印度青蒿根際分離的P.aeruginosa可以促進植物生長,且對植物病原菌鏈格孢、黃曲霉和尖孢鐮刀菌表現(xiàn)出很好的生防活性[11]。

惡臭假單胞P.putida與近緣物種P.fluorescens和P.brassicacearum可作為生物防治劑和植物生長促進劑[12-13]。P.putida與其他有益微生物復(fù)合施用時,顯著增加了水果營養(yǎng)元素的含量[14-15]。P.putidaB2017菌株通過產(chǎn)生鐵載體pyoverdine來抑制植物病原菌[16]。在有益于植物的同時,生防菌也需要使自己免于如活性氧爆發(fā)之類的快速且強烈的植物防御反應(yīng)所導(dǎo)致的損傷。P.putidaRRF3通過改變根部基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)來刺激植物產(chǎn)生防御反應(yīng),并通過改變根際的化合物組分來保護自身[17]。

一直以來,我國稻米主產(chǎn)區(qū)的真菌、細(xì)菌病害頻發(fā),稻瘟病菌可在水稻營養(yǎng)生長期侵染葉片導(dǎo)致葉瘟,在生殖生長期侵染稻穗導(dǎo)致穗頸瘟,嚴(yán)重降低稻米產(chǎn)量和品質(zhì)[18]。鐮孢菌Fusarium的復(fù)合侵染,如藤倉鐮孢菌F.fujikuroi、層出鐮孢菌F.proliferatum、擬輪枝鐮孢菌F.verticillioides等,會降低種子發(fā)芽率,或引起水稻惡苗病[19]。此外,黃單胞菌Xanthomonas是一類重要的植物病原細(xì)菌,可侵染400多種植物,包括稻、棉、豆等糧食作物和柑橘、香蕉和木薯等經(jīng)濟作物[20]。其中,X.oryzaepv.oryzae和X.oryzaepv.oryzicola是稻黃單胞的2個致病變種,分別引起水稻白葉枯病和細(xì)菌性條斑病,危害嚴(yán)重[21-22]。面對防病增產(chǎn)與生態(tài)保護之間日益突出的矛盾,廣譜抑菌菌株的開發(fā)利用是減少化學(xué)制劑使用、降低環(huán)境污染的有效策略。

葉際微生物的生境更為復(fù)雜多變,具備良好的環(huán)境適應(yīng)性和多種生防機制?；诖?筆者通過分離水稻葉片微生物、平板對峙篩選拮抗菌株、多基因測序和系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定得到一株具有良好抗菌活性的惡臭假單胞P.putidaAH菌株,田間試驗明確其對水稻白葉枯病和稻瘟病具有防治效果。利用第二代Illumina與第三代PacBio結(jié)合的方法進行全基因組測序,并對測序數(shù)據(jù)進行基因組組裝、基因預(yù)測與功能注釋、次級代謝產(chǎn)物合成基因簇分析,為AH菌株的基因功能研究提供分子遺傳信息。惡臭假單胞P.putidaAH菌株的研究可為水稻病害防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和培養(yǎng)條件稻瘟病菌Magnaportheoryzae、紋枯病菌Rhizoctoniasolani、莖點霉菌Phomasp.、水稻白葉枯病菌Xanthomonasoryzaepv.oryzae、尖孢鐮孢菌Fusariumoxysporum、層出鐮孢菌F.proliferum、短小桿菌Curtobacteriumsp.,均保存于筆者所在實驗室。細(xì)菌培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基,白葉枯病菌培養(yǎng)用NA培養(yǎng)基,培養(yǎng)條件為28 ℃,保存介質(zhì)為50%甘油。真菌培養(yǎng)用PDA培養(yǎng)基,培養(yǎng)條件為28 ℃,無菌濾紙對菌絲塊進行低溫保存。

1.2 稻瘟拮抗細(xì)菌的分離和篩選為從水稻葉際分離稻瘟病菌的拮抗細(xì)菌,用無菌剪刀將水稻葉片組織切成小塊,在無菌水中浸泡30 min,6 000 r/min 離心3 min獲得上清液。將懸浮液進行梯度稀釋(10-2、10-3、10-4、10-5),取不同濃度的稀釋液50 μL涂布于3個LB板上,平板于28 ℃培養(yǎng)2 d。挑取形態(tài)差異的單菌落進一步純化保存,用于拮抗菌的篩選。稻瘟病菌孢子液稀釋至2×107個/mL,涂布PDA平板后,28 ℃培養(yǎng)3 d。取2 μL上述細(xì)菌菌液滴于上述平板,28 ℃培養(yǎng)3 d,周圍有抑菌圈的細(xì)菌即為目的菌,純化并保存。

1.3 拮抗細(xì)菌的形態(tài)觀察取20 μL新鮮菌懸液滴到碳膜銅網(wǎng),靜置5 min后用濾紙吸去多余液體。將2%磷鎢酸滴在碳膜銅網(wǎng),靜置染色2 min后用濾紙吸去多余液體,室溫干燥。在透射電子顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài),采集圖像分析。

1.4 細(xì)菌分類鑒定利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。使用細(xì)菌通用引物[23]擴增16S rDNA基因(27F,5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′;1492R,5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。使用特異性引物擴增gyrB序列(F,5′-GAGCAGACCTACGTCCACGGTGTG-3′;R,5′-GTCGATCATCTTGCCAACGACCGC-3′)。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過純化后送生工生物技術(shù)公司進行測序。測序結(jié)果與BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中核酸數(shù)據(jù)進行比對,選擇同源性較高的近緣物種序列,利用MEGAX軟件使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 平板對峙試驗5種植物病原菌(M.oryzae,R.solani,F.oxysporum,F.proliferatum,X.oryzaepv.oryzae)和2種附生菌(Phomasp.,Curtobacteriumsp.)作為拮抗測試的靶標(biāo)菌。將上述分離得到的拮抗細(xì)菌在液體LB中培養(yǎng)至生長對數(shù)期(OD600 nm=1.0),用于平板對峙試驗。拮抗真菌試驗:將新鮮菌絲塊放置在PDA平板中央,將2 μL拮抗細(xì)菌菌懸液滴在平板邊緣。平板于28 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～7 d,拍照并記錄數(shù)據(jù)。拮抗細(xì)菌試驗:將靶標(biāo)菌的菌懸液(OD600 nm=1.0)稀釋100倍,涂布于LB平板,28 °C培養(yǎng)1 d后再將2 μL拮抗細(xì)菌的菌懸液滴在上述平板邊緣。平板放置在28 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d,拍照并記錄數(shù)據(jù)。

1.6 田間防治試驗秈稻常規(guī)稻品種WH26作為參試材料,評價拮抗細(xì)菌對水稻3種病害(稻瘟病、水稻白葉枯病、細(xì)菌性條斑病)的田間防治效果。1月齡的水稻苗用于接種病原菌。病原菌接種前1和3 d,分別用拮抗菌的菌懸液(OD600 nm=0.5)均勻噴施水稻幼苗,以葉片布滿微液滴為限。水稻白葉枯病菌接種:用無菌剪刀沾取X.oryzaepv.oryzae的菌懸液(OD600 nm=0.5),在距離葉尖邊緣約2 cm處剪下葉片。選取10株水稻,每株取3片葉片進行接種處理。接種14 d后進行病斑長度測量。水稻細(xì)菌性條斑病菌接種:用無針頭的1 mL注射器將X.oryzaepv.oryzicola菌懸液(OD600 nm=0.5)注入水稻葉片的細(xì)胞間隙,注意避免對植物造成另外的機械損傷。選取10株水稻,每株取3片葉片進行接種處理。接種7 d后進行病斑長度測量。稻瘟病菌接種:將M.oryzae孢子懸液濃度調(diào)整為2×105個/mL,均勻噴施于水稻葉片,以葉片布滿微液滴為限,接種7 d后觀察統(tǒng)計發(fā)病情況。

1.7 抗生素敏感性試驗采用平板加藥法測試拮抗細(xì)菌對慶大霉素(Gm)、卡那霉素(Kn)、氨芐霉素(Amp)和利福平(Rif)的敏感性。固體LB培養(yǎng)基中分別加入上述抗生素,配制終濃度分別為20.0、10.0、5.0、2.5 μg/mL的抗生素平板。將拮抗菌的菌懸液(OD600 nm=1.0)稀釋100倍,均勻涂布于上述平板,28 ℃培養(yǎng)1 d,拍照并計數(shù)菌落。

1.8 細(xì)菌全基因組測序第二代Illumina與第三代PacBio結(jié)合的測序方法進行全基因組測序。離心收集新鮮的AH菌體,試劑盒法提取基因組DNA(Genomic DNA Isolation Kit,TaKaRa)。使用G-tubes(Covaris)剪切基因組DNA,EXO VII處理DNA并進行DNA末端修復(fù),制備SMRTbell DNA文庫?；蚪M的從頭組裝基于三代數(shù)據(jù),使用falcon進行原始數(shù)據(jù)的自我矯正及基因組初步組裝,得到一致性序列。使用GenomicConsensus軟件對原始數(shù)據(jù)再次矯正,使用sprai對一致性序列進行環(huán)化處理,得到環(huán)化的細(xì)菌基因組[24],Circos軟件構(gòu)建基因組圈圖[25]。使用Prodigal軟件預(yù)測編碼基因[26],Rfam預(yù)測非編碼RNA[27]。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防細(xì)菌的分離通過稻瘟孢子液平板的篩選方法,分離得到5株具有抑菌作用的細(xì)菌菌株,其中抑菌作用最顯著的一株命名為AH,對其進行后續(xù)研究。在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d后,AH菌落形態(tài)為黃白色,表面粗糙,邊緣凹陷(圖1A、B)。在LB培養(yǎng)基上,AH菌落形態(tài)與PDA培養(yǎng)基相似,菌體更為致密(圖1C、D)。透射電鏡觀察到AH呈短桿菌(圖1E、F)。

注:使用平板劃線法(A,C)和菌液懸滴法(B,D),分別在PDA培養(yǎng)基(A,B)和LB培養(yǎng)基(C,D)培養(yǎng)菌株AH。透射電鏡觀察菌體形態(tài)(E:5.0 μm;F:500 nm)。Note: Strain AH was cultured on PDA medium (A,B) and LB medium (C,D) by streak plate method (A,C) and dropping plate of liquid bacterial culture (B,D),respectively.P.putida AH strain was observed by transmission electron microscope (TEM),which was treated with 2% phosphotungstic acid on the copper grid to stain for 2 min on 5.0 μm (E) and 500 nm (F) scale.圖1 菌株AH的形態(tài)學(xué)特征Fig.1 The morphological features of strain AH

2.2 生防細(xì)菌的鑒定AH的16S rDNA基因序列長度為1 405 bp,BLAST比對結(jié)果顯示該序列與P.putida、P.wayambapalatensis、P.muyukensis、P.monteilii、P.plecoglossicida、P.shirazica和P.asiatica等菌株高度相似,相似度均高于99.87%,需進一步確定種屬。利用特異性引物擴增得到gyrB基因序列,長度為708 bp,BLAST比對結(jié)果顯示該序列與P.putidaNX-1、P.putidaPC2同源性為97.74%,與P.wayambapalatensisRW3S1相似度為96.15%,與P.muyukensisCOW39相似度為93.04%,與P.monteilii各菌株相似度均為92%。利用MEGAX軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,表明AH屬于惡臭假單胞菌P.putida(圖2)。

圖2 菌株AH基于gyrB基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the nucleotide sequences of the complete gyrB gene

2.3 菌株AH的生防潛力菌株AH對參試的7種菌株均表現(xiàn)拮抗活性,其中對稻瘟病菌、水稻白葉枯病菌、短小桿菌和莖點霉抑制作用顯著,抑菌圈直徑均大于1.3 cm(圖3A、B、F、G,圖4)。對于水稻紋枯病菌、尖孢鐮孢菌和層出鐮孢菌的抑菌圈直徑小于1.0 cm(圖3C、D、E,圖4)。

注:平板拮抗測試AH對稻瘟病菌(A)、莖點霉(B)、紋枯病菌(C)、尖孢鐮孢菌(D)、層出鐮孢菌(E)、短小桿菌(F)、水稻白葉枯病菌(G)的抑菌活性。H.平板模式圖。Note: Tested pathogens included Magnaporthe oryzae (A),Phoma sp.(B),Rhizoctonia solani (C),Fusarium oxysporum (D),F.proliferatum (E),Curtobacterium sp.(F),and Xanthomonas oryzae pv.oryzae (G).Experimental model diagram(H).圖3 菌株AH對參試菌株的平板拮抗測試Fig.3 Antagonistic efficacy of P.putida AH against tested strains

圖4 菌株AH的平板抑菌效果Fig.4 Antagonistic efficacy of P.putida AH against tested strains

田間防治試驗中,水稻葉片噴施AH菌懸液不影響水稻生長(圖5A)。僅接種稻瘟孢子液時,葉片出現(xiàn)急性型病斑、慢性型病斑、褐點和白點型病斑的混合癥狀(圖5B、C);接種前用AH菌懸液處理后癥狀顯著減輕。水稻白葉枯病菌接種后,葉片呈現(xiàn)黃白色皺縮癥狀,沿葉脈擴展。AH噴施后癥狀顯著減輕。且AH處理組的葉片皺縮現(xiàn)象比白葉枯病菌接種組的癥狀延遲3 d出現(xiàn)。水稻細(xì)菌性條斑病菌接種后,接種部位葉片出現(xiàn)黃褐色的短病斑,AH菌液處理對病害進程無明顯影響(圖5)。說明田間噴施菌株AH懸液可有效減輕水稻白葉枯病和稻瘟病的病害等級。

注:稻瘟病菌(上),水稻細(xì)菌性條斑病菌(中)和白葉枯病菌(下)在感病水稻品種WH26上的發(fā)病情況。Note:The severities of rice blast (upper),bacterial leaf streak (middle),and bacterial blight (lower) in the susceptible rice variety WH26 were exhibited.圖5 菌株AH對水稻病害的防治效果Fig.5 The biocontrol effect against three major pathogens on rice plants

2.4 菌株AH基因組分析采用二代Illumina與第三代PacBio結(jié)合的測序技術(shù)對菌株AH進行全基因組測序,獲得高質(zhì)量Reads 102 114條,數(shù)據(jù)量1.27 G。AH基因組長為5 889 125 bp,GC含量為63.74%,包含5 215個編碼序列,其中包括19個rRNA、77個tRNA和78個nRNA?；贕C偏差、GC含量、非編碼RNA(rRNA為紅色表示,tRNA為藍(lán)色表示,sRNA為綠色表示)和COG注釋等信息,使用Circos軟件構(gòu)建的基因組圈圖見圖6。全基因組測序數(shù)據(jù)已提交至GenBank,收錄號為SAMN34209943。利用NR數(shù)據(jù)庫進行蛋白質(zhì)序列相似性比對顯示,共有5 183個基因被注釋,占基因總數(shù)的99.4%;在KEGG數(shù)據(jù)庫中比對得到5 150個基因,占比98.8%;在COG、Swiss-Prot和GO數(shù)據(jù)庫中分別比對得到4 164、3 858、3 715個基因,占比分別為79.8%、74.0%和71.2%。

注:Circos(v0.69)軟件繪制菌株AH的基因組圈圖,從內(nèi)到外分別代表GC 偏移、GC含量、非編碼RNA(紅色是rRNA,藍(lán)色是tRNA,綠色是sRNA)、前導(dǎo)鏈的COG注釋和后隨鏈的COG注釋。Note:The map was drawn using Circos (v0.69).From the center to the periphery,different components represent GC skew,GC content,non-coding RNA (rRNA,red;tRNA,blue;sRNA,green),COG annotation of the leading strand,and COG annotation of the lagging strand.圖6 菌株AH的基因組圈圖Fig.6 Graphical circular map of the genome of P.putida AH

對菌株AH基因組數(shù)據(jù)進行KEGG和GO數(shù)據(jù)庫分析,結(jié)果見圖7。KEGG注釋結(jié)果表明,菌株AH基因組中有2 810 個編碼蛋白的基因富集到六大類42條代謝通路中。其中,代謝功能相關(guān)的基因占比最大,其中氨基酸代謝、碳水化合物代謝、輔酶因子和維生素代謝、能量代謝相關(guān)通路的數(shù)量較高。表明菌株AH具有代謝多樣性的特征。GO數(shù)據(jù)庫按照生物過程、細(xì)胞組分和分子功能三類對菌株AH基因功能進行分類,其中細(xì)胞組分中膜組分相關(guān)基因、分子功能中的ATP結(jié)合和金屬離子結(jié)合相關(guān)基因占比較大。

注:A.KEGG注釋結(jié)果;B.GO注釋結(jié)果。Note:A.KEGG annotation results;B.GO annotation results.圖7 菌株AH的基因功能分析Fig.7 Gene functions in the P.putida AH genome

2.5 次生代謝產(chǎn)物合成基因簇的預(yù)測使用antiSMASH在線平臺對菌株AH基因組中次級代謝產(chǎn)物合成基因簇進行預(yù)測,分析表明該基因組包含8個次級代謝產(chǎn)物基因簇,其中5個是非核糖體肽合成酶(NRPS)基因簇或NRPS-like基因簇(圖8、表2)。根據(jù)基因簇同源性,AH可能合成2類已知的抗菌物質(zhì)viscosin和putisolvin。分析發(fā)現(xiàn),Cluster1與BGC0001100來源的Streptomycesrochei的合成基因簇相似性為13%;Cluster2和Cluster5都與BGC0000413來源的PseudomonasprotegensPf-5的pyoverdin合成基因簇相似,相似度分別為10%和4%;Cluster3與BGC0001312來源的PseudomonasfluorescensSBW25的viscosin合成基因簇相似度為50%。Cluster4與Pseudomonasputida的putisolvin合成基因簇相似性為50%;Cluster5與BGC0000413來源的PseudomonasprotegensPf-5的pyoverdin合成基因簇相似性為4%;Cluster8與BGC0001692來源的XenorhabdusnematophilaATCC 19061的nematophin合成基因簇相似性為12%。另外Cluster6和Cluster7未比對到相似基因簇,暗示菌株AH中可能存在新物質(zhì)合成基因簇,具有研究和應(yīng)用潛力。

表2 菌株AH的8個次級代謝產(chǎn)物合成基因簇信息

注:AntiSMASH在線平臺預(yù)測菌株AH的次級代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因簇,8個基因簇的信息如圖。不同顏色代表不同類型的基因。Note:Secondary metabolite associated gene clusters were predicted by antiSMASH online platform.Eight gene clusters were respectively concatenated on P.putida AH genome according to the order and length.Different colors represent different types of genes as shown.圖8 菌株AH的8個次級代謝產(chǎn)物合成基因簇Fig.8 Secondary metabolism gene clusters in P.putida AH

2.6 菌株AH對氨基糖苷類抗生素高度敏感采用平板加藥法對菌株AH的抗生素敏感性進行測定發(fā)現(xiàn),外源卡那霉素或慶大霉素濃度為2.5 μg/mL的條件下,菌株AH生長出現(xiàn)明顯抑制現(xiàn)象;利福平濃度為10 μg/mL時,AH生長被抑制,20 μg/mL時抑制作用明顯;在所有測試濃度下,氨芐霉素均未對AH生長產(chǎn)生影響(圖9)。這表明AH菌株對氨基糖苷類抗生素(慶大霉素和卡那霉素)高度敏感,且抑菌作用存在劑量依賴性。

圖9 菌株AH的抗生素敏感性測試Fig.9 Antibiotic susceptibility of P.putida AH

3 結(jié)論與討論

該研究通過平板抑菌測試,篩選得到5株具有生防效果的菌株,其中菌株AH效果最好,經(jīng)多基因測序比對,鑒定為惡臭假單胞P.putidaAH。進一步測試發(fā)現(xiàn)AH對植物病原細(xì)菌水稻白葉枯菌和病原真菌稻瘟病菌、紋枯病菌都有較好的抑菌活性,其抑菌譜具有一定的廣譜性,具有研究價值。

在線平臺antiSMASH預(yù)測發(fā)現(xiàn)P.putidaAH中有8個次級代謝產(chǎn)物合成基因簇,可能合成viscosin、putisolvin等抗菌物質(zhì)。putisolvin對多種病原菌具有拮抗活性,一般通過破壞細(xì)胞膜和抑制DNA合成的機制發(fā)揮抗菌作用,也能作為生物表面活性劑影響細(xì)菌群體感應(yīng)與生物膜形成[28]。但AH菌株的合成基因簇與已知基因簇比對的相似度來看,均未超過50%,僅有Cluster3與P.fluorescensSBW25的viscosin合成基因簇相似度為50%,Cluster4與P.putida的putisolvin合成基因簇相似性為50%。Cluster6和Cluster7未比對到相似基因簇,另外的Cluster1、2、5、8基因簇與已知菌株基因簇的相似度為13%、10%、4%、12%。此外,經(jīng)過比對發(fā)現(xiàn)胺甲萘降解菌株P(guān).putidaSimmons01、P.putidaNBRC14164菌株有6個次級代謝產(chǎn)物合成基因簇,耐低碳氧菌株P(guān).putidaKT2440有7個合成基因簇[29]。這些結(jié)果暗示菌株AH的8個基因簇除合成上述已知物質(zhì),還可能合成其余未報道的物質(zhì),具有代謝多樣性的特征,有較好的研究和應(yīng)用潛力。

菌株AH的抗生素敏感性測試結(jié)果表明其對氨芐霉素的耐藥性很強,而分析AH菌株的基因組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),其中并不含有編碼氨芐霉素抗性的基因,但鑒定得到多個resistance-nodulation against tested strainscell division(RND)類型的抗生素外排泵基因,這表明菌株AH可能是通過外排泵系統(tǒng)來阻止氨芐霉素的外源施加對細(xì)菌造成的損傷。除RND類外排泵外,AH基因組中還鑒定到small multidrug resistance(SMR)類的外排泵,靶向氨基糖苷類抗生素。而抗生素敏感性測試表明菌株AH對氨基糖苷類抗生素高度敏感,推測可能是由于相關(guān)基因表達(dá)水平較低或發(fā)生沉默而無法發(fā)揮蛋白正常功能,導(dǎo)致菌株AH不足以防御氨基糖苷類抗生素。菌株AH的全基因組數(shù)據(jù)為后續(xù)分子操縱提供了遺傳信息,也為深層的防病機制解析提供了基礎(chǔ)。