陳青，郭廣秀，王建

贛州市人民醫(yī)院病理科，江西 贛州 341000

彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤中最常見的亞型，在生物學(xué)、遺傳學(xué)、形態(tài)學(xué)等方面均具有高度異質(zhì)性[1-2]。臨床多采用利妥昔單抗聯(lián)合環(huán)磷酰胺+多柔比星+長(zhǎng)春新堿+潑尼松（CHOP）方案治療彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤，60%～70%的患者可治愈，但仍有部分患者對(duì)治療的反應(yīng)較差，且易復(fù)發(fā)或進(jìn)展[3-4]。研究表明，彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)病與體內(nèi)微小RNA（microRNA，miRNA）的表達(dá)密切相關(guān)，miRNA-181a 可抑制細(xì)胞分化過程中關(guān)鍵基因的表達(dá)，從而抑制B 淋巴細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，可能參與彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展[5-6]。胱天蛋白酶富集域家族成員11（caspase recruitment domain family member 11，CARD11）可介導(dǎo)獲得性免疫反應(yīng)，增強(qiáng)核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的表達(dá)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，對(duì)彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展具有一定的促進(jìn)作用[7-8]。有關(guān)研究已證實(shí)CARD11 在彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤淋巴結(jié)組織中表達(dá)，且是患者遠(yuǎn)期生存的獨(dú)立影響因素[9]。明確miRNA-181a、CARD11 與彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤病情進(jìn)展的關(guān)系對(duì)及時(shí)采取針對(duì)性干預(yù)治療至關(guān)重要，基于此，本研究探討miRNA-181a、CARD11、NF-κB在彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者中的表達(dá)及臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014 年7 月至2020 年6 月于贛州市人民醫(yī)院就診的彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)影像學(xué)和病理學(xué)檢查首次確診為彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤；②可耐受利妥昔單抗聯(lián)合CHOP 治療方案，一線治療至少接受6 個(gè)周期的標(biāo)準(zhǔn)治療方案；③年齡為25～73 歲；④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①惰性淋巴瘤轉(zhuǎn)化為彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤；②合并其他惡性腫瘤；③合并嚴(yán)重肝、腎功能異常。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究納入85 例彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者作為觀察組，男48 例，女37 例；年齡25～73 歲，平均（64.56±8.01）歲。另選取同期贛州市人民醫(yī)院收治的60 例增生性淋巴結(jié)炎患者作為對(duì)照組，男35 例，女25 例；年齡28～69 歲，平均（65.03±7.86）歲。兩組患者的性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過，所有患者均知情同意。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RTPCR）檢測(cè)miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA 相對(duì)表達(dá)量

采集兩組患者治療前的淋巴結(jié)組織，切開并應(yīng)用10%福爾馬林固定，常規(guī)脫水及切片，應(yīng)用總RNA提取試劑提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA），應(yīng)用PCR 儀進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 條件：95 ℃5min，95 ℃10 s，60 ℃20 s，共50 個(gè)循環(huán)；95 ℃10 s，60 ℃10 s，40 ℃30 s。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde- 3- phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法檢測(cè)miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA相對(duì)表達(dá)量。GAPDH上游引物5'-CGCTGAGTACGTCGTGGAGT-3'，下游引物5'-GTCGCTGTTGAAGTCAGAGGAG-3'；miRNA-181a 上游引物5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACTCAC3'，下游引物5'- ACACTCCAGCTTCACCATTCAACGCTGTCG-3'；CARD11上游引物5'-CAGAGGAGCTGCGAGACAA-3'，下游引物5'-GGTGCTTGTACATTTCACAGTCC-3'；NF-κB上游引物5'-GGCGTGTATAAGGGGCTATAA-3'，下游引物5'-TTTTCCCGATCTCCCAGCTC-3'。

1.3 資料收集

收集彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者的臨床資料，包括性別、年齡、淋巴瘤結(jié)外累及數(shù)目、臨床分期、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平、國際預(yù)后指數(shù)（international prognostic index，IPI）評(píng)分[10]。臨床分期按照Ann Arbor-Cotswolds 分期標(biāo)準(zhǔn)[11]進(jìn)行評(píng)估。

1.4 療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（response evaluation criteria in solid tumor，RECIST）[12]評(píng)價(jià)兩組患者的臨床療效。完全緩解（complete response，CR）：腫瘤病灶完全消失，至少持續(xù)1 個(gè)月；部分緩解（partial response，PR）：腫瘤病灶長(zhǎng)徑總和與基線相比減少≥30%，至少持續(xù)1 個(gè)月；疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）：腫瘤病灶長(zhǎng)徑總和與基線相比減少＜30%或增加＜20%；疾病進(jìn)展（progressive disease，PD）：腫瘤病灶長(zhǎng)徑總和與基線相比增加≥20%或出現(xiàn)新病灶。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，3 組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線及曲線下面積（area under the curve，AUC）分析miRNA-181a、CARD11、NF-κB單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者臨床分期的診斷價(jià)值及對(duì)療效的預(yù)測(cè)價(jià)值；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同臨床特征彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA 相對(duì)表達(dá)量的比較

不同性別、年齡、血清LDH 水平、結(jié)外累及數(shù)目彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者miRNA-181a 相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Ann Arbor 分期為Ⅲ～Ⅳ期、IPI 評(píng)分為3～5 分彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者miRNA-181a 相對(duì)表達(dá)量分別明顯高于Ann Arbor 分期為Ⅰ～Ⅱ期、IPI 評(píng)分為0～2分的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.644、3.343，P＜0.01）。不同性別、年齡、血清LDH 水平彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者CARD11mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；結(jié)外累及數(shù)目＞1 個(gè)、Ann Arbor 分期為Ⅲ～Ⅳ期、IPI 評(píng)分為3～5 分彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者CARD11mRNA相對(duì)表達(dá)量分別明顯高于結(jié)外累及數(shù)目≤1 個(gè)、Ann Arbor 分期為Ⅰ～Ⅱ期、IPI 評(píng)分為0～2 分的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.064、8.461、7.537，P＜0.01）。不同性別、年齡、血清LDH 水平彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者NF-κBmRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；結(jié)外累及數(shù)目＞1 個(gè)、Ann Arbor 分期為Ⅲ～Ⅳ期、IPI 評(píng)分為3～5 分彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者NF-κBmRNA 相對(duì)表達(dá)量分別明顯高于結(jié)外累及數(shù)目≤1 個(gè)、Ann Arbor 分期為Ⅰ～Ⅱ期、IPI 評(píng)分為0～2 分的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.057、11.967、2.394，P＜0.01）。（表1）

表1 不同臨床特征彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA 相對(duì)表達(dá)量的比較

2.2 觀察組和對(duì)照組患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA 相對(duì)表達(dá)量的比較

Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，Ⅲ～Ⅳ期彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA相對(duì)表達(dá)量均高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表2 觀察組和對(duì)照組患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA 相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

表2 觀察組和對(duì)照組患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA 相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

注：a與對(duì)照組比較，P＜0.05；b與Ⅰ～Ⅱ期比較，P＜0.05

組別觀察組Ⅰ～Ⅱ期（n=41）Ⅲ～Ⅳ期（n=44）對(duì)照組（n=60）F值P值miRNA-181a CARD11 mRNA NF-κB mRNA 1.21±0.24a 1.62±0.32ab 0.56±0.11 284.308＜0.01 0.92±0.13a 1.21±0.18ab 0.48±0.07 422.493＜0.01 1.25±0.21a 1.86±0.26ab 0.66±0.11 484.608＜0.01

2.3 不同療效彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA 相對(duì)表達(dá)量的比較

療效為CR/PR/SD 彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 相對(duì)表達(dá)量均低于療效為PD 的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表3）

表3 不同療效彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

表3 不同療效彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

療效CR/PR/SD（n=65）PD（n=20）t值P值miRNA-181a 1.34±0.21 1.68±0.26 5.978＜0.01 CARD11 mRNA 1.04±0.19 1.17±0.20 2.643＜0.05 NF-κB mRNA 1.49±0.28 1.84±0.26 4.967＜0.01

2.4 miRNA-181a、CARD11、NF-κB 單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者臨床分期的診斷價(jià)值

ROC 曲線顯示，miRNA-181a、CARD11、NF-κB聯(lián)合檢測(cè)診斷彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者臨床分期的AUC為0.968，高于miRNA-181a、CARD11、NF-κB單獨(dú)檢測(cè)的0.852、0.841、0.830。（表4、圖1）

圖1 miRNA-181a、CARD11、NF-κB單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)診斷彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者臨床分期的ROC曲線

表4 miRNA-181a、CARD11、NF-κB 單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者臨床分期的診斷價(jià)值

2.5 miRNA-181a、CARD11、NF-κB 單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者療效的預(yù)測(cè)價(jià)值

ROC 曲線顯示，miRNA-181a、CARD11、NF-κB聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者療效的AUC 為0.953，高于miRNA-181a、CARD11、NF-κB單獨(dú)檢測(cè)的0.847、0.684、0.816。（表5、圖2）

圖2 miRNA-181a、CARD11、NF-κB單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者療效的ROC曲線

表5 miRNA-181a、CARD11、NF-κB 單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者療效的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討論

彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤的異質(zhì)性較強(qiáng)，標(biāo)準(zhǔn)治療具有較好的治療效果，然而其治療方式單一，仍有許多患者治療失敗，導(dǎo)致預(yù)后較差，隨著病情進(jìn)展可累及組織或器官，導(dǎo)致腫瘤浸潤(rùn)、腫塊壓迫及出血等[13-14]。臨床上常采用IPI 評(píng)分評(píng)估彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤病情危險(xiǎn)程度，然而其評(píng)估價(jià)值具有一定的局限性[15]。因此，預(yù)測(cè)腫瘤的發(fā)展情況并及時(shí)給予相應(yīng)的治療，對(duì)于提高患者生存率具有重要意義。既往研究顯示，miRNA 可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、凋亡等過程參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，miRNA-181a 是T 淋巴細(xì)胞的敏感性和選擇性調(diào)節(jié)器[16]。CARD11 與腫瘤進(jìn)展和細(xì)胞侵襲密切相關(guān)，主要通過NF-κB 影響細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等[17-18]，但關(guān)于二者與彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤病情進(jìn)展的關(guān)系尚未見報(bào)道。

本研究比較對(duì)照組與觀察組患者的miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期觀察組患者的miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，且Ⅲ～Ⅳ期、IPI 評(píng)分為3～5 分彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者的miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 相對(duì)表達(dá)量均高于Ⅰ～Ⅱ期、IPI 評(píng)分為0～2 分的患者。表明miRNA-181a、CARD11、NF-κB參與彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展，且隨著病情進(jìn)展，其表達(dá)水平升高。這可能是因?yàn)?，miRNA-181a 可通過調(diào)控下游靶基因的表達(dá)參與彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展，還可通過抑制CARD11 的表達(dá)抑制腫瘤生長(zhǎng)。CARD11 是一種支架蛋白，可介導(dǎo)獲得性免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架之間的相互作用。高表達(dá)的CARD11 可激活NF-κB 上游信號(hào)分子，導(dǎo)致NF-κB表達(dá)升高，抑制T 細(xì)胞增殖，從而誘導(dǎo)其凋亡。

本研究比較不同臨床分期彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者的miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，Ⅲ～Ⅳ期彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 相對(duì)表達(dá)量均高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明miRNA-181a、CARD11、NF-κB表達(dá)水平與彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者病情進(jìn)展有關(guān)，病情越嚴(yán)重，其表達(dá)水平越高。分析原因如下：miRNA-181a 在組織分化、細(xì)胞增殖和凋亡過程中扮演了重要角色，可通過調(diào)控多種抑癌基因和原癌基因的表達(dá)對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程進(jìn)行調(diào)控[19]。CARD11 在T 和B 細(xì)胞誘導(dǎo)的NF-κB 活化過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，可增強(qiáng)組成型NF-κB 的活性，促進(jìn)NF-κB 活性相關(guān)抗原受體表達(dá)，從而參與彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)展過程[20]。NF-κB 是一種從B 細(xì)胞的細(xì)胞核中提取出來的可與免疫球蛋白κ鏈基因特異性結(jié)合的核蛋白因子，家族中每個(gè)成員N 末端均含有兩種類似免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)域[21-22]；NF-κB 廣泛存在于各種類型的細(xì)胞中，當(dāng)機(jī)體受到疾病侵襲時(shí)，被激活的NF-κB 參與多種細(xì)胞因子（如黏附因子、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子等）對(duì)刺激的反應(yīng)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，還可促進(jìn)腫瘤新生血管生成及耐藥，當(dāng)彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者疾病進(jìn)展時(shí)，其表達(dá)水平隨之升高，與相關(guān)研究報(bào)道的結(jié)果一致[23-24]。本研究結(jié)果還顯示，療效為CR/PR/SD彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 相對(duì)表達(dá)量均低于療效為PD 的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示通過監(jiān)測(cè)彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者的miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 水平可對(duì)治療效果進(jìn)行判斷，miRNA-181a、CARD11、NF-κB高表達(dá)可能反映患者預(yù)后較差。本研究采用ROC 曲線評(píng)估m(xù)iRNA-181a、CARD11、NF-κB單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者臨床分期的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示，miRNA-181a、CARD11、NF-κB聯(lián)合檢測(cè)診斷彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者臨床分期的AUC 為0.968，高于miRNA-181a、CARD11、NF-κB單獨(dú)檢測(cè)的0.852、0.841、0.830。采用ROC 曲線評(píng)估m(xù)iRNA-181a、CARD11、NF-κB單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值，結(jié)果顯示，miRNA-181a、CARD11、NF-κB聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者療效的AUC 為0.953，高于miRNA-181a、CARD11、NF-κB單獨(dú)檢測(cè)的0.847、0.684、0.816。表明miRNA-181a、CARD11、NF-κB聯(lián)合檢測(cè)對(duì)彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤的診斷價(jià)值較高，對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值較高。

綜上所述，miRNA-181a、CARD11、NF-κB可作為彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤患者病情監(jiān)測(cè)和預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)，其表達(dá)水平升高提示患者病情可能加重，三者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤的診斷價(jià)值較高，且對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值較高。