宋 琳，白秀秀，李 輝

（1. 陜西省藥品和疫苗檢查中心咸陽(yáng)分中心，陜西咸陽(yáng) 712000； 2. 西安漢豐藥業(yè)有限責(zé)任公司，陜西西安710050； 3. 陜西盛德泰林生物安全技術(shù)檢測(cè)有限公司，陜西西安 710077）

微生物污染是中藥飲片質(zhì)量安全的不確定性風(fēng)險(xiǎn)，部分飲片因無須再做進(jìn)一步的煎煮處理即使用［1］，需特別關(guān)注其用藥安全。2015 年版《中國(guó)藥典》首次在直接口服和泡服類飲片的質(zhì)量控制指標(biāo)中納入耐膽鹽革蘭陰性菌和沙門菌，2020 年版《中國(guó)藥典》增加了需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)和大腸埃希菌指標(biāo)［2］，進(jìn)一步加強(qiáng)了對(duì)2種飲片的微生物限度要求。耐膽鹽革蘭陰性菌指標(biāo)泛指能在規(guī)定培養(yǎng)條件下在結(jié)晶紫中性紅膽鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的微生物，包括腸桿菌屬、產(chǎn)氣單胞菌屬、假單胞菌屬等［3］，是反映中藥飲片衛(wèi)生狀況的重要指標(biāo)，該指標(biāo)兼具描述污染種類和數(shù)量的特點(diǎn)，是進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的理想指標(biāo)。據(jù)報(bào)道，中藥飲片主要污染微生物情況復(fù)雜且分布不均勻，但總體細(xì)菌污染率較高，其中耐膽鹽革蘭陰性菌污染問題較突出［1，4-8］。從數(shù)量上看，污染的耐膽鹽革蘭陰性菌平均對(duì)數(shù)值為2～3［4］，從種類上看，主要是革蘭陰性菌。甘永琦等［5］結(jié)合基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）和高通量測(cè)序技術(shù)分析了通草等9 個(gè)中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌污染情況，發(fā)現(xiàn)耐膽鹽革蘭陰性菌分布不均，主要是腸桿菌屬、泛菌屬及其他屬微生物。本研究中利用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工具量化中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)考慮污染種類、數(shù)量等因素，為中藥飲片的微生物風(fēng)險(xiǎn)管理提供新思路。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 中藥飲片數(shù)據(jù)收集

以“中藥飲片”“飲片”“中藥材”和“微生物”“耐膽鹽革蘭陰性菌”等為關(guān)鍵詞，檢索中國(guó)知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)2012年1 月1 日至2021 年12 月31 日發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)，最終納入文獻(xiàn)15 篇。篩選和整理文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，剔除信息不完整、表述模糊的數(shù)據(jù)，對(duì)直接以測(cè)定數(shù)值報(bào)道的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換。為便于統(tǒng)計(jì)，以N表示耐膽鹽革蘭陰性菌的可能菌數(shù)，N＜10 cfu/ g 時(shí)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后均以0.5 計(jì)；N＞104cfu/g 且無具體測(cè)定值時(shí)以4.5 計(jì)；當(dāng)未以N描述時(shí)，按N＞103cfu/g和N＞104cfu/g統(tǒng)計(jì)飲片所占比例；對(duì)于可計(jì)算耐膽鹽革蘭陰性菌平均值的，轉(zhuǎn)化為平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2 量化風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型建立

多種風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工具可用于量化風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，根據(jù)人用藥品注冊(cè)技術(shù)國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議（ICH）Q9風(fēng)險(xiǎn)管理的基本原則對(duì)中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌的安全風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行識(shí)別、分析和評(píng)價(jià)，建立失效模式和效應(yīng)分析模型（FMEA）識(shí)別失效模式。FMEA 主要考慮3 個(gè)方面的因素，耐膽鹽革蘭陰性菌的可檢測(cè)性（DET）、檢出頻率（即發(fā)生的可能性，OCC），以及類群特征和是否為直接口服和泡服類飲片確定危害嚴(yán)重性（SEV），以評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)。按以上規(guī)則形成中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型，詳見表1。

表1 基于FMEA的中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型Tab.1 Risk assessment model for bile salt-resistant Gram-negative bacteria in TCM decoction pieces based on FMEA

1.3 風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)判定標(biāo)準(zhǔn)

以風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)（RPN）定量描述風(fēng)險(xiǎn)大小，RPN =SEV ×OCC×DET。每個(gè)因素根據(jù)程度不同分為3 個(gè)等級(jí)分別賦值。通過評(píng)估3 個(gè)因素的綜合影響，按RPN 值的大小判定風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)，1～4為低風(fēng)險(xiǎn)，6～12為中風(fēng)險(xiǎn)，18～27 為高風(fēng)險(xiǎn)?？紤]中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌組成和分布的復(fù)雜性，為彌補(bǔ)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估系統(tǒng)的不足，需對(duì)風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)評(píng)價(jià)系統(tǒng)進(jìn)行修正。規(guī)定當(dāng)SEV 為1 或3 時(shí)，無論RPN 為何值，均認(rèn)為是低或高風(fēng)險(xiǎn)。高風(fēng)險(xiǎn)需重點(diǎn)關(guān)注，并考慮微生物控制措施降低風(fēng)險(xiǎn)，并監(jiān)測(cè)剩余風(fēng)險(xiǎn)；中風(fēng)險(xiǎn)需進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)收益分析，確定是否采取適當(dāng)措施降低風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)；低風(fēng)險(xiǎn)無須采取風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)對(duì)措施，為可接受狀態(tài)。

2 結(jié)果與分析

確定參與量化風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的中藥飲片品種共53 個(gè)、760 批次。中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌污染狀況及量化風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果見表2。其中N1及N2分別代表N＞103cfu/g菌及N＞104cfu/ g 菌；某些品種因文獻(xiàn)數(shù)據(jù)分析結(jié)果差異大，故標(biāo)以不同數(shù)字分開統(tǒng)計(jì)?？梢?，穿心蓮、兩頭尖、部分枸杞和部分麥冬飲片耐膽鹽革蘭陰性菌污染風(fēng)險(xiǎn)高，占6.25%（4/64）；紅花、夏枯草和部分菊花飲片耐膽鹽革蘭陰性菌污染風(fēng)險(xiǎn)中等，占4.69%（3/64），其余中藥飲片的耐膽鹽革蘭陰性菌污染風(fēng)險(xiǎn)低，占89.06%（57/64）。

枸杞等10個(gè)品種中藥飲片調(diào)查結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果見表3（其中不同組別與表2 中飲片數(shù)字相對(duì)應(yīng)），其中7個(gè)品種完全一致，說明中藥飲片的耐膽鹽革蘭陰性菌污染狀況雖不同，但其風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)可能相同，同時(shí)也說明建立的量化風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法可行性較好。枸杞、麥冬和菊花飲片的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果不一致，說明此類直接口服和泡服的飲片耐膽鹽革蘭陰性菌分布種類和數(shù)量分布不均，也說明建立的方法尚存在一定局限性；同時(shí)存在高、中風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)，說明采取措施進(jìn)行適當(dāng)微生物控制完全可降至低風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)，實(shí)現(xiàn)中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌指標(biāo)的控制。

表3 10種中藥飲片的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果分析Tab.3 Results of risk assessment of ten TCM decoction pieces

中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌的污染途徑及傳遞過程分析見圖1。降低污染風(fēng)險(xiǎn)的措施，主要為需關(guān)注源頭和過程的引入及過程中的生長(zhǎng)繁殖，其中炮制、加工、貯藏和流通是降低風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵過程。

圖1 中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌的來源與傳遞Fig.1 Source and transmission of bile salt-resistant Gram-negative bacteria in TCM decoction pieces

3 討論

2020 年版《中國(guó)藥典》對(duì)直接口服和泡服飲片提出了耐膽鹽革蘭陰性菌的控制要求，對(duì)煎煮類飲片未作要求，但從中藥飲片微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估角度看，應(yīng)對(duì)中藥飲片總體進(jìn)行全面評(píng)估。盡管中藥飲片煎煮后其耐膽鹽革蘭陰性菌會(huì)減少甚至被殺滅，但當(dāng)生物負(fù)載過高時(shí)其毒素殘留會(huì)增加且微生物不能被完全殺滅的可能性增加，同樣也會(huì)帶來安全風(fēng)險(xiǎn)。因此，本研究中在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估時(shí)適度參考了2020年版《中國(guó)藥典（四部）》通則1107 非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)直接口服和泡服的中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌的要求，從嚴(yán)重性出發(fā)設(shè)定了煎煮類飲片風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)的參考值。

近年來文獻(xiàn)積累的數(shù)據(jù)為評(píng)估中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌的安全風(fēng)險(xiǎn)提供了可能。耐膽鹽革蘭陰性菌對(duì)中藥飲片造成風(fēng)險(xiǎn)嚴(yán)重性的確定較復(fù)雜，考慮合規(guī)性，致病性和給藥途徑尚無法全面反映安全風(fēng)險(xiǎn)，可能會(huì)影響評(píng)估結(jié)果的準(zhǔn)確性。如從飲片用量角度分析，目前中藥飲片的用量普遍較大，陳玉歡等［26］對(duì)12 家中醫(yī)院的飲片處方量調(diào)查顯示，中藥飲片處方平均劑量為129.60～245.00 g，平均藥味數(shù)為12～18 味，使實(shí)際中中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌風(fēng)險(xiǎn)更復(fù)雜，增加了全面風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的難度。近年來，以質(zhì)量與安全為核心的質(zhì)量等級(jí)評(píng)價(jià)模式構(gòu)建正在逐漸形成［27］，而其關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)的選擇考慮仍主要是理化指標(biāo)，對(duì)微生物方面的考慮不足，量化風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型的建立是對(duì)現(xiàn)有外源性有害物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型的補(bǔ)充。而量化評(píng)估方法作為中藥飲片微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的新模式，為采取措施降低風(fēng)險(xiǎn)與合理控制創(chuàng)造了條件。

中藥飲片過高的生物負(fù)載可使耐膽鹽革蘭陰性菌的部分微生物逃逸煎煮過程的殺滅，從而殘留在藥液中，如該藥液未及時(shí)用完，可能會(huì)在藥液中生長(zhǎng)繁殖，造成“耐熱菌”的假象。根據(jù)本研究中量化風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果，可以有針對(duì)性地對(duì)某些易導(dǎo)致耐膽鹽革蘭陰性菌污染的品種及過程進(jìn)行控制，降低生物負(fù)載。耐膽鹽革蘭陰性菌的生長(zhǎng)繁殖通常需要較高的水分，在炮制、貯藏、流通等環(huán)節(jié)采取措施控制水分，是防止微生物生長(zhǎng)繁殖的重要途徑。在炮制環(huán)節(jié)關(guān)注中藥材及飲片自身的吸濕性能［28］，李瓊瓊等［6］的調(diào)查顯示，經(jīng)凈制、干燥等簡(jiǎn)單炮制工藝的飲片中耐膽鹽革蘭陰性菌檢出率遠(yuǎn)高于炮制工藝包含熱處理的飲片。規(guī)范化流通和貯藏是降低耐膽鹽革蘭陰性菌生長(zhǎng)繁殖的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一［29］。如山楂、桔梗、補(bǔ)骨脂、麻黃等藥材有返潮或吸潮現(xiàn)象，水分含量超標(biāo)較嚴(yán)重［30］，環(huán)境及預(yù)防措施不到位導(dǎo)致污染微生物生長(zhǎng)繁殖［31］，探討水分、水分活度與微生物生長(zhǎng)的關(guān)系，通過控制中藥飲片水分，解決中藥飲片在貯藏、運(yùn)輸過程中微生物的過度增殖，可加強(qiáng)中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌的控制［32］。