劉若祎, 謝 潔, 喬曉婷, 江 游, 黃澤建,戴新華, 方 向, 葉子弘

(1.中國計量大學 生命科學學院，浙江 杭州 310018；2.中國計量科學研究院 前沿計量科學中心 國家市場監(jiān)管技術創(chuàng)新中心(質譜)，北京 100029)

1 引 言

胍基乙酸(guanidineacetic acid, GAA)和肌酸(creatine, CRE)是人體內源性物質,屬于氨基酸及其類似物[1,2]。肌酸可通過飲食攝入或自身合成[3]。在肌酸激酶(creatine kinase, CK)的作用下,CRE與腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)結合形成磷酸肌酸,為人體提供能量儲存,在細胞內能量的轉運過程中有著重要的作用[4,5]。肌酸缺乏綜合癥(creatine deficiency syndrome, CDS)是一種先天性代謝疾病,腦肌酸缺乏可導致精神發(fā)育遲滯,按基因缺陷可分為3種類型:合成水平的胍基乙酸N-甲基轉移酶(guanidinoacetate methyltransferase, GAMT)缺陷和精氨酸-甘氨酸脒基轉移酶(L-arginine: glycine amidinotransferase, AGAT)缺陷,以及轉運水平的SLC6A8基因突變所致的肌酸轉運蛋白受體(creatine transporter, CRTR)缺陷[6],均可引起CRE代謝異常[7～16]。由于血漿肌酸水平受到飲食攝取的顯著影響,肌酸檢測水平正常并不能排除CDS。胍基乙酸在肌酸合成中具有重要作用,是肌酸合成反應的前體[17],Verhoven[18]等報道過生物基體中的GAA濃度對大腦的活動和神經發(fā)育等行為具有影響,是精神類疾病最敏感的生物標記物之一。GAMT缺陷使胍基乙酸無法生成肌酸,胍基乙酸異常堆積;AGAT缺陷導致精氨酸和甘氨酸無法合成胍基乙酸,胍基乙酸不足進一步限制了肌酸的合成;測定胍基乙酸濃度,可區(qū)分這2種肌酸缺乏綜合癥。因此,生物樣本中CRE和GAA濃度的準確測定,在先天性遺傳代謝病的早期診斷中具有重要意義。

本文對GAA和CRE的相關疾病和近年來GAA和CRE的檢測方法進行了綜述,為以生物樣本中GAA和CRE作為標志物的相關疾病診斷提供理論依據。

2 胍基乙酸與肌酸的相關疾病與治療方法

CRE可從食物中攝取和內源性合成[6],內源性CRE合成涉及AGAT和GAMT兩種酶,前者在腎臟將精氨酸和甘氨酸轉化為鳥氨酸和GAA;后者在肝臟催化GAA甲基化生成CRE和S-腺苷-L-高半胱氨酸。循環(huán)中的CRE可通過肌酸轉運受體蛋白進入細胞,并通過CK磷酸化為磷酸肌酸(creatine phosphate, Crp)[19]。CRE及其磷酸化形式Crp主要存在于肌肉組織和神經組織中,起儲存和傳遞能量的作用[20,21]。CRE和Crp經非酶脫水和環(huán)化反應生成肌酐(creatinine, Crn),每天約有1.7%的CRE/Crp轉化為Crn[22],最終產物通過自由擴散進入尿液。

CRE的合成和運輸障礙導致的CDS患者臨床表現(xiàn)為起病較早、發(fā)育落后、智力障礙、自閉癥、語言表達障礙以及早發(fā)性癲癇[23]。CDS可能涉及3種代謝缺陷:GAMT缺陷、AGAT缺陷和CRTR缺陷[6]。這些不同代謝缺陷的早期診斷依賴于血漿、體液和尿液中GAA和CRE的精確測量。

2.1 GAMT缺陷

GAMT缺陷的特征是腦肌酸缺乏以及體液組織中GAA蓄積[24]。Braissant等[25]證明高氨血癥阻礙CRE的代謝及轉運,腦肌酸濃度降低,而CRE、Crp、CK參與神經元及軸突活動,中樞神經系統(tǒng)因此受到影響。通過補充CRE維持新生兒患者體內的CRE濃度,或許可以防止軸系障礙和腦損傷[23]。Gabriella等[26]研究病例發(fā)現(xiàn),通過補充CRE和限制GAA的治療無法逆轉患者的腦損傷。腦CRE缺乏與神經功能的紊亂以及線粒體結構的改變有關,也可導致腦肌病和線粒體肌病[27]。Schulze[28]通過核磁共振波譜觀察到,GAMT缺陷引發(fā)的CDS臨床表現(xiàn)惡化的患者大腦中CRE/Crp結果升高,經過幾年治療后也只能達到對照組的50%,患者無法痊愈,因此,在發(fā)病早期診斷并且及時治療尤為重要。Gouri等[29]通過核磁共振波譜發(fā)現(xiàn)所有GAMT型患者蒼白球指數均較高,部分患者肌酸峰值異常低,通過神經結構影像難以將GAMT和CRTR型缺陷患者區(qū)分開。與GAMT缺乏相關的生化表現(xiàn)包括:血漿、尿液、腦脊液、肌肉和大腦中的CRE濃度降低,所有生物體液(尤其是腦脊液)中GAA含量明顯升高,高濃度的GAA也可以在干血斑中被檢測到[30]。因此準確測量干血斑中GAA和CRE的含量,是GAMT缺乏的1種普遍疾病篩查方法[24]。

2.2 AGAT缺陷

AGAT也是參與肌酸合成的1種酶,在中樞神經系統(tǒng)中表達后促進大腦自主合成CRE[31]。CRE和Crp在細胞供能中(尤其在肌肉和大腦中)發(fā)揮重要作用[32]。AGAT缺陷導致CRE合成減少,細胞功能不足,已有報道患AGAT缺陷的成年患者臨床表現(xiàn)出肌肉無力[33,34]。大多數AGAT缺陷患者會出現(xiàn)精神發(fā)育遲滯、運動遲緩與嚴重的語言障礙,有時伴有自閉癥行為[35]。而與AGAT缺乏相關的生化表現(xiàn)則包括:肌張力減退,疲勞,CK活性升高,語言發(fā)育滯后[36]。現(xiàn)有研究表明長期補充CRE可改善此缺陷導致的肌無力癥狀,但最佳補充劑量和時間還缺少研究。而精神運動性遲鈍只有在患者的早期診斷中才可能避免,后期治療不能提高成年患者的智力[34],因此早期診斷與治療顯得更為重要。

2.3 CRTR缺陷

CRTR缺陷比GAMT缺陷癥狀輕,主要的生化改變是氫質子磁共振波譜上的腦肌酸降低[37,38]。在病例指標中發(fā)現(xiàn)血液和尿液中CRE含量略微增高,并表明尿液中CRE與Crn的比值(CRE/Crn)可作為該疾病的診斷標志[39]。Theodora等[40]報告了17例CRTR缺陷患者,發(fā)現(xiàn)CRE與Crn比值升高程度與患者基因型以及診斷年齡之間沒有相關性,通過CRE、精氨酸與甘氨酸聯(lián)合治療后,2名女性患者臨床表現(xiàn)沒有得到改善。作者認為需要開發(fā)新的診斷和治療方法來改善CRTR缺陷。

2.4 診斷及治療方法

目前,由GAMT和AGAT缺陷引起的CRE合成障礙的有效治療方法是口服補充一水合肌酸和鳥氨酸并限制精氨酸的攝入,使用苯甲酸鈉來減少甘氨酸的產生[41];但治療并不能逆轉已經產生的智力障礙,也不能提高CRTR缺陷患者的腦肌酸水平。早期的發(fā)現(xiàn)和治療可以很大程度上改善CRE生物合成缺陷患者的預后,早期診斷的可行性有多項條件支持,比如: 在AGAT缺陷中,GAA和CRE濃度均降低,影響嬰兒的正常代謝[42],GAMT缺陷則導致嬰兒尿液中GAA濃度升高[43],這些都可以在尿液樣本中被發(fā)現(xiàn)[3]。因此GAA和CRE代謝檢測很適合納入新生兒疾病篩查項目。

實驗室對CDS的診斷包括CRE及其代謝物的分析、酶活性的測定、CRE負荷試驗和突變研究,并用氫質子磁共振波譜輔助診斷。通過測量GAA、CRE的濃度并計算尿液中CRE與Crn的比值以及GAA與Crn的比值來判斷AGAT和GAMT是否缺乏,計算高CRE與Crn的比值以及GAA與Crn的比值來判斷SLC6A8是否缺乏。Almeida[44]等研究了8例GAMT缺陷患者和8例SLC6A8缺陷患者,發(fā)現(xiàn)在GAMT缺陷患者的尿液、血漿和腦脊液中存在GAA水平升高的現(xiàn)象,說明GAA是確定GAMT缺陷的有效標志物。此外, CRTR缺陷患者尿液中CRE與Crn的比值(CRE/Crn)升高,說明CRE/Crn是CRTR缺陷的重要生化指標。

3 生物樣本中GAA和CRE的檢測方法

對于GAA和CRE相關的疾病,雖然通過后期治療可一定程度改善病癥,但對于智力的影響卻無法通過藥物可逆治愈[28,45]。因此精確檢測生物樣本中CDS代謝標志物,對于實現(xiàn)先天性代謝遺傳病的早期診斷和干預治療顯得尤為重要。

目前,對于生物樣本中GAA和CRE濃度的檢測方法主要包括高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質譜法、氣相色譜-質譜聯(lián)用法。

3.1 高效液相色譜(HPLC)法

HPLC法采用高壓輸液系統(tǒng),將流動相輸入載有固定相的色譜柱,在柱內將目標物分離后進入電化學檢測器或紫外檢測器中進行檢測,從而實現(xiàn)對樣品的分析。

Claudia[46]等用HPLC法測定生物體液中CRE、GAA、Crn濃度來診斷AGAT和GAMT缺陷。Claudia等將血漿和尿液樣本進行超濾后稀釋,根據Carducci[47]等的方法進行衍生化,在0.02～4 μmol/L范圍內測定了GAA峰面積與濃度的線性關系,在2～400 μmol/L范圍內測定了Cr與Crn峰面積與濃度之和的線性關系,相關系數分別為0.999 8和0.999 9;在AGAT缺乏癥患者中,GAA和CRE在尿液中的濃度呈顯著正相關(r=0.494 5,P=0.000 1),而血漿中無顯著相關性(r=0.083,P=0.41);對10份血漿和尿液進行批間精密度評估,GAA變異系數為4.4%和4.8%,CRE與Crn總含量的變異系數為4.1%和4.7%;樣本分3份進行分析后,平均回收率98%～102%。

王翔林[1]等用HPLC法測定GAA含量,結果顯示GAA在20～100 μg/mL范圍內線性關系良好,(R2=0.999 7),平均回收率為98.6%,相對標準偏差為0.65%。Alekha[48]等用HPLC對水樣中CRE和Crn進行了檢測,結果顯示CRE濃度在1～100 μg/mL范圍內與Crn濃度在2～100 μg/mL范圍內線性關系良好,CRE日內和日間精密度的相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)分別在(1.0～4.6)%和(2.2～4.7)%之間,CRE含量測定的準確度RSD在(2.4～4.7)%之間。Ankit等[49]用HPLC測定小鼠腦漿中的GAA與CRE后發(fā)現(xiàn)AGAT與GAMT型突變小鼠大腦中CRE濃度降低; GAA在AGAT型小鼠大腦中減少,而在GAMT型中增加。將結果與基因表達數據相關聯(lián)后,認為CRE代謝對大腦發(fā)育有重要意義,并提出對CDS患者進行早期干預的重要性。

HPLC法簡單、快捷,既測定GAA和CRE含量,也能用于評估二者在生物樣本中的穩(wěn)定性。但生物樣本不是純物質,GAA與CRE的含量較低,HPLC法檢測的靈敏度不夠高,定量結果的準確性有限。

3.2 液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)法

液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)法的原理是以液相色譜分離待測物,串聯(lián)質譜作為檢測器檢測目標物含量。LC-MS/MS具有高靈敏度、應用范圍廣和專一性強的特點,已廣泛應用于臨床診斷。

在代謝產物的分析中,LC-MS/MS因具有高靈敏度和特異性,被認為是最有效的分析方法之一[50]。2001年,Olaf[51]等首次以d3-CRE為內標,將GAA和CRE進行丁酯衍生化,采用同位素稀釋的LC-MS/MS技術建立了同時測定血漿中GAA和CRE的方法。測定GAA和CRE相關化合物的LC-MS/MS方法見表1。

表1 測定GAA、CRE相關化合物LC-MS/MS方法Tab.1 LC-MS/MS methods for the quantification of GAA and CRE related compounds

Cognat[52]等采用API 2000串聯(lián)質譜儀,在正離子模式下檢測GAA、CRE、[13C2]GAA和d3-CRE。通過GAA或CRE校準溶液與各自內標物比值的線性回歸分析來構建校準曲線。結果顯示,GAA在0.039～0.033 μmol/L范圍內線性關系良好(R2=0.998);CRE在0.017～0.077 μmol/L范圍內線性關系良好(R2=0.998)。對稀釋10倍的樣品提取液進行評估,尿液中GAA和CRE的變異系數分別為10%和8%,血漿中GAA和CRE的變異系數分別為20%和3%。單次LC-MS/MS方法下尿液中GAA和CRE的日內變異系數分別為4%,3%;血漿中GAA和CRE的日內變異系數分別為9%,2%。對提取和注射5天后的同一尿樣和血漿標本進行日間變異系數評定,尿液中GAA和CRE的變異系數為9%,10%;血漿中GAA和CRE的變異系數為9%,13%。LC-MS/MS法快速檢測體液中的GAA與CRE濃度得到驗證。2006年,Claudia[53]等結合穩(wěn)定同位素稀釋法的優(yōu)勢,以HPLC、GC-MS/MS、LC-MS/MS為基礎,建立了血漿和尿液中GAA和CRE的檢測方法。將GAA和CRE衍生化后在45 ℃的氮氣流中干燥,然后用含0.1%乙酸的甲醇水回收,稀釋樣品以流動注射分析方式進行質譜實驗。結果顯示,干血斑中GAA和CRE的檢出限分別為0.30 μmol/L 和0.34 μmol/L,GAA回收率為94%～105%,CRE回收率為93%～101%,GAA組間變異系數為5.3%, CRE組間變異系數為4.5%。GAA在0.25～12.5 μmol/L范圍內線性關系良好,CRE在3.57～624.7 μmol/L范圍內線性關系良好。

2014年,Christiane[43]等為篩查CDS設計了1套高通量的質譜篩查設備,用LC-MS/MS法同時分析GAA、CRE、乳清酸、尿嘧啶、Crn。實驗隨機抽取200例健康的足月新生兒和早產兒的尿液樣本作為對照,建立這一特定年齡段GAA和CRE的正常參考值。采用質量控制方法,分別在低、中、高3個濃度水平評價日內(每天5個重復)和日間(5天)的精確度,結果顯示變異系數小于15%,誤差小于10%, GAA、CRE、Crn的平均回歸系數為0.998,每種物質的線性關系良好,回收率91%～98%,目標物的檢出限在0.3～20.9 μmol/L之間。Rucheton等[54]比較了衍生化和直接離子配對2種前處理方法,通過LC-MS/MS測量血漿和尿液中的GAA與CRE,簡化后的方法日內和日間變異系數均小于15%,GAA與CRE平均回歸系數均為0.999。

LC-MS/MS法診斷CDS可以通過對尿液和血漿中的GAA和CRE的定量來完成[55],該分析方法流程簡單且通量較高,試劑成本低,具有快速、特異性強、線性范圍寬且線性關系良好、與同位素稀釋GC-MS/MS法具有可比性等優(yōu)點;但不同生物樣本產生的基質效應會破壞響應的穩(wěn)定性以及結果的重復性。由于殘留效應,該方法對于濃度過高的樣本也會有局限性。

3.3 氣相色譜-質譜聯(lián)用(GC-MS)法

GC-MS法檢測系統(tǒng)中,氣相色譜系統(tǒng)進行物理分離,利用氣體流動相和固定相之間分配系數的差異,在2相間進行多次分配后進入質譜系統(tǒng)。GC-MS法抗干擾能力強且定性準確,可通過與檢出限低、定量準確的同位素稀釋法相結合[56,57],建立氣相色譜-同位素稀釋-串聯(lián)質譜法(GC-ID-MS/MS)。

1998年, Struys[58]等建立了1種GC-MS法測定不同體液中的GAA,采用兩步衍生法,先與六氟乙酰丙酮反應生成雙嘧啶環(huán)結構,然后與五氟芐基溴反應。以13C2標記的GAA作為內標,雙嘧啶五氟芐基(PFB)衍生物在頂空裝置中分離,并在負離子模式下用質譜定量。該方法檢測出的同位素純度大于98%,尿液樣本在5～100 nmol范圍內線性關系良好(R2=0.999 9),血漿和腦脊液樣本在0.01～1 nmol范圍內線性關系良好(R2=0.999 8),表明其在簡單性和精確性方面更進一步。2004年,Carla[59]等采取同樣的兩步衍生法,通過對169份尿液標本的分析,建立了健康嬰幼兒、兒童和青少年GAA和CRE的參考值,該方法首次同時測定尿液中GAA和CRE。結果顯示GAA在43～4 269 μmol/L范圍內,CRE在38～7 325 μmol/L范圍內呈良好線性關系;GAA和CRE的檢出限分別為1.54、1.22 μmol/L,定量限分別為5.04、4.19 μmol/L。同Struys[58]等的方法對比,該方法靈敏度更高,穩(wěn)定同位素作為內標可補償檢測器自身不穩(wěn)定引起的變化[57],但由于加入了內標,檢測成本更為高昂。

2004年,Almeida[44]等對之前的方法進行了調整,樣品在300 ℃用不分流模式進行注射,以便完成GAA和CRE的同時測定。研究了年齡和性別對GAA和CRE濃度的影響,結果顯示性別對二者無明顯差異 (P(GAA)=0.062,P(CRE)=0.261),尿液和血漿中GAA和CRE濃度與年齡有關(P=0.001)。樣本在白天的變化并不明顯,表明隨機的尿液樣本足以診斷CDS。 LC-ID-MS/MS法由于特定的衍生化,可選擇性和敏感度高,是一種測定生物樣本中CRE與GAA的精準方法[60,61],允許同時分析CRE和GAA,可適用于篩查大量具有CDS臨床特征的患者。

Takhar[62]等首次用GC-MS法快速測定生物體液中GAA和CRE濃度,該方法以GAA和CRE的雙嘧啶甲酯衍生物的制備為基礎,結果顯示GAA和CRE的最低可測的質荷比富集率為0.3%。GAA和CRE分別在0.5～250 μmol/L和2～500 μmol/L濃度范圍內線性關系良好。該方法可用于準確測定人體內GAA和CRE含量,具有穩(wěn)定性好、靈敏度高等優(yōu)點。

將氣相色譜的高效分離與質譜儀的高靈敏度和高特異性結合,應用于環(huán)境分析、代謝物分析、農藥檢測和有機酸檢測等,在監(jiān)測方法中扮演重要角色。但往往需要經過衍生化等復雜的處理才能進行檢測,成本較高。

4 結語與展望

綜上,GAA和CRE對生物體的代謝起重要作用,體內GAA和CRE濃度在先天性遺傳代謝病的診斷上具有標志性意義。GAMT臨床表現(xiàn)差異較大[63,64],部分患者表現(xiàn)為嚴重的錐體外系運動障礙或癲癇[65],而有些患者僅表現(xiàn)為發(fā)育遲緩和輕度癲癇[63],臨床癥狀的多變性增加了對該疾病診斷篩查方法的需求。目前世界范圍內被報道的病例較少[63,64,66],很有可能是這種疾病的診斷不足。遺傳代謝病癥狀各異且較為復雜,確診難度高,而疾病的早期診斷和早期治療能極大改善出生缺陷;因此,提高代謝標志物檢測方法的準確度有重要意義。

LC-MS/MS、GC-MS/MS、HPLC均能實現(xiàn)生物樣本中GAA和CRE的測定,HPLC具有成本低、操作及分析流程簡單等特點,但由于存在一定的分析干擾,特異性不夠,不適用于血漿樣品的研究。GC-MS/MS方法雖然有效,但儀器的穩(wěn)定性容易影響檢測結果的準確性[67]。與LC-MS/MS相比,GC-MS/MS衍生化過程更加耗時且靈敏度低,并且衍生化所產生的副產物可能會影響檢測結果,載氣的不同也會影響柱分離效率與檢測器的靈敏度,樣品量過多同樣也會嚴重降低分離度。受分析物沸點、極性、穩(wěn)定性以及分子量的限制,只有待測物能通過加熱形成氣態(tài)時才能使用GC-MS/MS。LC-MS/MS具有高靈敏、高特異性、高效快速等優(yōu)勢[68],在大型實驗室的檢測項目中采用率高,廣泛應用于小分子檢驗,可作為診斷CDS的首選方法,在疾病的預防和診斷中有重要意義。從靈敏度、分析速度、檢測成本等各方面考慮,未來還需通過對實驗儀器和條件的不斷優(yōu)化,建立高通量快速篩查CDS的方法。