李 萍,劉 敏,邢曉東,李夢(mèng)倩,張 蒙,周 蓉,蔣芳玲,吳 震

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210095)

大蒜(AlliumsativumL.)為1a或2a生草本植物,其鱗莖、花薹和嫩葉不僅可作蔬菜食用,還可入藥,是世界范圍內(nèi)重要的食藥兼用作物。大蒜通常不育,因其不能形成種子而通過鱗莖或者氣生鱗莖進(jìn)行無性繁殖,長(zhǎng)期無性繁殖易造成病毒積累,導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降,給大蒜生產(chǎn)帶來不利影響[1]。由于植物組織培養(yǎng)具有顯著的脫除病毒效果,因而有希望成為大蒜脫除病毒、恢復(fù)種性的有效手段[2]。

相較于其他組織培養(yǎng)途徑,體細(xì)胞胚發(fā)生途徑具有再生植株結(jié)構(gòu)完整、繁殖系數(shù)高和遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)。已有研究表明,可可[3]、木薯[4]、甘蔗[5]和大蒜[1]等植物可通過體細(xì)胞胚發(fā)生途徑有效脫除病毒。在藍(lán)桉[6]、香菜[7]、唐菖蒲[8]、大蒜[9]等植物中,已證實(shí)通過體細(xì)胞胚發(fā)生途徑形成的植株遺傳穩(wěn)定。因此,建立高效穩(wěn)定的大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生體系,對(duì)于高效脫除病毒,乃至進(jìn)行大蒜種質(zhì)資源創(chuàng)新,均具有重要意義。同時(shí),通過對(duì)體細(xì)胞胚發(fā)生過程中的形態(tài)解剖學(xué)特征進(jìn)行觀察,明確其發(fā)生階段和典型特征,有助于更全面了解體細(xì)胞胚發(fā)生過程,從而提高體細(xì)胞胚發(fā)生及植株再生效率[10]。目前,雖然國內(nèi)外學(xué)者已初步誘導(dǎo)獲得大蒜體細(xì)胞胚和再生植株,但總的來說,大蒜通過體細(xì)胞胚發(fā)生和成苗體系還不夠成熟,關(guān)于大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生過程中的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)特征還未見報(bào)道,需要做進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)在課題組前期工作基礎(chǔ)上,以大蒜品種 ‘二水早’ 為試材,研究不同外植體、不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及其組合對(duì)大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生過程的影響,同時(shí)進(jìn)行形態(tài)、組織和超微結(jié)構(gòu)特征觀察,旨在確立大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生的最佳誘導(dǎo)和培養(yǎng)條件,明確大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生的不同階段及其形態(tài)解剖學(xué)特征,為建立基于體細(xì)胞胚發(fā)生途徑的大蒜試管苗高效培養(yǎng)體系提供理論依據(jù)和技術(shù) 支撐。

1 材料與方法

1.1 植物材料與培養(yǎng)

以大蒜品種 ‘二水早’ 為材料,分別以大蒜花序軸、鱗莖盤、發(fā)芽葉基及氣生鱗莖和蒜瓣的無菌試管苗根尖、根段、嫩葉為外植體。供試大蒜 ‘二水早’ 在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院保存,種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)牌樓教學(xué)科研基地。10月上旬進(jìn)行大蒜播種,從第2年3月下旬開始,在蒜薹的花莖發(fā)育相對(duì)高度(花莖高度/假莖高度)為1,花序軸上表面直徑為0.3～0.5 cm時(shí),陸續(xù)采收蒜薹,備用。第2年6月上旬收獲大蒜鱗莖和氣生鱗莖。挑選健康、大小一致的蒜薹、蒜瓣和氣生鱗莖作為外植體材料進(jìn)行試驗(yàn)。

接種前對(duì)外植體進(jìn)行消毒處理,方法如下:剪下帶2 cm左右花莖的蒜薹總苞(以花序軸為外植體),剝?nèi)ニ獍昊驓馍[莖外層的表皮,先置于飽和洗衣粉溶液中浸泡30 min,流水沖洗15～30 min,然后在超凈工作臺(tái)用75%酒精消毒90 s,無菌水清洗1次。再用2%次氯酸鈉溶液消毒,其中,氣生鱗莖消毒4～6 min,蒜薹和蒜瓣消毒8～12 min。再用無菌水清洗5次,最后置于無菌濾紙上吸干表面水分,待用。

蒜瓣和氣生鱗莖無菌試管苗培養(yǎng):(1)蒜瓣無菌苗:將消毒蒜瓣去除貯藏葉和營養(yǎng)葉,切去蒜瓣底部約1 mm的木栓化組織,留下3～5 mm的帶莖尖的鱗莖盤,按十字型切成大小均勻的4份,接種到B5+ 2.0 mg/L6-BA + 0.1 mg/L NAA + 0.65%瓊脂 + 3%蔗糖(pH為5.8)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)無菌試管苗;(2)氣生鱗莖無菌苗:將消毒的氣生鱗莖接種到MS + 0.65%瓊脂 + 3%蔗糖(pH為5.8)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)無菌試管苗。培養(yǎng)條件均為:溫度(25±1)℃,光周期12 h/12 h,光照強(qiáng)度40～50 μmol/(m2·s)。

1.2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和外植體對(duì)大蒜胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

1.2.1 2,4-D 以大蒜花序軸、鱗莖盤和發(fā)芽葉基為外植體,誘導(dǎo)胚性愈傷組織,設(shè)置0、1.0、 2.0、3.0和4.0 mg/L 5個(gè)2,4-D質(zhì)量濃度,共15種處理組合。以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,除不同質(zhì)量濃度2,4-D外,均加入質(zhì)量濃度為0.5 mg/L的KT,0.7%瓊脂和3%蔗糖,pH調(diào)為5.8,接種后在(25±1)℃下黑暗培養(yǎng)。

以花序軸為外植體:取大蒜消毒總苞,剝?nèi)ネ鈱涌偘?去除退化的花原基殘留物,切取帶2～3 mm花莖的花序軸,縱切分成均勻2份接種于培養(yǎng)基;以鱗莖盤為外植體:取消毒蒜瓣,去除貯藏葉和營養(yǎng)葉,切去蒜瓣底部約1 mm的木栓化組織,保留3～5 mm帶莖尖的鱗莖盤,按十字型切成大小均勻的4份接種于培養(yǎng)基;以蒜瓣發(fā)芽葉基為外植體:取消毒蒜瓣,去除貯藏葉及莖盤部分,留下發(fā)芽葉基部約5 mm,縱切均勻分成2份接種于培養(yǎng)基。每個(gè)培養(yǎng)皿接種4份外植體,每個(gè)處理接種15個(gè)培養(yǎng)皿,3次重復(fù)。培養(yǎng)過程中觀察和記錄胚性愈傷組織誘導(dǎo)和生長(zhǎng)狀態(tài),60 d后統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.2 毒莠定(Picloram,PIC) 以鱗莖盤為外植體,探究不同質(zhì)量濃度PIC對(duì)大蒜胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響。設(shè)置0、1.0、2.0、4.0和8.0 mg/L 5個(gè)PIC質(zhì)量濃度,共5種處理。以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,除不同質(zhì)量濃度PIC外,均加入質(zhì)量濃度為0.1 mg/L的NAA,0.7%瓊脂和3%蔗糖,pH調(diào)為5.8。外植體接種前的處理同 “1.2.1”。每個(gè)培養(yǎng)皿接種4份外植體,每個(gè)處理接種10個(gè)培養(yǎng)皿,3次重復(fù)。接種后在 (25±1) ℃下進(jìn)行黑暗培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中觀察和記錄胚性愈傷組織誘導(dǎo)和生長(zhǎng)狀態(tài),60 d后統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.3 外植體 以蒜瓣和氣生鱗莖誘導(dǎo)的無菌試管苗的根尖、根段和嫩葉為外植體,分別接種在B5 + 3.0 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L KT+0.7%瓊脂 + 3%蔗糖(pH為 5.8)的培養(yǎng)基中,進(jìn)行胚性愈傷組織誘導(dǎo)。無菌試管苗的根尖、根段和嫩葉均切割為長(zhǎng)5 mm的小段。每個(gè)培養(yǎng)皿接種 4～6份外植體,每個(gè)處理接種10個(gè)培養(yǎng)皿,3次重復(fù)。接種后在(25±1)℃進(jìn)行黑暗培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中觀察和記錄胚性愈傷組織誘導(dǎo)和生長(zhǎng)狀態(tài),60 d后統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.3 不同質(zhì)量濃度組合2,4-D和6-BA對(duì)大蒜體細(xì)胞胚萌發(fā)的影響

胚性愈傷組織在原培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng),經(jīng) 1～2月至大量球形胚形成。以發(fā)育狀態(tài)良好的球形胚為材料,以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,添加不同質(zhì)量濃度2,4-D和6-BA,其中2,4-D質(zhì)量濃度設(shè)置 0.25、1.0和3.0 mg/L,6-BA質(zhì)量濃度設(shè)置 0.5、2.0和4.0 mg/L,共9種處理組合。培養(yǎng)基中均加入0.7%瓊脂和3%蔗糖,pH調(diào)為5.8。每個(gè)培養(yǎng)皿接種0.3 g球形胚,3次重復(fù),接種后在(25±1)℃下黑暗培養(yǎng)。待觀察到體細(xì)胞胚發(fā)育成熟,開始萌發(fā)時(shí),將體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移至無植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中,采用光照培養(yǎng),光周期為12 h/12 h,光照強(qiáng)度為40～50 μmol/(m2·s)。培養(yǎng)過程中觀察體細(xì)胞胚發(fā)育狀況并拍照,30 d后統(tǒng)計(jì)體細(xì)胞胚的萌發(fā)數(shù),并計(jì)算萌發(fā)系數(shù)。

1.4 大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生不同階段的形態(tài)解剖學(xué)特征

將大蒜花序軸接種在B5+ 3.0 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L KT + 0.7% 瓊脂 + 3% 蔗糖(pH為 5.8)的培養(yǎng)基上,在(25±1)℃下黑暗培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中分別利用體視顯微鏡、正置熒光顯微鏡和透射電鏡觀察體細(xì)胞胚發(fā)生過程,明確大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生不同階段的變化特點(diǎn),并確定其形態(tài)、組織和超微結(jié)構(gòu)特征。

1.4.1 形態(tài)學(xué)特征觀察 取大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生過程不同時(shí)期的培養(yǎng)物,置于Leica DFC7000T體式顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察并拍照,確定體細(xì)胞胚發(fā)生不同階段的形態(tài)特征。

1.4.2 組織學(xué)觀察 采用常規(guī)石蠟切片法制備大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生不同時(shí)期培養(yǎng)物的組織切片。培養(yǎng)材料先固定在FAA(V甲醛∶V冰醋酸∶V70%乙醇=1∶1∶18)溶液中,立即抽真空使其沉入試管底部,固定24 h后,進(jìn)行系列乙醇逐級(jí)脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片(厚度為8 μm),甲苯胺藍(lán)染色和中性樹膠封片等操作,最后將切片置于Leica DFC450C正置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.3 超微結(jié)構(gòu)觀察 根據(jù)形態(tài)組織學(xué)特征,取外植體、愈傷組織、初期胚性愈傷組織、后期胚性愈傷組織和球形胚五個(gè)階段的培養(yǎng)物,迅速投入電鏡固定液(2.5%戊二醛溶液)中固定,立即抽真空使其沉入試管底部,室溫放置2 h,然后轉(zhuǎn)入 4 ℃冰箱。固定好后送由武漢賽維爾生物科技有限公司制片,制片過程包括脫水,滲透,包埋,利用Leica UC7超薄切片機(jī)60～80 nm超薄切片,鈾鉛雙染色等一系列步驟,最后將切片置于Hitachi H-7650透射電鏡下觀察并拍照。

1.5 試管鱗莖的形成和植株生長(zhǎng)狀態(tài)觀察

體細(xì)胞胚萌發(fā)形成的試管植株,經(jīng)90 d培養(yǎng)后可形成試管鱗莖。將試管鱗莖在4 ℃冰箱冷藏1個(gè)月打破休眠,然后播種到經(jīng)過高壓滅菌后的復(fù)合基質(zhì)中,復(fù)合基質(zhì)由草炭、珍珠巖、蛭石按體積比2∶1∶1配制。植株生長(zhǎng)過程中定期澆水和營養(yǎng)液。播種15 d后統(tǒng)計(jì)試管鱗莖的萌發(fā)率, 45 d后統(tǒng)計(jì)試管鱗莖苗的成活率。

1.6 調(diào)查項(xiàng)目與方法

胚性愈傷組織誘導(dǎo)率=產(chǎn)生胚性愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%

體細(xì)胞胚萌發(fā)系數(shù)=萌發(fā)苗數(shù)/接種的球形胚鮮質(zhì)量

試管鱗莖萌發(fā)率=萌芽的試管鱗莖數(shù)/播種的試管鱗莖總數(shù)×100%

試管鱗莖苗成活率=存活的試管鱗莖苗數(shù)/萌芽的試管鱗莖總數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和外植體對(duì)大蒜胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.1.1 2,4-D的影響 2,4-D質(zhì)量濃度不同,大蒜花序軸、鱗莖盤和發(fā)芽葉基的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和形成狀態(tài)存在差異(表1)。以花序軸為外植體,2,4-D質(zhì)量濃度從1.0升高到3.0 mg/L,胚性愈傷組織誘導(dǎo)率由37.22%提高至82.22%,當(dāng)2,4-D質(zhì)量濃度為4.0 mg/L時(shí),胚性愈傷組織誘導(dǎo)率為81.11%,與3.0 mg/L差異不顯著,但其誘導(dǎo)形成的胚性愈傷組織的量較少。以鱗莖盤為外植體,在2,4-D質(zhì)量濃度為2.0和3.0 mg/L時(shí),胚性愈傷組織誘導(dǎo)率較高,分別為 89.21%和89.50%,但2,4-D質(zhì)量濃度為3.0 mg/L時(shí),形成胚性愈傷組織的量較少。對(duì)于發(fā)芽葉基,在2,4-D質(zhì)量濃度為 2.0和3.0 mg/L時(shí),胚性愈傷組織誘導(dǎo)率較高,分別為82.52%和 83.40%,且形成的胚性愈傷組織的量較多。在不添加2,4-D的培養(yǎng)基中,3種外植體均未能誘導(dǎo)形成胚性愈傷組織。

表1 大蒜不同外植體在不同質(zhì)量濃度2,4-D處理下的胚性愈傷組織誘導(dǎo)Table 1 Embryogenic callus induction of different garlic explants under different mass concentrations of 2,4-D

2.1.2 PIC的影響 不同質(zhì)量濃度PIC誘導(dǎo)大蒜鱗莖盤形成胚性愈傷組織的情況見表2。隨著PIC質(zhì)量濃度的升高,胚性愈傷組織誘導(dǎo)率先升后降。當(dāng)PIC質(zhì)量濃度為4.0 mg/L時(shí),胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高,為67.5%。培養(yǎng)基中未添加PIC,不能誘導(dǎo)外植體形成胚性愈傷組織。PIC質(zhì)量濃度為2.0和4.0 mg/L,誘導(dǎo)形成胚性愈傷組織的量多,表面較光滑,呈顆粒狀。PIC質(zhì)量濃度為1.0和8.0 mg/L,誘導(dǎo)形成的胚性愈傷組織的量少,呈顆粒狀,表面較粘稠。

表2 大蒜鱗莖盤在不同質(zhì)量濃度PIC處理下的胚性愈傷組織誘導(dǎo)Table 2 Embryogenic callus induction of garlic bulb disc under different mass concentrations of PIC

2.1.3 外植體的影響 由表3可知,氣生鱗莖和蒜瓣無菌試管苗不同部位誘導(dǎo)形成胚性愈傷組織的效果存在差異。以氣生鱗莖和蒜瓣無菌試管苗根尖為外植體,其胚性愈傷組織誘導(dǎo)率均顯著高于根段和嫩葉。其中,以氣生鱗莖無菌試管苗根尖為外植體,胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高,達(dá) 96.00%,蒜瓣無菌試管苗根尖次之,為80.00%。無菌試管苗不同部位誘導(dǎo)形成的胚性愈傷組織,外觀形態(tài)上均表現(xiàn)為表面光滑、呈顆粒狀,氣生鱗莖無菌試管苗根尖和根段誘導(dǎo)形成的胚性愈傷組織的量 較少。

2.2 不同質(zhì)量濃度的2,4-D和6-BA組合對(duì)大蒜體細(xì)胞胚萌發(fā)的影響

不同質(zhì)量濃度2,4-D和6-BA組合對(duì)大蒜體細(xì)胞胚發(fā)育和成熟萌發(fā)有顯著影響(表4)。2,4-D 0.25 mg/L+ 6-BA 0.5 mg/L的組合,體細(xì)胞胚萌發(fā)系數(shù)最高,達(dá)35.56個(gè)/g。隨著2,4-D和6-BA質(zhì)量濃度的升高,體細(xì)胞胚萌發(fā)系數(shù)降低。當(dāng)2,4-D質(zhì)量濃度升至3.0 mg/L時(shí),不能誘導(dǎo)體細(xì)胞胚萌發(fā)成苗。以上結(jié)果說明,高質(zhì)量濃度的2,4-D和6-BA不利于大蒜體細(xì)胞胚的發(fā)育,促進(jìn)大蒜體細(xì)胞胚成熟萌發(fā)的適宜植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合為:2,4-D 0.25 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L。

表4 大蒜體細(xì)胞胚在不同質(zhì)量濃度2,4-D和6-BA組合處理下的萌發(fā)系數(shù)Table 4 Germination coefficient of garlic somatic embryos under different mass concentration combinations of 2,4-D and 6-BA

2.3 大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生過程中的形態(tài)解剖學(xué)特征觀察

2.3.1 形態(tài)學(xué)特征 以花序軸(圖1-A)為外植體,在胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后,其頂端出現(xiàn)密集的點(diǎn)狀突起。培養(yǎng)至第13天,花序軸頂端形成一層半透明的物質(zhì),表面不光滑,為愈傷組織(圖1-B)。至第20天,愈傷組織的局部開始出現(xiàn)表面光滑、半透明的顆粒狀突起,表明胚性愈傷組織開始形成。培養(yǎng)至第27天,在愈傷組織的局部形成明顯的顆粒狀突起,為初期胚性愈傷組織(圖1-C)。隨著培養(yǎng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng),形成的顆粒狀突起不斷增多,體積不斷變大。至第60天,顆粒狀突起幾乎完全覆蓋外植體,形成了大量胚性愈傷組織,為后期胚性愈傷組織(圖1-D)。培養(yǎng)至第90天,胚性愈傷組織進(jìn)一步發(fā)育,形成半透明、表面光滑的球狀體,即為球形胚。培養(yǎng)至第120天,可觀察到大量球形胚的形成(圖1-E)。球形胚逐漸與母體產(chǎn)生生理隔離,最后可以從母體剝落分離(圖1-F)。此后,球形胚進(jìn)一步發(fā)育,形成梨形胚(圖1-G)、子葉形胚(圖1-H),最后可觀察到子葉形胚萌發(fā)成苗,形成具有芽和根的完整植株(圖1-I)。

A.外植體; B.愈傷組織; C.初期胚性愈傷組織; D. 后期胚性愈傷組織; E、F. 球形胚; G.梨形胚; H.子葉形胚; I.體細(xì)胞胚萌發(fā)形成的小植株。白色箭頭所指處,CA為愈傷組織,EC為胚性愈傷組織,GE為球形胚

2.3.2 組織學(xué)特征 以花序軸為外植體,觀察大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生不同階段的組織學(xué)特征,結(jié)果見圖2。在愈傷組織形成階段,外植體表層組織(圖2-A)經(jīng)脫分化后,形成體積較大、形狀不規(guī)則的薄壁細(xì)胞(圖2-B),它們排列疏松,高度液泡化,細(xì)胞核很小或觀察不到細(xì)胞核。在初期胚性愈傷組織階段,薄壁細(xì)胞進(jìn)一步形成胚性細(xì)胞團(tuán),這些細(xì)胞比薄壁細(xì)胞小,排列緊密,細(xì)胞核大而明顯(圖2-C),具有較強(qiáng)的分裂能力,可以不斷進(jìn)行細(xì)胞分裂(圖2-D)。后期胚性愈傷組織,隨著薄壁細(xì)胞不斷轉(zhuǎn)化為胚性細(xì)胞及胚性細(xì)胞的分裂,形成多個(gè)由大量胚性細(xì)胞構(gòu)成的原胚,原胚呈顆粒狀(圖2-E),其組織學(xué)觀察的發(fā)育階段與形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果一致。在球形胚階段,組成球形胚的細(xì)胞體積比較小,呈近圓形,細(xì)胞排列規(guī)則,細(xì)胞核大而明顯。球形胚尚未觀察到維管束的形成(圖2-F)。

A.外植體(×20); B. 愈傷組織(×20); C. 初期胚性愈傷組織(×20); D. 初期胚性愈傷組織(×63); E. 后期胚性愈傷組織 (×10); F. 球形胚(×10)。圖中黑色箭頭所示為正在分裂的細(xì)胞。圖A～C、F標(biāo)尺為100 μm;圖D標(biāo)尺為50 μm;圖E標(biāo)尺為200 μm

2.3.3 超微結(jié)構(gòu)特征 依據(jù)通過形態(tài)組織學(xué)特征劃分的體細(xì)胞胚發(fā)生不同階段,觀察大蒜體細(xì)胞胚發(fā)育不同階段在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)水平上的特征,結(jié)果見圖3。在愈傷組織形成階段,細(xì)胞高度液泡化,細(xì)胞核小且被擠到了一側(cè),細(xì)胞器種類少,細(xì)胞質(zhì)稀薄,局部有線粒體分布,細(xì)胞排列疏松,存在細(xì)胞間隙,為典型的薄壁細(xì)胞(圖3-A、3-B)。在初期胚性愈傷組織階段,細(xì)胞核大,細(xì)胞質(zhì)濃稠,細(xì)胞器比較豐富,原來的中央大液泡消失,出現(xiàn)較多的小液泡,存在大量線粒體,還觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細(xì)胞器,細(xì)胞之間有胞間連絲分布(圖3-C、3-D);在后期胚性愈傷組織階段,出現(xiàn)細(xì)胞核向細(xì)胞一端偏移的現(xiàn)象,另一端有大液泡的形成,細(xì)胞質(zhì)少且貼壁分布,細(xì)胞質(zhì)中有線粒體和前質(zhì)體存在(圖3-E、3-F)。在球形胚階段,細(xì)胞核大而明顯,有較多小液泡,細(xì)胞質(zhì)濃稠且有前質(zhì)體和較多線粒體的分布(圖3-G、3-H)。

A.愈傷組織(×700); B. 愈傷組織(×2 500); C. 初期胚性愈傷組織(×2 000); D. 初期胚性愈傷組織(×6 000); E. 后期胚性愈傷組織(×1 200); F. 后期胚性愈傷組織(×3 000); G. 球形胚(×500); H. 球形胚(×5 000);v. 液泡; n. 細(xì)胞核; m. 線粒體; g. 高爾基體; e. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng); p. 前質(zhì)體; pd. 胞間連絲

2.4 經(jīng)大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生途徑的試管鱗莖形成與植株生長(zhǎng)狀態(tài)

通過體細(xì)胞胚發(fā)生途徑獲得的再生植株(圖4-A),繼續(xù)培養(yǎng)90 d后,可形成試管鱗莖(圖4-B、4-C)。將試管鱗莖置于4 ℃冰箱冷藏30 d打破休眠,播種在經(jīng)過高壓滅菌的由草炭、珍珠巖、蛭石按2∶1∶1比例配制的復(fù)合基質(zhì)中。播種并澆足水,之后在基質(zhì)表面干燥時(shí)澆水,每隔7 d澆施1次營養(yǎng)液。播種15 d后進(jìn)行統(tǒng)計(jì),試管鱗莖的出芽率為70.73%;45 d后統(tǒng)計(jì),試管鱗莖苗(圖4-E)成活率為96.55%(表5)。

A.體細(xì)胞胚發(fā)生途徑形成的試管苗; B.試管鱗莖的形成; C.試管鱗莖; D.試管鱗莖萌發(fā); E.試管鱗莖苗的生長(zhǎng)

表5 大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生途徑獲得的試管鱗莖萌發(fā)成苗情況Table 5 Statistics on germination of garlic bulblets obtained by somatic embryogenesis

3 討 論

體細(xì)胞胚發(fā)生是大多數(shù)植物生命周期中的獨(dú)特過程,已成為植物生物技術(shù)的重要工具,主要應(yīng)用于商業(yè)化的大規(guī)模繁殖和作物改良[11]。植物體細(xì)胞胚發(fā)生可分為間接發(fā)生和直接發(fā)生兩種:前者是由外植體先形成胚性愈傷組織,再由胚性愈傷組織發(fā)育形成體細(xì)胞胚,是最常見的體細(xì)胞胚發(fā)生方式;后者是外植體不經(jīng)過愈傷組織階段而直接形成體細(xì)胞胚[12]。據(jù)報(bào)道,Sata等[13]通過直接發(fā)生途徑獲得了大蒜體細(xì)胞胚,而其他有關(guān)大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生的研究幾乎都是通過間接發(fā)生途徑。

生長(zhǎng)素被認(rèn)為是影響植物體細(xì)胞胚發(fā)生最關(guān)鍵的因素之一,許多植物體細(xì)胞胚發(fā)生的啟動(dòng)都需要外源添加生長(zhǎng)素類物質(zhì)。2,4-D是一種合成的生長(zhǎng)素,可強(qiáng)烈誘導(dǎo)細(xì)胞去分化,用于誘導(dǎo)胚性愈傷組織的2,4-D可以單獨(dú)使用或組合使用,這取決于植物的種類。在擬南芥中,單獨(dú)添加2,4-D可誘導(dǎo)形成胚性愈傷組織[14],大蒜胚性愈傷組織的誘導(dǎo)通常是2,4-D與KT或2,4-D與6-BA組合[15-17],施加2,4-D質(zhì)量濃度通常在1.0～4.0 mg/L。本研究利用2,4-D和KT組合誘導(dǎo)大蒜胚性愈傷組織,2,4-D質(zhì)量濃度在2.0和3.0 mg/L時(shí),大蒜胚性愈傷組織誘導(dǎo)效果較好,不同外植體之間略有差異。胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中施加2,4-D會(huì)增加培養(yǎng)物的內(nèi)源激素水平并使細(xì)胞產(chǎn)生氧化脅迫,從而誘導(dǎo)體細(xì)胞獲得胚胎發(fā)生能力[18]。另外,在香蕉[19]和郁金香[20]等植物中,PIC在其胚性愈傷組織的誘導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用,而2,4-D、PIC和NAA都被認(rèn)為影響百合胚性愈傷組織誘導(dǎo)的關(guān)鍵因素[21-22],本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PIC誘導(dǎo)大蒜胚性愈傷組織的效果不如2,4-D。

外植體是影響植物體細(xì)胞胚發(fā)生的又一個(gè)關(guān)鍵因素。本研究比較了多種大蒜外植體胚性愈傷組織誘導(dǎo)的差異,結(jié)果表明,大蒜 ‘二水早’ 的花序軸、鱗莖盤和發(fā)芽葉基均為較好的胚性愈傷組織誘導(dǎo)外植體,蒜瓣和氣生鱗莖無菌試管苗的根尖比根段和嫩葉更易誘導(dǎo)胚性愈傷組織。這可能與外植體的生理狀態(tài)和其響應(yīng)誘導(dǎo)條件的程度有關(guān),細(xì)胞分裂旺盛、內(nèi)源激素較多的部位較易獲得胚性愈傷組織[23]。大蒜外植體的選擇受其生育期影響較大,由于蒜薹的抽薹期比較短,所以在大蒜抽薹后,可以取大量花序軸用于胚性愈傷組織的誘導(dǎo)。當(dāng)收獲大蒜鱗莖后,則可以用鱗莖盤誘導(dǎo)胚性愈傷組織。然而,隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),蒜瓣中的營養(yǎng)物質(zhì)會(huì)不斷被消耗,鱗莖盤也隨之越來越薄,但發(fā)芽葉卻在蒜瓣貯藏過程中不斷形成,此時(shí)可以用發(fā)芽葉基替代鱗莖盤誘導(dǎo)胚性愈傷組織。雖然蒜瓣和氣生鱗莖的無菌試管苗根尖均有較高的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率,但其還需經(jīng)過試管苗的誘導(dǎo),步驟較繁瑣,而且根尖本身比較小,誘導(dǎo)形成的胚性愈傷組織相對(duì)較少。綜合分析認(rèn)為,花序軸、鱗莖盤和發(fā)芽葉基更適合作為誘導(dǎo)大蒜胚性愈傷組織的外植體。

形態(tài)學(xué)結(jié)合組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)特征觀察能對(duì)體細(xì)胞胚發(fā)生過程的研究更全面。體細(xì)胞胚間接發(fā)生途徑通常包含愈傷組織誘導(dǎo)、胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化、體細(xì)胞胚形成和發(fā)育、體細(xì)胞胚成苗等過程[28]。以大蒜花序軸為外植體,根據(jù)形態(tài)和組織學(xué)特征,本研究將體細(xì)胞胚發(fā)生早期過程劃分為外植體、愈傷組織、初期胚性愈傷組織、后期胚性愈傷組織和球形胚5個(gè)階段。通過觀察發(fā)現(xiàn),大蒜愈傷組織呈半透明狀態(tài),表面不光滑,組成愈傷組織的細(xì)胞為典型的薄壁細(xì)胞,符合愈傷組織的特點(diǎn)。大蒜胚性愈傷組織在外觀形態(tài)上呈顆粒狀,表面光滑,易與愈傷組織區(qū)分,與Fereol等[24]和程雅琪[17]所觀察到的大蒜胚性愈傷組織及與Ramakrishnan等[29]和Wu等[30]所觀察到的洋蔥胚性愈傷組織形態(tài)結(jié)果一致。本研究把胚性愈傷組織分為初期胚性愈傷組織和后期胚性愈傷組織兩個(gè)階段,石蠟切片和超微切片結(jié)果表明,初期胚性愈傷組織細(xì)胞核大而明顯,細(xì)胞器較豐富,出現(xiàn)較多的小液泡,局部有胞間連絲分布,與小麥[31]、棉花[32]和石刁柏[33]胚性細(xì)胞超微特征類似,豐富的細(xì)胞器有利于活躍的細(xì)胞代謝,胞間連絲在植物細(xì)胞發(fā)育、物質(zhì)運(yùn)輸和信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。后期胚性愈傷組織存在細(xì)胞核向一端偏移的現(xiàn)象,這些細(xì)胞可能之后會(huì)進(jìn)行不對(duì)稱分裂,分裂為頂細(xì)胞和基細(xì)胞,但它們都承襲胚性細(xì)胞的胚性[34]。球形胚具有大的細(xì)胞核,存在較多小液泡,細(xì)胞質(zhì)濃稠且有前質(zhì)體和較多線粒體的分布,可為體細(xì)胞胚的進(jìn)一步分裂與分化奠定基礎(chǔ)。植物體細(xì)胞胚發(fā)生過程與其合子胚發(fā)生類似,雙子葉植物體細(xì)胞胚發(fā)生大致經(jīng)歷原胚、球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉形胚階段。單子葉植物只有一片子葉,在球形胚之后,一般不再形成心形胚和魚雷形胚,但不同種類單子葉植物具有各自的發(fā)育特征,如唐菖蒲[35]、菠蘿[36]和白鶴芋[37],其體細(xì)胞胚發(fā)育過程也有差異。本研究觀察到大蒜球形胚可以繼續(xù)發(fā)育形成梨形胚和子葉形胚,最后萌發(fā)成具有根和葉的完整植株。

4 結(jié) 論

大蒜花序軸、鱗莖盤、發(fā)芽葉基均為誘導(dǎo)大蒜胚性愈傷組織的適宜外植體,用于胚性愈傷組織誘導(dǎo)的最適宜2,4-D質(zhì)量濃度分別為3.0、2.0、2.0和3.0 mg/L,誘導(dǎo)率分別為82.22%、 89.21%、82.52%和83.40%。在2,4-D 0.25 mg/L+ 6-BA 0.5 mg/L條件下,體細(xì)胞胚的萌發(fā)系數(shù)最高,達(dá)35.56個(gè)/g。以花序軸為外植體,根據(jù)形態(tài)和組織學(xué)特征,可將大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生早期過程劃分為外植體、愈傷組織、初期胚性愈傷組織、后期胚性愈傷組織和球形胚5個(gè)階段,各階段具有各自典型特征。球形胚可繼續(xù)發(fā)育形成梨形胚、子葉形胚,最后萌發(fā)成小植株。由大蒜體細(xì)胞胚萌發(fā)形成的植株,培養(yǎng)90 d后可形成試管鱗莖,將其播種在由草炭、珍珠巖、蛭石按2∶1∶1體積比配制的復(fù)合基質(zhì)中,試管鱗莖的萌發(fā)率為70.73%,試管鱗莖苗的成活率達(dá)96.55%。