王丹丹,宋 潔,王 旭,樂海梅

(遼東學院 鴨綠江流域研究院,遼寧丹東 118000)

細鱗魚(BrachymystaxlenokPallas)又稱細鱗鮭,是中國名貴的鮭科冷水經濟魚類,隸屬于鮭形目(Salmoniformes)鮭科(Salmonidae)細鱗魚屬(Brachymystax)。生長速度快,肉質細嫩,脂肪含量高,無肌間刺,營養(yǎng)價值較高;主要分布于中國東北的黑龍江、鴨綠江、牡丹江、松花江、嫩江及其支流等。近年來,由于漁業(yè)資源過度開發(fā)利用、環(huán)境污染、外來魚種引入以及河流水量減少等因素,使細鱗魚自然繁殖受到影響而數量銳減,1998年,細鱗魚被列入《中國瀕危動物紅皮書》,為國家二級重點保護水生野生動物[1]。當生存壓力超出細鱗魚生長發(fā)育的可塑范圍時,只有盡可能保護其遺傳多樣性,建立具有一定數量可利用的遺傳多樣性數據庫,才有可能改變細鱗魚的瀕危狀態(tài)[2-3]。所以,掌握細鱗魚遺傳多樣性與選育優(yōu)良品種是減少其野生資源過度開發(fā),實現細鱗魚資源可持續(xù)利用與長期保護的有效途徑。

線粒體為真核細胞中雙層膜棒狀或粒狀的半自主性細胞器﹐為能量產生的主要場所。線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)基因組為共價閉合雙鏈環(huán)狀DNA,具母系遺傳、結構簡單穩(wěn)定、基本不發(fā)生重組、變異率高、進化速度快以及多態(tài)性高等特點,是研究群體遺傳變異與遺傳結構、系統進化和動物保護生物學的重要分子標記[4]。動物mtDNA由編碼區(qū)和非編碼區(qū)組成,細胞色素b基因(Cytochrome b,Cytb)位于編碼區(qū),進化速度適中,在mtDNA 的13個蛋白質編碼基因中其結構和功能較保守,富含種內或種間甚至科屬間的遺傳進化信息,適用于種間和種內遺傳結構及遺傳多樣性的研究[5];D-loop 區(qū)為mtDNA控制區(qū),位于非編碼區(qū),因缺乏編碼的自然選擇壓力而進化速率快于其他線粒體基因,串聯重復序列較多,堿基變異率高于編碼區(qū),富含系統發(fā)育信息,可根據非編碼區(qū)的序列差異對親緣關系較近的物種種內或種間進行系統進化關系和遺傳多樣性研究[6]。劉偉等[7]基于線粒體 D-loop區(qū)和Cytb基因序列對四川裂腹魚養(yǎng)殖群體進行遺傳多樣性研究;李大命等[8]基于線粒體Cytb基因和D-loop區(qū)序列對高郵湖湖鱭進行遺傳多樣性分析;Zhao等[9]采用線粒體Cytb基因和D-1oop區(qū)對河西走廊流域的祁連山裸鯉進行群體遺傳結構分析;代應貴等[10]為保護四川裂腹魚烏江種群及其遺傳多樣性而基于mtDNA D-loop區(qū)對四川裂腹魚烏江種群進行遺傳多樣性分析;郭丹丹等[11]基于線粒體Cytb基因和 D-loop區(qū)對舟山野生與養(yǎng)殖小黃魚群體遺傳多樣性進行研究;麻智芳等[12]基于mtDNA D-Loop區(qū)和Cytb基因對清水江斑鱖群體遺傳多樣性進行了分析;余科等[13]基于Cytb和D-Loop基因對中國少鱗鱖種群遺傳多樣性的進行分析?？梢?Cytb基因和 D-loop區(qū)已成為魚類系統進化、群體遺傳結構與遺傳多樣性研究中重要的分子標記技術。

目前,由于細鱗魚物種的保護愈發(fā)被重視,細鱗魚遺傳多樣性研究成為熱點。專家分別采用不同標記技術對中國不同海域細鱗魚的遺傳結構進行了分析,但成果較少,王荻等[14]采用AFLP對牡丹江、鴨綠江和烏蘇里江的3個細鱗魚野生種群進行遺傳多樣性分析;閆春梅等[15]采用微衛(wèi)星分子標記技術對中國東北部山區(qū)細鱗魚4個群體遺傳多樣性分析進行了調查研究。目前,對鴨綠江流域(丹東段)細鱗魚野生群體遺傳多樣性,以及野生群體和養(yǎng)殖群體遺傳多樣性的比較分析尚未見報道。因此,本研究基于線粒體Cytb基因和 D-loop 區(qū)序列對鴨綠江流域(丹東段)2個野生群體,即寬甸(KD)和丹東市(DD),和1個養(yǎng)殖群體(YZ)進行遺傳結構、遺傳多樣性及其親緣關系比較研究,不但從分子水平上可豐富中國鴨綠江流域細鱗魚群體遺傳多樣性數據庫資源,而且對細鱗魚種質資源保護、遺傳育種、健康養(yǎng)殖以及合理開發(fā)利用提供了依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以細鱗魚為試驗材料,野生群體分別采集于鴨綠江流域寬甸(KD)和丹東市(DD)2個不同地域,從當地漁民或者垂釣者收購細鱗魚;1個人工養(yǎng)殖群體(YZ)采于丹東細鱗魚養(yǎng)殖基地,每個群體隨機采集30尾,剪取細鱗魚新鮮鰭條組織置于液氮中固定保存。

1.2 Cytb 基因與D-loop區(qū)序列克隆與測序

表1 引物信息Table 1 Information of primers

1.3 Cytb 基因與D-loop區(qū)序列數據處理

將測序后的Cytb基因和D-loop區(qū)序列采用DNA Star 5.0軟件中的Edit Seq讀取,以SeqMan進行序列拼接、編輯, DNAMAN 8.0和Clustal X 1.83對獲得的細鱗魚Cytb基因和 D-loop區(qū)序列進行多重比較、截取同源序列,并人工校對保留有效片段、確保準確性。采用BioEdit 7.0統計校正后的3個細鱗魚群體Cytb基因和 D-loop區(qū)序列4種堿基組成,采用MEGA 7.0鄰接法(Neighbor-Joining,NJ)構建3個細鱗魚群體單倍型間的系統進化樹(1 000次抽樣,Bootstraps檢驗進化樹置信度),以Kimura-2-parameter模型計算遺傳距離[18]。利用Arlequin 3.5進行差異性分子方差顯著性檢驗(AMOVA),計算群體間遺傳分化指數(F-statistics,Fst)。利用DNA SP 6.0對3個細鱗魚群體的Cytb和D-loop序列進行單倍型和遺傳多樣性分析,運算分析樣本的多態(tài)位點數(S)、單倍型數(H)、單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(Pi)、平均核苷酸差異數(K)、Tajima’sD、Fu and Li’sF和基因流(Nm)等參數,統計單倍型在3個細鱗魚群體中的分布[19]。

2 結果與分析

2.1 細鱗魚線粒體 Cytb 基因和 D-Loop區(qū)堿基組成

經基因克隆、測序、拼接以及多重比對,最終獲得3個群體90尾細鱗魚個體的Cytb基因和D-loop區(qū)同源序列。結果表明(表2):Cytb基因同源序列長度為1 141 bp,其中A、T、G、C 4種堿基所占比值分別為24.8%、28.75% 、15.25%和31.20%,A+T含量53.55%,G+C含量 46.45%,Cytb基因密碼子第1位上4種堿基出現頻率差異較小,第2位上出現明顯偏倚,T(40%)而G(13.9%),第3位C(41.3%)和A(31.1%)出現頻率明顯高于T(22.9%)和G (4.7%);D-loop區(qū)序列通過比對獲得的同源序列長度988 bp,其中A、T、G、C,4種堿基所占比值分別為31.98%、30.77% 、14.27%和 22.98%,其中A+T含量62.75%,G+C含量 37.25%,D-loop區(qū)序列密碼子表現出明顯的偏倚性,密碼子3個位點中A、T和C的頻率明顯高于G;可見,Cytb基因和D-loop區(qū)同源序列堿基平均含量A+T均高于G+C,D-loop區(qū)序列比Cytb基因更具堿基偏倚性,與硬骨魚類線粒體基因的堿基組成相一致。

表2 Cytb 基因與D-loop序列堿基組成Table 2 Base composition of Cytb gene and D-loop sequence

2.2 細鱗魚群體遺傳多樣性分析

3個細鱗魚群體基于Cytb基因共確定42個多態(tài)位點(S),21種單倍型(H),單倍型多樣性(Hd)0.986,核苷酸多樣性(Pi)0.004 66以及平均核苷酸差異數(K)4.828。其中細鱗魚養(yǎng)殖與野生群體相較,YZ群體S(11)、H(6)、Hd(0.807)、Pi(0.002 53)和K(4.020)均低于KD群體(S=19,H= 14,Hd=0.991,Pi=0.004 21,K= 4.941)和 DD群體(S=12,H= 10,Hd= 0.987,Pi=0.003 08,K= 5.211);而兩個野生群體中,KD群體S、H、Hd、Pi與K數據均高于DD群體(表1、表2)。D-loop區(qū)共確定56個多態(tài)位點(S),26種單倍型(H),單倍型多樣性(Hd) 0.981,核苷酸多樣性(Pi)0.019 82以及平均核苷酸差異數(K)7.690。其中細鱗魚養(yǎng)殖與野生群體相較,YZ群體S(13)、H(10)、Hd(0.843)、Pi(0.010 26)和K(7.690)同樣均低于KD群體(S=24,H= 16,Hd=0.998,Pi= 0.020 17,K= 7.861)和 DD群體(S=19,H=15,Hd=0.991,Pi=0.018 95,K= 7.494);而兩個野生群體中,KD群體S、H、Hd、Pi與K數據同樣均高于DD群體(表3、表4)。綜上所述,3個細鱗魚群體為單倍型多樣性較高的群體(Hd> 0.5),其中養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性較野生群體略低,而KD群體遺傳多樣性最高,DD群體次之?？梢?鴨綠江流域(丹東段)細鱗魚群體遺傳多樣性總體表現出較高的單倍型多樣性和核苷酸多樣性的模式(Hd>0.5,Pi> 0.005),表明該地域細鱗魚群體的多樣性程度較高,即KD>DD>YZ。

表3 3個細鱗魚群體 Cytb 基因與D-loop序列群體遺傳多樣性參數Table 3 Genetic diversity parameters in mtDNA Cytb gene and D-loop region sequence of three populations of B.lenok

表4 Cytb 基因與D-loop區(qū)單倍型的群體分布Table 4 Population distribution of Cytb gene and D-loop sequence haplotypes

2.3 細鱗魚群體中性檢驗

中性檢驗是檢測物種群體歷史動態(tài)擴增事件的一種較為準確的方法(圖1)?；?個細鱗魚群體的線粒體Cytb基因和D-loop區(qū)序列中性檢驗的Tajima’sD值和Fu and Li’sF值均為負數(P<0.05),KD和DD群體Cytb基因中性檢驗的Tajima’sD值和Fu and Li’sF值顯著偏離中性(P<0.05);核苷酸不配對分析顯示,基于細鱗魚線粒體Cytb基因KD群體呈現單峰模式,檢測出群體擴張,而DD 和YZ群體則呈現多峰模式,表明可能未出現群體擴張現象;而基于D-loop區(qū)序列3個細鱗魚群體均呈現多峰模式,并未出現單峰“泊松分布”,符合中性進化的假設,未檢測到群體擴張。綜上所述,鴨綠江流域(丹東段)細鱗魚KD和DD群體可能經歷過群體擴張事件,隨后處于相對平衡穩(wěn)定狀態(tài)。

圖1 3個細鱗魚群體 Cytb 基因和D-loop區(qū)序列核苷酸錯配分析Fig.1 Nucleotide mismatch analysis of Cytb and D-loop of three populations of B.lenok

2.4 細鱗魚群體遺傳分化

基于細鱗魚3個群體間Cytb基因序列獲得的遺傳距離(表5,表6)顯示, KD、DD和YZ細鱗魚群體內遺傳距離為0.005 3～0.008 2,差異較小; 3個細鱗魚群體KD和DD、KD和YZ、DD和YZ遺傳距離分別為0.006 7、0.005 8和 0.006 1;細鱗魚KD和DD,KD和YZ,DD和 YZ群體間遺傳分化指數(Fst)分別為0.012 11, 0.063 39和0.078 78,其中KD和YZ,DD和 YZ遺傳分化指數大于0.25,表明群體間分化達到極顯著水平 (P<0.001);細鱗魚KD和DD,KD和YZ,DD和 YZ群體間基因流(Nm)分別為 1.341,0.197和0.301(表7);3個細鱗魚KD,DD和YZ群體內基于D-loop區(qū)序列的遺傳距離為0.011 8～ 0.014 7,差異較小;群體間KD和DD,KD和YZ,DD和YZ遺傳距離分別為0.016 1,0.015 6和 0.014 7;KD和DD,KD和YZ,DD和 YZ群體間Fst分別為-0.001 99,0.090 12, 0.053 67,KD和YZ,DD和 YZ群體間遺傳分化指數大于 0.25,表明群體間分化達到極顯著水平(P< 0.001);細鱗魚KD和DD,KD和YZ,DD和 YZ群體間基因流分別為0.975,0.356和 0.255,可見野生與養(yǎng)殖群體間基因交流較弱。AMOVA結果分析顯示,基于Cytb基因群體間變異為整體變異的26.62% ,群體內變異占 73.38%(表8);基于細鱗魚D-loop 區(qū)序列,群體間變異占整個變異的14.09%,群體內變異占整個變異的 85.91%。綜上所述,細鱗魚3個群體的遺傳變異幾乎全部來源于群體內。

表5 群體遺傳分化與遺傳距離Table 5 Population genetic differentiation and genetic distances

表6 群體內遺傳距離Table 6 Population genetic differentiation and genetic distances

表7 細鱗魚群體間基因流Table 7 The gene flow among Brachymystax lenok populations

表8 分子方差分析(AMOVA)Table 8 Analysis of molecular variances(AMOVA)

2.5 細鱗魚單倍型系統發(fā)育樹

采用Mega 7.0鄰接法(Neighbor-Joining,NJ)分別基于3個細鱗魚群體的Cytb基因和D-loop區(qū)單倍型構建系統發(fā)育樹(圖2)。結果表明,3個細鱗魚KD、DD及YZ群體均未呈現較顯著的地理聚集且群體間單倍型相互交叉?；贑ytb基因的21個單倍型中,Hap1、Hap3、Hap8、Hap11、Hap14和Hap15為優(yōu)勢單倍型,3個群體均具3個單倍型Hap5、Hap11和Hap14,7個為KD群體特有單倍型Hap2、Hap4、Hap10、Hap12、Hap13、Hap17、Hap18,3個為DD群體特有單倍型Hap8、Hap9和Hap19,3個為YZ群體特有單倍型Hap6、Hap7和Hap21,KD和DD群體具有4個相同單倍型Hapl、Hap3、Hap15和Hap16。基于D-loop區(qū)序列的26個單倍型中,Hap2、Hap13、Hap15、Hap21和Hap24為優(yōu)勢單倍型,3個群體均具2個單倍型Hap21和Hap24,4個為KD群體特有單倍型Hap1、Hap12和Hap19、Hap20,4個為DD群體特有單倍型Hap6、Hap7、Hap9、Hap10,3個為YZ群體特有單倍型Hap14、Hap16和Hap25,KD和DD群體具有8個相同單倍型Hap2、Hap4、Hap8、Hap 11、Hap13、Hap22、Hap23,KD和YZ群體具有2個相同單倍型Ha15和Hap26,DD和YZ群體具有2個相同單倍型Ha5和Hap17。

圖2 基于 Cytb 基因單倍型序列的細鱗魚群體系統發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on haplotype sequences of Cytb gene and D-loop region sequence of Brachymystax lenok

3 討 論

3.1 遺傳多樣性

遺傳多樣性,又稱基因多樣性,是指生物群體間和群體內遺傳變異的總和,是物種進化以及評判物種對生存環(huán)境適應能力、生存能力以及進化潛力的依據。遺傳多樣性水平較低會造成物種衰退或瀕臨滅絕,反之,能夠為物種進化提供充足的潛力,以保證物種的持續(xù)發(fā)展。單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)是衡量群體遺傳多樣性的重要指標,根據Was等[20]Hd為0.5和Pi為0.005為臨界標準,二者數值越大反映生物群體的遺傳多樣性越高。鴨綠江流域(丹東段)細鱗魚群體mtDNACytb基因和D-Loop區(qū)的Hd和Pi分別為0.986、0.981和0.004 66、0.019 82,可見Cytb基因為高Hd和低Pi,而D-Loop區(qū)屬高Hd和低Pi,說明鴨綠江流域(丹東段)細鱗魚群體是一個大而穩(wěn)定的群體,經歷長時間的生物演化而積累了豐富的遺傳多樣性。縱觀整體,細鱗魚D-Loop區(qū)遺傳多樣性明顯高于Cytb基因,該差異可能是由于D-loop區(qū)位于非編碼區(qū),因缺乏編碼的自然選擇壓力而較Cytb等其他線粒體基因的進化速率更快,所以,關于細鱗魚群體遺傳多樣性分析,D-loop區(qū)序列的靈敏度遠高于Cytb基因,但同時D-loop區(qū)序列的變異速率要低于Cytb基因,如郭丹丹等[11]對90尾小黃魚的3個群體進行遺傳多樣性研究中,Cytb基因的Hd(0.980)>D-Loop 區(qū)(0.978)。綜上所述,由于細鱗魚mtDNA進化速率隨區(qū)域不同而具有差異,所以采用細鱗魚mtDNA不同區(qū)域分析遺傳多樣性存在差異性。此外,基于細鱗魚群體Cytb基因和 D-loop區(qū)序列分析發(fā)現,YZ群體的Hd和Pi略低于KD和DD群體,且KD和DD 2個野生群體比較,KD群體的Hd和Pi高于DD群體,可見細鱗魚野生群體的多樣性略高于養(yǎng)殖群體,遺傳多樣性KD>DD>YZ,該結果與大獺蛤[21]的研究結果一致。

3.2 遺傳分化

常用遺傳距離、基因流和遺傳分化指數衡量群體間的遺傳分化程度。細鱗魚群體基于Cytb基因獲得群體間遺傳距離KD和DD為0.006 7,KD和YZ為0.005 8,DD和YZ為0.006 1,基于D-loop區(qū)序列獲得的群體間遺傳距離KD和DD為0.016 1,KD和YZ為0.015 6,DD和YZ為0.014 7;基于D-loop區(qū)序列分析KD、DD 和YZ群體內遺傳距離(分別為0.012 6、0.014 7和 0.011 8)遠大于基于Cytb基因獲得的遺傳距離 (0.008 2、0.007 6和0.005 3),可能是由于細鱗魚群體mtDNA 的Cytb基因和D-Loop區(qū)序列進化速度不同而導致變異的差異性,但細鱗魚無論群體間或群體內的遺傳距離均十分相近,且遠低于2%的群體間遺傳分化界限,說明鴨綠江流域(丹東段)細鱗魚群體并未發(fā)生明顯的遺傳分化現象。遺傳分化指數為0～0.05,表示群體間遺傳分化極小;0.05～0.15,表示群體間遺傳分化中度;0.15～0.25,表示群體間遺傳分化較高。本試驗中基于Cytb基因和D-Loop區(qū)序列,KD和DD群體間遺傳分化指數均小于0.05,說明細鱗魚兩個野生群體間遺傳分化程度非常小,而KD和YZ、DD和YZ細鱗魚群體間遺傳分化指數均為0.05～0.15,說明鴨綠江流域(丹東段)細鱗魚養(yǎng)殖群體與野生群體間遺傳分化程度為中度,且該流域的細鱗魚野生群體間存在較為頻繁的基因交流,表明KD和DD區(qū)域修建水力發(fā)電站尚未對細鱗魚種質資源交流產生顯著影響,但野生群體與養(yǎng)殖群體間基因交流甚少,與厚殼貽[22]的研究結果一致。AMOVA分析發(fā)現,群體內變異是鴨綠江流域(丹東段)細鱗魚遺傳變異的主要來源。系統進化分析方面,由細鱗魚Cytb基因和 D-loop區(qū)的單倍型構建系統發(fā)育樹表明3個細鱗魚群體間的單倍型并未表現出明顯的地理聚集并且相互有交叉,充分說明該地域的3個細鱗魚群體間遺傳分化尚不顯著,與遺傳分化研究結果一致,且與李珊[23]的清水江斑鱖群體遺傳多樣性分析的結論一致。

3.3 群體歷史動態(tài)

群體歷史動態(tài)分析方面,核苷酸不配對分析和Tajima’sD和Fu and Li’sF中性檢驗是判斷生物群體是否發(fā)生過種群擴張較為準確的種群動態(tài)檢測方法。其中當核苷酸不配對分布曲線呈明顯的單峰形“泊松分布”時,表明群體歷史有可能經歷過擴張,而Tajima’sD和Fu and Li’sF二者數值為負且具有顯著差異時,亦說明群體經歷過群體擴張。本研究核苷酸不配對分析顯示,基于細鱗魚線粒體Cytb基因KD群體呈單峰模式,檢測出群體擴張的情況,而DD 和YZ群體則呈現多峰模式,表明可能未出現群體擴張現象;而基于D-loop區(qū)序列3個細鱗魚群體均呈現多峰模式,并未出現單峰“泊松分布”,符合中性進化的假設,未檢測到群體擴張;線粒體Cytb基因和 D-loop區(qū)序列中性檢驗的Tajima’sD值和Fu and Li’sF值均為負(P<0.05),其中KD和DD群體Cytb基因中性檢驗的Tajima’sD值和Fu and Li’sF值顯著偏離中性(P<0.05)。綜上所述,鴨綠江流域(丹東段)細鱗魚KD和DD群體可能經歷過群體擴張事件,隨后處于相對平衡穩(wěn)定狀態(tài),與喬氏新銀魚[24]、河髻[25]和大銀魚[26]的研究結果一致。

4 結 論

鴨綠江流域(丹東段)細鱗魚群體遺傳多樣性較高,雖朝著不同譜系進化,但3個群體分化不明顯,尚未形成顯著的地理聚集格局。細鱗魚野生群體間的遺傳分化程度略低,經過長期的人為馴化,細鱗魚的養(yǎng)殖群體和野生群體間遺傳分化中度水平。高Hd和高Pi表明一個大而穩(wěn)定的群體經過長時間演化所產生或是兩個不同系群的群體二次接觸,Hd和Pi的變異均低,意味著最近發(fā)生過種群的瓶頸效應或由單一、少數種群所產生的建立者效應;高Hd而低Pi,預示著群體曾經歷過瓶頸效應后,伴隨迅速的種群擴張與變異積累。本研究中鴨綠江流域(丹東段)細鱗魚群體遺傳多樣性總體表現出較高的單倍型多樣性和核苷酸多樣性的模式(Hd>0.5,Pi>0.005),表明該流域細鱗魚群體的多樣性程度較高,但養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性低于野生群體,可能是由于細鱗魚養(yǎng)殖群體近期發(fā)生了瓶頸效應,所以,這就要求在細鱗魚選育過程中及時補充不同群體或野生群體的優(yōu)良性狀,杜絕近親繁殖以及瓶頸效應等,保持細鱗魚選育群體的遺傳多樣性。此外,鴨綠江流域(丹東段)細鱗魚群體單倍型組成呈現不均勻現象,其中細鱗魚優(yōu)勢單倍型個體適應環(huán)境能力較強且擁有較大的繁殖群體,而低頻率單倍型因其適應環(huán)境能力較差而導致繁殖群體較小,較容易對整個鴨綠江流域(丹東段)細鱗魚種群的遺傳多樣性造成負面影響。因此,未來仍需持續(xù)加強對細鱗魚種質資源保護,通過限制人為捕撈、改善江水生態(tài)環(huán)境、加強細鱗魚資源動態(tài)變化監(jiān)測等措施增加鴨綠江流域(丹東段)細鱗魚資源量和遺傳多樣性水平,改善細鱗魚遺傳結構,為該流域細鱗魚的遺傳育種和持續(xù)發(fā)展做出貢獻。