井一淑,吳 丹,燕 茹,潘 璐,馬學(xué)平,馬 鑫,萬(wàn)富鑫 ,劉姝靖 ,蘇秀麗 ,杜 歡 ,王 琴*

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,寧夏 銀川 750004;2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心臟中心功能檢查部, 3.心內(nèi)科,寧夏 銀川 750004)

肥胖患者體內(nèi)各種內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)可激活NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白 3(NOD-like receptor pyrin domain-containing protein 3, NLRP3)炎癥小體而生成白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)等,促進(jìn)炎癥反應(yīng)并造成組織損傷[1]。皮質(zhì)抑素為環(huán)狀神經(jīng)肽,具有強(qiáng)大的抗炎作用[2-5]。超聲生物顯微鏡(ultrasound biomicroscopy, UBM)是一種新型高頻超聲檢查儀,可較精確地評(píng)估小動(dòng)物心臟結(jié)構(gòu)及功能。本研究采用UBM觀察應(yīng)變技術(shù)檢測(cè)肥胖小鼠心肌損傷,以及皮質(zhì)抑素減輕該損傷的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取48只6周齡雄性C57BL/6小鼠,體質(zhì)量20～30 g[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SCXK(寧)2020-0001],適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)獲寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(IACUC-NYLAC-2022-044)。

1.2 主要試劑及儀器 皮質(zhì)抑素-14(MCE,HY-P1932),NLRP3 抗體(Abmart,T55651),半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1, Caspase-1)抗體(Abmart,M025280S);小鼠白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒(Abmart,AB-J0247B);UBM(VisualSonics,Vevo2100),熒光顯微鏡(Olympus,BX43)及透射電鏡(Hitachi,H7650)。

1.4 UBM檢測(cè) 以2%異氟烷麻醉小鼠,胸部脫毛、備皮后保定于檢查臺(tái),控制其心率為400～500次/分[6]。采用UBM配置的MS-400探頭(頻率30 MHz,帶寬18～38 MHz,縱向及橫向分辨率分別為50及110 μm)進(jìn)行掃查,獲得室間隔舒張末期厚度(interventricular septal thickness at end-diastolic, IVSD)、室間隔收縮末期厚度(interventricular septal thickness at end-systolic, IVSS)、左心室后壁舒張末期厚度(left ventricular posterior wall end-diastolic thickness, LVPWD)、左心室后壁收縮末期厚度(left ventricular posterior wall end-systolic thickness, LVPWS)、左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter, LVEDD)、左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter, LVESD)、左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)、左心室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening, LVFS)、二尖瓣口舒張?jiān)缙谘魉俣?mitral early diastolic velocity, E)及舒張晚期血流速度(mitral lately diastolic velocity, A),并計(jì)算E/A。采用應(yīng)變技術(shù)定量分析軟件(VisualSonics,Vevo LAB 5.5.0)分別于左心室長(zhǎng)軸切面和乳頭肌左心室短軸切面描記心內(nèi)、外膜,獲取左心室心肌整體縱向應(yīng)變、整體徑向應(yīng)變及整體圓周應(yīng)變參數(shù)。以上參數(shù)均由同一醫(yī)師(醫(yī)師1)進(jìn)行測(cè)量,取連續(xù)3個(gè)心動(dòng)周期的平均值作為結(jié)果;之后隨機(jī)選取10只小鼠,間隔2周后分別由醫(yī)師1及另一醫(yī)師(醫(yī)師2)進(jìn)行測(cè)量,將結(jié)果用于重復(fù)性檢驗(yàn)。

1.5 透射電鏡觀察 麻醉狀態(tài)下以頸椎脫臼法處死小鼠,分離心臟后取左心室前壁心肌1 mm×1 mm×3 mm制成超薄切片,以透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)。

1.6 免疫熒光染色 將小鼠心肌組織制成石蠟切片,經(jīng)脫蠟、0.5%Triton-100孵育、過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、抗原修復(fù)、血清封閉、一抗(1∶100)、二抗(1∶100)、麥胚凝集素(wheat germ agglutinin, WGA)(1∶250)及DAPI封片拍照后觀察其N(xiāo)LRP3、Caspase-1炎癥因子表達(dá)水平,并以ImageJ軟件定量評(píng)估平均熒光強(qiáng)度。

1.7 檢測(cè)IL-1β 于處死小鼠前摘眼球取血,室溫下靜置1 h后以3 000 r/min離心10 min,取上清液;采用ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠血清IL-1β表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。以±s表示正態(tài)分布的計(jì)量資料,采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行多組間及兩組間比較。以組內(nèi)相關(guān)系數(shù)(intra-class correlation coefficient, ICC)評(píng)價(jià)觀察者間及觀察者內(nèi)一致性:ICC>0.75為一致性好。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

肥胖組12只、皮質(zhì)抑素組10只小鼠造模成功。

2.1 常規(guī)心臟超聲參數(shù) 3組小鼠常規(guī)心臟超聲參數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),見(jiàn)表1。

表1 肥胖組、皮質(zhì)抑素組及正常組小鼠常規(guī)心臟超聲指標(biāo)比較

2.2 心臟應(yīng)變參數(shù) 3組小鼠心臟應(yīng)變參數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。相比正常組及皮質(zhì)抑素組,肥胖組小鼠整體縱向、徑向及圓周應(yīng)變均減低(P均<0.05)。見(jiàn)圖1及表2。

圖1 小鼠心臟應(yīng)變超聲圖像 A.肥胖組整體縱向應(yīng)變; B.皮質(zhì)抑素組整體縱向應(yīng)變; C.正常組整體縱向應(yīng)變; D.肥胖組整體圓周應(yīng)變; E.皮質(zhì)抑素組整體圓周應(yīng)變; F.正常組整體圓周應(yīng)變

表2 肥胖組、皮質(zhì)抑素組及正常組小鼠心臟應(yīng)變指標(biāo)比較

2.3 透射電鏡 肥胖組小鼠心肌內(nèi)見(jiàn)大量脂滴,肌原纖維排列不整齊,局部斷裂溶解,線(xiàn)粒體增生、聚集成團(tuán);皮質(zhì)抑素組肌原纖維排列尚整齊,未見(jiàn)局部斷裂溶解,線(xiàn)粒體數(shù)量結(jié)構(gòu)正常;正常組肌原纖維排列整齊,肌節(jié)Z線(xiàn)清晰平直,線(xiàn)粒體數(shù)量結(jié)構(gòu)正常。見(jiàn)圖2。

圖2 小鼠心肌透射電鏡圖 A.肥胖組; B.皮質(zhì)抑素組; C.正常組 (上排放大倍數(shù)為×5 000,下排為×20 000;N:細(xì)胞核,Mi:線(xiàn)粒體,Mf:肌原纖維,箭:脂滴,*:肌原纖維局部斷裂溶解)

2.4 免疫熒光染色 肥胖組小鼠心肌內(nèi)NLRP3、Caspase-1炎癥因子表達(dá)均高于皮質(zhì)抑素組及正常組(P均<0.05)。見(jiàn)圖3。

2.5 IL-1β水平 肥胖組、皮質(zhì)抑素組及正常組小鼠血清IL-1β水平分別為(8.49±1.43)pg/ml、(6.64±1.52)pg/ml及(5.28±1.46)pg/ml,3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.17,P=0.01);肥胖組IL-1β水平高于皮質(zhì)抑素組和正常組(P均<0.05)。

2.6 重復(fù)性檢驗(yàn) 觀察者間及觀察者內(nèi)測(cè)量整體縱向應(yīng)變、整體徑向應(yīng)變及整體圓周應(yīng)變結(jié)果的一致性均好(ICC均>0.75)。

3 討論

NLRP3炎癥小體由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD, ASC)和前Caspase-1(pro-Caspase-1)組成,可通過(guò)促進(jìn)免疫/炎癥反應(yīng),介導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死、心肌纖維化、心肌血管重塑等,降低心臟收縮和舒張功能[7-8]。肥胖患者體內(nèi)存在多種內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào),可激活NLRP3炎癥小體,切割生成具有活性的IL-1β等,促進(jìn)炎癥反應(yīng)[9]。干預(yù) NLRP3炎癥小體激活可能為防治肥胖人群心肌損傷的新靶點(diǎn)。

皮質(zhì)抑素是生長(zhǎng)抑素家族中的環(huán)狀神經(jīng)肽類(lèi)物質(zhì),在關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、肺炎和膿毒癥等中發(fā)揮強(qiáng)大抗炎作用[2-5];同時(shí),作為新型心血管保護(hù)肽,對(duì)多種心血管疾病具有重要保護(hù)作用[10]。

UBM可實(shí)時(shí)、清晰顯示小動(dòng)物心臟及大血管等結(jié)構(gòu),并進(jìn)行精確測(cè)量及多樣數(shù)據(jù)后處理。心肌應(yīng)變指心肌組織在單位時(shí)間內(nèi)相對(duì)于其原始形狀的變形程度,是UBM檢測(cè)心肌功能的新指標(biāo)。斑點(diǎn)追蹤應(yīng)變技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于無(wú)角度依賴(lài)性、可進(jìn)行分層或節(jié)段心肌功能評(píng)估[11],較常規(guī)超聲更為靈敏[12-13]。利用應(yīng)變定量分析軟件對(duì)UBM圖像進(jìn)行后處理,以斑點(diǎn)追蹤技術(shù)追蹤心肌組織內(nèi)微小回聲斑點(diǎn)的運(yùn)動(dòng),可獲得應(yīng)變等力學(xué)參數(shù)。本團(tuán)隊(duì)前期研究[14-15]已證實(shí)應(yīng)變技術(shù)對(duì)檢出肥胖小鼠早期心肌損傷具有重要意義。本研究3組小鼠常規(guī)超聲指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而肥胖組整體縱向應(yīng)變、整體徑向應(yīng)變及整體圓周應(yīng)變均較其他2組減低,且電鏡結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)肥胖組小鼠心肌存在超微結(jié)構(gòu)損害,提示應(yīng)變技術(shù)能較常規(guī)超聲更敏感地發(fā)現(xiàn)左心室心肌損傷,與ZHANG等[16-17]的結(jié)果一致。

同時(shí),本研究中,相比肥胖組,皮質(zhì)抑素組小鼠心肌超微結(jié)構(gòu)損傷得到明顯改善,整體應(yīng)變參數(shù)亦高于肥胖組,表明皮質(zhì)抑素對(duì)于心肌損傷具有保護(hù)作用。ZHANG等[18]研究表明,皮質(zhì)抑素可消除膿毒癥對(duì)NLRP3、ASC及Caspase-1蛋白表達(dá)激活的影響,抑制IL-1β釋放,從而減輕心肌損傷。本研究亦發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)抑素可抑制肥胖對(duì)NLRP3和Caspase-1表達(dá)激活的影響及IL-1β釋放,提示皮質(zhì)抑素對(duì)肥胖小鼠的心肌保護(hù)作用與其抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β有關(guān)。

綜上,UBM應(yīng)變技術(shù)可有效檢出肥胖小鼠早期心肌損傷,而皮質(zhì)抑素能減輕該損傷。本研究未設(shè)立不同皮質(zhì)抑素濃度梯度組以深入探討皮質(zhì)抑素的抗炎作用,有待后續(xù)加以完善。