吳煒清,楊代和

(福建省福建中醫(yī)藥附屬第二人民醫(yī)院麻醉科,福建 福州 350001)

目前國內(nèi)外對急性肺損傷(acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)相關(guān)心功能障礙機(jī)制研究不多,對心功能障礙的治療也多為對癥處理,缺乏整體辯證施治方法[1]。而對于心功能障礙的診斷目前還是使用傳統(tǒng)的二維超聲心動圖,通過測量心腔大小,室壁厚度,根據(jù)計算值算出射血分?jǐn)?shù),評估心功能狀態(tài),這種普通二維彩超存在著切面影響大,可重復(fù)性差,不能診斷早期心功能下降缺點[2]。除此之外,對于心肌細(xì)胞整體功能測定,當(dāng)前常用方法還是放射核素心肌灌注顯像(myocardial perfusion imaging,MPI),它需要依賴201TlCl、99Tcm-MIBI和131I-BMIPP之一作為心肌灌注顯像示蹤劑,采用單光子發(fā)射計算機(jī)斷層顯像(Single-PhotonEmissionComputedTomography,SPECT)現(xiàn)最終存活心肌結(jié)果[3],存在空間分辨率低、放射核素劑量大、成像時間較長,易受衰減影響缺點。這些都表明臨床需要提供一種新的治療方法,治療藥物來針對這一病癥。除SARS-CoV-2致病因素外,ALI/ARDS也常繼發(fā)于膿毒癥、肺炎、胃內(nèi)容物吸入或重大創(chuàng)傷后,以彌漫性肺泡毛細(xì)血管膜損傷為主要病理特征,臨床表現(xiàn)為急性呼吸窘迫和難治性低氧血癥,常伴有多器官功能衰竭[4],通常在初期表現(xiàn)為急性肺損傷(Acute Lung Injury,ALI),初始階段只出現(xiàn)輕度的呼吸功能下降,但如不早期干預(yù),最終會進(jìn)展為ARDS[5]。據(jù)報告美國每年大約有15萬人最終進(jìn)展為ARDS,死亡率為40%～50%,因此對于ALI/ARDS相關(guān)的心功能障礙機(jī)制研究是當(dāng)前臨床急需,也為穩(wěn)心顆粒的可能作用靶基因提供了方向。穩(wěn)心顆粒對miRNA調(diào)控作用尚未明確,對于可能的miR-106b-25、miR-93調(diào)控機(jī)制,可以采用熒光探針定量PCR法,測量穩(wěn)心顆粒治療前后的miRNA水平進(jìn)行驗證[6]。為此,本研究建立不同濃度脂多糖模擬ALI/ARDS大鼠心功能障礙模型,基于miR-106-b25、miR-93調(diào)控的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-線粒體復(fù)合膜穩(wěn)態(tài)機(jī)制,檢測相關(guān)蛋白,研究穩(wěn)心顆粒改善ALI/ARDS相關(guān)心功能障礙機(jī)制,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

60只健康成年SD大鼠(Sprague-Dawley rats,SD)(200-250g)應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法分為A/B 2組,每組各30只大鼠。

1.2 建模及用藥

(1)A組為模型組。模型制備前禁食水12h;75%酒精消毒實驗器材和實驗臺,腹腔注射10%水合氯醛(300mg/kg)麻醉,使其75度仰臥固定于大鼠操作臺上,頸部外置光源,左手輕輕將大鼠舌頭向外拉出,即可見大鼠聲門隨呼吸開閉;將20號套管針剪短針芯后經(jīng)口插入氣管,拔出針芯確定套管在氣管內(nèi)后,滴注按目標(biāo)劑量配制好的LPS溶液,迅速使大鼠立位旋轉(zhuǎn),使LPS溶液在兩肺中均勻分布,拔出套管;待大鼠清醒后,在清潔級動物實驗室常規(guī)喂養(yǎng)12h。

(2)B組為模型+用藥組。將30只SD大鼠再分為0.9%生理鹽水(normal saline,NS)+2.7g/kg穩(wěn)心顆粒對照組(B0組)、LPS 5mg/kg+2.7g/kg穩(wěn)心顆粒組(B1組)、LPS 10mg/kg+2.7g/kg穩(wěn)心顆粒組(B2組)、LPS 15mg/kg+2.7g/kg穩(wěn)心顆粒組(B3組) 、LPS 20mg/kg+2.7g/kg穩(wěn)心顆粒組(B4組)(n=6)。自由攝食和飲水。按以上方法建立肺損傷模型,12h后,B組大鼠給予2.7g/kg穩(wěn)心顆粒水溶液灌胃給藥,灌胃體積為5mL/kg,每日給藥1次,持續(xù)4周。

1.3 指標(biāo)及檢測方法

熒光探針定量PCR法測量心肌細(xì)胞miR-106b-25和miR-93表達(dá)水平:

第一步:提取A組每只大鼠心肌組織miRNA

將大鼠心肌組織從液氮中取出,加入氯仿,無水乙醇,離心,所得的液體為RNA,將RNA樣品用核酸紫外分光光度進(jìn)行濃度測定,準(zhǔn)備反轉(zhuǎn)錄。

第二步:反轉(zhuǎn)錄

配制反轉(zhuǎn)錄液,離心后,輕柔混勻,放在冰上待用。使用TaqMan microRNA探針,加入miR-106b-25和miR-93的特異性引物序列。

第三步:熒光定量PCR反應(yīng)

設(shè)置引物濃度,退火溫度,測試引物,進(jìn)行PCR反應(yīng),B組4周后進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠用藥前后miR-106-b25、miR-93水平比較

用藥前,2組大鼠miR-106-b25、miR-93水平差異不顯著,P>0.05;用藥后,B組模型+用藥組miR-106-b25、miR-93水平均顯著優(yōu)于A組模型組,差異顯著,P<0.05,見表1。

表1 2組大鼠用藥前后miR-106-b25、miR-93水平比較

3 討論

越來越多的證據(jù)表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與ALI/ARDS的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。同時,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在心肌肥大和心力衰竭的發(fā)展中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜相關(guān)蛋白又受多種miRNA調(diào)控,miRNA其自身雖然不能編碼蛋白質(zhì),但能在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因mRNA的表達(dá),從而發(fā)揮生物學(xué)功能。在臨床上,我們試用了中藥穩(wěn)心顆粒治療存在心功能障礙患者[7],取得一定療效,但其作用機(jī)理未明確。已知穩(wěn)心顆?？梢哉{(diào)節(jié)Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)防止心力衰竭[4]。也有報道證實穩(wěn)心顆粒對心肌梗死的治療和心律失常的防治具有確切臨床療效,同時還證實其具有益氣活血養(yǎng)陰作用。

穩(wěn)心顆粒是一個優(yōu)良的心血管類藥方[8,9],其主要由黨參、三七、甘松等組成,現(xiàn)代藥理研究表明,黨參有效成分在心血管系統(tǒng)疾病的治療中發(fā)揮著非常重要的作用,能夠抑制鈣內(nèi)流和細(xì)胞凋亡。而三七具有促血管生成,抑制細(xì)胞凋亡,減輕氧化應(yīng)激,抑制炎性反應(yīng)和內(nèi)皮依賴性血管舒張作用,同時甘松揮發(fā)油可抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。有研究表明用三七總皂苷(panax notoginsenoside,PNS)處理的缺血再灌注損傷細(xì)胞中miR-30c-5p的水平顯著上調(diào)。而黨參能使老化模型大鼠282lncRNAs、283mRNAs和19miRNAs上調(diào),這證明了黨參的抗衰老作用[10]。這些各組分的研究一定程度揭示了穩(wěn)心顆粒分子層面可能機(jī)制。但是,眾所周知中藥方劑講究君臣佐使,往往多組分配伍使用。

本次研究結(jié)果顯示,用藥前,2組小鼠miR-106-b25、miR-93水平差異不顯著,P>0.05;用藥后,B組模型+用藥組miR-106-b25、miR-93水平均顯著優(yōu)于A組模型組,差異顯著,P<0.05。提示,穩(wěn)心顆粒能明顯改善心功能障礙大鼠miR-106-b25、miR-93水平,效果顯著。

綜上所述,穩(wěn)心顆粒在心功能障礙大鼠中具有較優(yōu)的作用效果,且有助于miR-106-b25、miR-93基因表達(dá)水平的改善。