樊佳,鄭良建,袁夢珍,詹庭亭,張榕珂,張軍

(成都市第三人民醫(yī)院腫瘤科,四川 成都 610000)

腎細胞癌是常見的泌尿道惡性腫瘤,大約15%的腎細胞癌患者診斷時已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移[1]。隨著早癌篩查的不斷普及,腎細胞癌的死亡率有了很大改善[2]。但由于腫瘤的異質(zhì)性,腎細胞癌的復發(fā)率仍較高[3]。因此,預測腎細胞癌預后并指導個體化精準治療方案,探索新的生物標志物顯得尤為重要。銅死亡是一種新型細胞程序性死亡方式[4]。銅在正常范圍內(nèi)是一種機體代謝必須的輔助因子,當銅離子在細胞內(nèi)含量超過閾值時會與線粒體中的脂酰化蛋白結合。脂酰化蛋白的聚集和鐵硫簇蛋白的丟失共同誘導了蛋白質(zhì)毒性應激反應,最終導致細胞銅死亡的發(fā)生[5]。本研究以免疫微環(huán)境相關性的角度出發(fā),發(fā)現(xiàn)SLC31A1與部分腎細胞癌免疫浸潤細胞呈正相關。SLC31A1是一種存在于細胞膜上的銅轉(zhuǎn)運蛋白,在以往的研究中被發(fā)現(xiàn)與順鉑的耐藥相關[6]。SCL31A1被認為與乳腺癌、肺腺癌、胰腺癌的預后相關[7-9]。但SCL31A1在腎細胞癌中的作用尚不清楚?；诖?本研究擬通過生物信息學分析和細胞實驗的干濕結合方法共同探討SCL31A1在腎細胞癌的預后生存和細胞功能中的作用。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從UCSC Xena數(shù)據(jù)庫(https://xena.ucsc.edu/)下載癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫中的RNA-seq數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)[10]。

1.2 銅死亡相關基因在正常組織和腫瘤組織中表達差異分析

使用R語言中的“l(fā)imma”包完成銅死亡基因在正常組織和腫瘤組織中的表達差異分析[11]。

1.3 免疫組化圖像

銅死亡相關基因在正常腎組織和腎癌中的免疫組化圖像下載自The human protein atlas (HPA)數(shù)據(jù)庫[12]。

1.4 腫瘤免疫浸潤分析

使用ssGSEA計算腎癌患者免疫細胞浸潤得分[13],使用Spearman相關性分析計算免疫細胞浸潤得分與銅死亡相關基因表達之間的關系。

1.5 臨床分期相關性分析

使用R語言計算并比較不同臨床分期組之間SLC31A1的表達情況,使用ggplot包進行數(shù)據(jù)可視化。

1.6 生存與獨立預后分析

使用Kaplan-Meier (KM)分析SLC31A1表達和預后之間的關系。獨立預后分析采用單因素與多因素COX分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.7 細胞實驗相關藥品及試劑盒

細胞培養(yǎng)基采用DMEM (Hyclone,USA);10%胎牛血清(FBS) (Hyclone,USA);抗生素采用青-鏈霉素雙抗(索萊寶);胰酶(美國 Gbico);RNA提取采用總RNA提取試劑盒(上海飛捷);RNA逆轉(zhuǎn)錄采用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。RT-qPCR采用Takara熒光實時定量qPCR試劑盒;細胞轉(zhuǎn)染采用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑(賽默飛);轉(zhuǎn)染用培養(yǎng)基opti-MEM(美國 Gbico);轉(zhuǎn)染細胞篩選采用嘌呤霉素(索萊寶);克隆形成實驗固定細胞采用4%多聚甲醛(索萊寶);克隆染色采用草酸銨結晶紫染色液(索萊寶)。

1.8 細胞培養(yǎng)及RT-qPCR實驗

將HK-293T細胞(Human embryonic kidney 293 cell)、786-O細胞(Renal cell carcinoma 786-O cell)、A498細胞(Human kidney carcinoma A498 cell)和769-P細胞(Renal cell carcinoma 769-P cell)置于5% CO2的37 ℃恒溫孵箱中采用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。RNA提取:每例樣本胰酶消化約5×106個細胞,采用硅膠柱純化技術試劑盒提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄采用RT-qPCR技術將RNA提取物逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄體系:2 μg總RNA提取物溶解于16 μL無酶水然后加4 μL ScriptTM Master Mix。實時熒光定量PCR:每組樣品設置4個復孔。PCR體系為:cDNA 5 μL、無酶水3.2 μL、TB II SYBR?Premix ExTaqTM1 μL、前引物與后引物各0.4 μL。

1.9 腎癌細胞中過表達SLC31A1分子

SLC31A1過表達質(zhì)粒購買自吉凱基因(上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司)。采用6孔板進行細胞轉(zhuǎn)染,在6孔板中細胞密度至70%～90%開始轉(zhuǎn)染,主要體系為A:125 μL opti-MEM+5 μL lipo3000,B:125 μL opti-MEM+1～2.5 μg DNA+2～5μL P3000。將A和B輕柔混勻30 min后加入6孔板上清開始進行轉(zhuǎn)染。24 h后采用嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染成功并轉(zhuǎn)錄過表達質(zhì)粒的769-P細胞。

1.10 克隆形成實驗及劃痕實驗

769-P野生型細胞株及SLC31A1過表達細胞株消化后分別置于6孔板中用于克隆形成實驗及劃痕實驗。克隆形成實驗細胞密度1 000個/孔,培養(yǎng)7 d或肉眼發(fā)現(xiàn)明顯克隆形成后取出孵箱,棄培養(yǎng)基后PBS洗3遍,多聚甲醛固定后PBS洗3遍,隨后數(shù)清楚各孔中克隆個數(shù)并完成統(tǒng)計學分析。劃痕實驗細胞密度1 000個/孔,待細胞貼壁后用槍頭于孔中央劃出劃痕,于劃痕后0 h和24 h觀察劃痕修復情況。

1.11 統(tǒng)計學分析

使用GraphPad Prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗;臨床分期相關分析采用秩和檢驗(Kruskal-Wallis test);評估對腎細胞癌預后采用Kruskal-Meier分析,影響預后因素采用COX分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 銅死亡相關基因在腎細胞癌中的表達情況

TCGA數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示除ATP7B在腫瘤組織中呈相對高表達外,FDX1、DLD、DBT、SLC31A1、ATP7A、GCSH、DLST、DLAT、PDHA1、PDHB在腫瘤組織中表達水平均低于正常組織,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。HPA數(shù)據(jù)庫免疫組化數(shù)據(jù)集驗證了TCGA的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),FDX1、DLD、DBT、SLC31A1、ATP7A、GCSH、DLST、DLAT、PDHA1、PDHB在腫瘤組織中的蛋白水平均低于正常組織(P<0.05)。見圖1。

2.2 銅死亡相關基因在腎細胞癌中與腫瘤浸潤免疫細胞的關系

在腎細胞癌中LIPT1、LIAS、GCSH、PDHA1、ATP7B等銅死亡相關基因主要與浸潤免疫細胞負相關。而SLC31A1主要與浸潤免疫細胞呈正相關,且正相關免疫細胞種類最多。SLC31A1與包括巨噬細胞、自然殺傷細胞、樹突狀細胞及B細胞等17種免疫細胞正相關(P<0.05)。見圖2。

2.3 SLC31A1與腎細胞癌的臨床分期相關性

鑒于SLC31A1在腎細胞癌中免疫浸潤細胞呈正相關,通過TCGA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床信息對SLC31A1與腎細胞癌患者臨床分期的相關性進行了進一步分析。結果顯示在T分期中,SLC31A1在T3-4期中的表達水平低于T1期,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在M分期中,SLC31A1在有轉(zhuǎn)移M1期中的表達水平低于無轉(zhuǎn)移M0期,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。SLC31A1在N分期中差異無統(tǒng)計學意義。在TNM分期中,SLC31A1在Ⅲ期及Ⅳ期的表達水平低于I期,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

2.4 SLC31A1在腎細胞癌中的預后價值

為進一步探索SLC31A1在腎細胞癌中的預后價值,通過對TCGA的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與臨床數(shù)據(jù)進行分析。生存分析顯示,SLC31A1高表達腎細胞癌患者的PFS優(yōu)于SLC31A1低表達的患者[HR:0.43(0.31～0.60),P<0.05]。SLC31A1高表達腎細胞癌患者的OS也同樣優(yōu)于SLC31A1低的患者[HR:0.51(0.38～0.70),P<0.05]。森林圖結果顯示SLC31A1在單因素和多因素COX分析中都是腎細胞癌預后的獨立保護因素(P<0.05)。見圖4。

2.5 SLC31A1在腎正常細胞與腎癌細胞系中的表達

通過RT-qPCR檢測SLC31A1在腎正常細胞與腎癌細胞系的表達結果與免疫組化一致,SLC31A1在腎正常細胞HK293T的表達水平高于腎癌細胞系786-O、A498及769-P,其中SLC31A1在769-P細胞中的表達最低。故選用769-P細胞進行后續(xù)實驗。見圖5。

2.6 腎癌細胞模型中過表達SLC31A1

對SLC31A1表達量最低的腎癌細胞769-P轉(zhuǎn)染SLC31A1過表達質(zhì)粒并通過RT-qPCR檢測SCL31A1的表達情況,結果顯示轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒后769-P細胞中SLC31A1的表達高于野生型769-P細胞,成功構建過表達SLC31A1 769-P細胞株。見圖6。

2.7 過表達SLC31A1抑制腎癌細胞的增殖、侵襲能力

采用克隆形成試驗和劃痕實驗檢測并比較野生型769-P細胞株和過表達SLC31A1的769-P細胞株的細胞增殖和侵襲能力?？寺⌒纬蓪嶒灲Y果顯示過表達SLC31A1的769-P細胞克隆形成數(shù)量低于野生型的769-P細胞,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。劃痕實驗結果也顯示類似的趨勢,過表達SLC31A1的769-P細胞株相對于野生型,其劃痕修復能力下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

腎細胞癌作為常見的泌尿道惡性腫瘤,復發(fā)轉(zhuǎn)移仍是主要的失敗模式[14]。細胞死亡一直是探索生物標記物的主要研究領域,多種程序性細胞死亡被發(fā)現(xiàn)在腫瘤預后及免疫預測上具有重要價值,包括焦亡、鐵死亡等[15-16]。銅死亡作為新型細胞死亡方式,在作為生物標記物的作用并不明確。

銅死亡相關基因已在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)與腫瘤的預后和免疫作用相關,如Hu等[17]發(fā)現(xiàn)銅死亡基因與肺腺癌的預后顯著相關。Lv等[18]發(fā)現(xiàn)在銅死亡相關基因LIPT1、PDHA1和SLC31A1與黑色素瘤的預后顯著相關,其中LIPT1與黑色素瘤的瘤內(nèi)免疫抑制細胞Treg呈負相關。Li等[19]通過對胃癌轉(zhuǎn)錄組和單細胞測序數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),銅死亡相關基因可用于將胃癌分為兩種不同的免疫微環(huán)境亞組,并建立預后模型準確判斷胃癌的預后。

本研究全面分析SLC31A1在腎癌預后中的預測價值和腎癌細胞系的主要功能。我們發(fā)現(xiàn)在mRNA表達水平上,除了LIPT1,LIAS和ATP7B外的銅死亡相關基因在腎細胞癌中相對于正常組織呈低表達。來自HPA的數(shù)據(jù)也證實了這一點。這說明腎細胞癌的發(fā)生發(fā)展可能抑制了銅死亡相關基因的表達。我們在隨后的免疫浸潤細胞相關性分析中發(fā)現(xiàn),SLC31A1與多達17種免疫浸潤細胞正相關,包括了固有免疫中的巨噬細胞、樹突狀細胞等抗原提呈細胞,也包括適應性免疫中的CD4+T細胞、γδ T細胞及B細胞等腫瘤殺傷細胞。這可能是由于SLC31A1誘導銅死亡后產(chǎn)生免疫源性細胞死亡導致的。因此,本研究將重點研究SLC31A1在腎細胞癌中的作用。

臨床特征相關性分析顯示,SLC31A1表達水平與T分期、M分期和TNM分期負相關,說明SLC31A1可能在一定程度上具有抑制腎細胞癌侵襲或轉(zhuǎn)移的能力。這種抑制能力可能實現(xiàn)了對生存分析的獲益,隨后的生存分析顯示,SLC31A1高表達的患者無論是PFS還是OS都顯著優(yōu)于SLC31A1低表達的患者。單因素和多因素的COX分析森林圖也顯示SLC31A1是腎細胞癌預后獨立保護因素。

為進一步驗證SLC31A1對腎細胞癌侵襲增殖的抑制作用,本研究在腎細胞癌細胞系中對SLC31A1的表達水平進行調(diào)控。由于SLC31A1在腎細胞癌中呈低表達且可能的抑制癌細胞增殖功能,故上調(diào)了SLC31A1在腎細胞癌細胞系的表達水平,并觀察其侵襲增殖能力。結果發(fā)現(xiàn)SLC31A1過表達的腎癌細胞相對于野生型細胞的克隆形成和劃痕修復能力出現(xiàn)了被抑制的現(xiàn)象。這從體外實驗層面證實了SLC31A1具有抑制腎細胞癌增殖侵襲的功能。

SLC31A1是一種存在于細胞膜上的高親和力銅轉(zhuǎn)運蛋白,SLC31A1的上調(diào)可以正向調(diào)整銅離子進入細胞內(nèi)從而導致銅死亡的發(fā)生[20]。因此,SLC31A1對腎細胞癌的抑制作用的機制可能與銅死亡的發(fā)生相關,這種抗原性細胞死亡模式同時可能也是SLC31A1與免疫細胞浸潤正相關的主要原因。

綜上,SLC31A1可能具有對腎細胞癌侵襲增殖的抑制作用。另一方面,SLC31A1同樣為作為一個強有力的預后生物標志物用于預測腎細胞癌患者的預后,有助于腎細胞癌的臨床決策。