張澤敏,龐嵐

(1.邯鄲市第一醫(yī)院產(chǎn)科;2.邯鄲市婦幼保健院婦科,河北 邯鄲 056000)

子宮內(nèi)膜癌 (endometrial cancer ,EC)是全球女性中第4常見的婦科腫瘤[1],發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì),且趨于年輕化[2]。手術(shù)、激素治療、放化療和新型靶向治療等是目前治療EC的主要方法,但EC患者的5年生存率并沒有顯著提高[3]。因此,全面了解EC發(fā)病機(jī)制,尋找更有效的EC治療方法勢(shì)在必行?；倍嗵?Huaier polysaccharide,HP)是從Trametes robiniophila Murr中提取的一種活性成分,其可抑制乳腺癌惡性進(jìn)展[4];且HP可促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡并抑制增殖[5]。而關(guān)于HP對(duì)EC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響尚不清楚。星形膠質(zhì)細(xì)胞升高基因1(Astrocyte elevated gene-1,AEG-1)是一種致癌基因,其在EC組織中表達(dá)量異常升高,且與癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6];相關(guān)報(bào)道[7]稱HP通過失活A(yù)EG-1通路抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。而目前HP能否通過抑制AEG-1影響EC細(xì)胞生物學(xué)行為尚不明確。因此,本研究擬觀察HP對(duì)EC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡的影響及其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及動(dòng)物

人子宮內(nèi)膜癌ishikawa細(xì)胞購(gòu)自上?；鄯f生物公司。35只4～6周齡、體重為15～22 g的雌性BALB/c裸鼠購(gòu)自導(dǎo)科醫(yī)藥技術(shù)(廣東)有限公司(SCXK(粵)2022-0060)。溫度(22±2 °C)、濕度約60%、光照(12 h光照,12 h黑暗),將BALB/c 裸鼠飼養(yǎng)在獨(dú)立的標(biāo)準(zhǔn)清潔籠中,在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中可隨意飲食和攝水。

1.2 主要試劑

槐耳多糖粗提物購(gòu)自啟東蓋天力藥業(yè)有限公司,將槐耳多糖粗提物用二乙基氨基乙基纖維素-52層析柱析出,再用蒸餾水洗滌,0.1～0.3 mol/L氯化鈉洗脫。HP的純度通過以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)的苯酚-硫酸法進(jìn)行評(píng)估,HP用PBS稀釋以制備50 mg/mL的儲(chǔ)備溶液并儲(chǔ)存在-20 °C;AEG-1小干擾RNA(si-AEG-1)及其陰性對(duì)照(si-NC)、AEG-1過表達(dá)物(pcDNA-AEG-1)及其陰性對(duì)照(pcDNA)均購(gòu)自廣州基迪奧生物公司;CCK-8試劑盒購(gòu)自上?？瓢┥锕?Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科美訊生物公司;兔源一抗AEG-1、細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-Associated X Protein,Bax)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix matalloproteinases ,MMP)-2、MMP-9、GAPDH及羊抗兔IgG二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.3 HP作用濃度的確定

將ishikawa細(xì)胞懸液均勻鋪入96孔板中,待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合度時(shí),分別加入0、1、3、5、7、9、11 μg/mL HP處理ishikawa細(xì)胞24 h,繼續(xù)加入10 μL CCK-8試劑在37 ℃下孵育2 h,酶標(biāo)儀測(cè)量細(xì)胞在450 nm下OD值。細(xì)胞活力=(OD實(shí)驗(yàn)孔-OD空白孔)/(OD對(duì)照孔-OD空白孔)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

將ishikawa細(xì)胞在37 °C、5% CO2條件下,于DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清)中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ishikawa細(xì)胞,分為Ct組(正常培養(yǎng)的ishikawa細(xì)胞)、HP-L組[8](1μg/mL HP處理細(xì)胞48 h)、HP-H組[8](5 μg/mL HP處理細(xì)胞48 h)、si-NC組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-NC 48 h)、si-AEG-1組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-AEG-1 48 h),根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,5 μg/mL HP對(duì)ishikawa細(xì)胞生物學(xué)行為的影響顯著優(yōu)于1 μg/mL HP,故后續(xù)選擇5 μg/mL HP與pcDNA-AEG-1共同處理ishikawa細(xì)胞以探究HP與AEG-1對(duì)ishikawa細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,故在上述分組的基礎(chǔ)上再進(jìn)行以下分組:HP-H+pcDNA組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA 48h后再用5 μg/mL HP處理48 h)、HP-H+pcDNA-AEG-1組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA-AEG-1 48 h后再用5 μg/mL HP處理48 h)。收集各組細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 CCK-8法檢測(cè)ishikawa細(xì)胞增殖

將各組ishikawa細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的密度96孔板中,孵育48 h后,各加入CCK-8試劑10 μL,再37 ℃下孵育2 h。利用酶標(biāo)儀上測(cè)量各組細(xì)胞在450 nm下的光密度(OD) 值。

1.6 EdU染色檢測(cè)ishikawa細(xì)胞增殖

ishikawa細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸,與10 μM EdU一起培養(yǎng)2 h,再按照1.3中的方法處理細(xì)胞。胰蛋白酶消化后,經(jīng)離心、洗滌、固定、透化和1×Apollo反應(yīng)混合物孵育后,用DAPI對(duì)DNA進(jìn)行染色。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖,并通過EdU陽(yáng)性細(xì)胞的百分比估計(jì)增殖能力。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ishikawa細(xì)胞凋亡

各組ishikawa細(xì)胞采用PBS緩沖液洗滌后,于結(jié)合緩沖液重懸,加入Annexin V-FITC和碘化丙啶各5 μL,在4 ℃下避光孵育30 min,接著在500 μL結(jié)合緩沖液中重懸,最后通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況,細(xì)胞凋亡率=(凋亡細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目)× 100%。

1.8 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ishikawa細(xì)胞遷移

ishikawa細(xì)胞按1.3的方法處理后接種在6孔板中,達(dá)到100%匯合度后,用200 μL移液槍槍頭在各孔底部制造劃痕。然后將細(xì)胞與無(wú)血清培養(yǎng)基一起孵育48 h。利用光學(xué)顯微鏡觀察遷移情況,劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.9 Transwell測(cè)定ishikawa細(xì)胞侵襲

用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的基質(zhì)膠平鋪在Transwell上室,上室在室溫下風(fēng)干備用。將無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的細(xì)胞懸液(2×105個(gè)/ 200 μL)添加到Transwell上室。將含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基600 μL加入到下室。將小室在37 °C下孵育48 h后,取出小室后,用磷酸鹽緩沖溶液洗滌兩次。用棉簽去除殘留細(xì)胞,95%酒精固定后進(jìn)行結(jié)晶紫染色。用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞侵襲情況。

1.10 Western blot檢測(cè)ishikawa細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)水平

RIPA裂解緩沖液用于裂解ishikawa細(xì)胞。將細(xì)胞裂解物在冰上孵育15min后,以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min。蛋白質(zhì)濃度采用二辛可寧酸試劑盒測(cè)定。取30 μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE,轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜。用5%脫脂牛奶在室溫下封閉膜1 h,然后與一抗AEG-1(1∶1 000)、CyclinD1(1∶2 000)、Bax(1∶1 000)、Caspase-3(1∶1 000)、MMP-2(1∶2 000)、MMP-9(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)在4 ℃下孵育過夜。將膜徹底清洗后,將其與辣根過氧化物酶(HRP)綴合的山羊抗兔抗體在室溫下孵育1 h。用ECL試劑觀察蛋白質(zhì)印跡,Image J軟件分析蛋白表達(dá)。

1.11 裸鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

將ishikawa細(xì)胞懸液以1×107個(gè)/200 μL通過皮下注射到裸鼠左側(cè)腋窩,當(dāng)腫瘤直徑約為10 mm 時(shí),將小鼠隨機(jī)分為7組:裸鼠Ct組(灌胃生理鹽水且還需皮下注射生理鹽水)、裸鼠HP-L組[8](灌胃25 μg/g HP且還需皮下注射生理鹽水)、裸鼠HP-H組[8](灌胃100 μg/g HP且還需皮下注射生理鹽水)、裸鼠si-NC組(皮下注射轉(zhuǎn)染si-NC的ishikawa細(xì)胞且還需灌胃生理鹽水)、裸鼠si-AEG-1組(皮下注射轉(zhuǎn)染si-AEG-1的ishikawa細(xì)胞且還需灌胃生理鹽水)、裸鼠HP-H+pcDNA組(皮下注射轉(zhuǎn)染pcDNA的ishikawa細(xì)胞且灌胃100 μg/g HP)、裸鼠HP-H+pcDNA-AEG-1組(皮下注射轉(zhuǎn)染pcDNA-AEG-1的ishikawa細(xì)胞且灌胃100 μg/g HP),每組各5只。給藥1次/d,連續(xù)28 d后,用2%戊巴比妥鈉處死小鼠,取出移植的腫瘤,稱量腫瘤質(zhì)量。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度HP對(duì)ishikawa細(xì)胞活力的影響

與濃度0 μg/mL HP比較,1 μg/mL HP、3 μg/mL HP、5 μg/mL HP處理的ishikawa細(xì)胞活力升高,7 μg/mL HP、9 μg/mL HP、11 μg/mL HP處理的ishikawa細(xì)胞活力降低,因此選取1 μg/mL HP、5 μg/mL HP分別作為后續(xù)處理ishikawa細(xì)胞的低、高劑量濃度。見表1。

表1 不同濃度HP對(duì)ishikawa細(xì)胞活力的影響

2.2 HP對(duì)ishikawa細(xì)胞增殖能力的影響

與Ct組比較,HP-L組、HP-H組ishikawa細(xì)胞OD450值、EdU陽(yáng)性率均降低(P<0.05);與Ct組、si-NC組比較,si-AEG-1組ishikawa細(xì)胞OD450值、EdU陽(yáng)性率均降低(P<0.05);與HP-H組、HP-H+pcDNA組比較,HP-H+pcDNA-AEG-1組ishikawa細(xì)胞OD450值、EdU陽(yáng)性率均升高(P<0.05)。見圖1及表2。

表2 各組ishikawa細(xì)胞OD450值及EdU陽(yáng)性率比較

2.3 HP對(duì)ishikawa細(xì)胞凋亡能力的影響

與Ct組比較,HP-L組、HP-H組ishikawa細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05);與Ct組、si-NC組比較,si-AEG-1組ishikawa細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05);與HP-H組、HP-H+pcDNA組比較,HP-H+pcDNA-AEG-1組ishikawa細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)。見圖2及表3。

表3 各組ishikawa細(xì)胞凋亡率比較

2.4 HP對(duì)ishikawa細(xì)胞遷移能力的影響

與Ct組比較,HP-L組、HP-H組ishikawa細(xì)胞劃痕愈合率降低(P<0.05);與Ct組、si-NC組比較,si-AEG-1組ishikawa細(xì)胞劃痕愈合率降低(P<0.05);與HP-H組、HP-H+pcDNA組比較,HP-H+pcDNA-AEG-1組ishikawa細(xì)胞劃痕愈合率升高(P<0.05)。見圖3及表4。

表4 各組ishikawa細(xì)胞劃痕愈合率比較

2.5 HP對(duì)ishikawa細(xì)胞侵襲能力的影響

與Ct組比較,HP-L組、HP-H組侵襲細(xì)胞數(shù)降低(P<0.05);與Ct組、si-NC組比較,si-AEG-1組侵襲細(xì)胞數(shù)降低(P<0.05);與HP-H組、HP-H+pcDNA組比較,HP-H+pcDNA-AEG-1組侵襲細(xì)胞數(shù)升高(P<0.05)。見圖4及表5。

表5 各組ishikawa細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)比較

2.6 HP對(duì)ishikawa細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與Ct組比較,HP-L組、HP-H組ishikawa細(xì)胞中AEG-1、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)降低,Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與Ct組、si-NC組比較,si-AEG-1組ishikawa細(xì)胞中AEG-1、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)降低,Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與HP-H組、HP-H+pcDNA組比較,HP-H+pcDNA-AEG-1組ishikawa細(xì)胞中AEG-1、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)升高,Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見圖5和表6。

表6 各組ishikawa細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

2.7 HP對(duì)裸鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響

與裸鼠Ct組比較,裸鼠HP-L組、裸鼠HP-H組裸鼠體內(nèi)腫瘤質(zhì)量降低(P<0.05);與裸鼠Ct組、裸鼠si-NC組比較,裸鼠si-AEG-1組裸鼠體內(nèi)腫瘤質(zhì)量降低(P<0.05);與裸鼠HP-H組、裸鼠HP-H+pcDNA組比較,裸鼠HP-H+pcDNA-AEG-1組裸鼠體內(nèi)腫瘤質(zhì)量升高(P<0.05)。見圖6及表7。

表7 各組裸鼠體內(nèi)腫瘤質(zhì)量比較

3 討論

EC是一種以子宮內(nèi)膜細(xì)胞無(wú)節(jié)制或異常生長(zhǎng)為特征的疾病[9]。相關(guān)研究[10]表明,2018年全球報(bào)告了大約38萬(wàn)例新病例和8萬(wàn)例EC相關(guān)死亡病例,且EC的發(fā)病率不斷增加,預(yù)后較差。因此,迫切需要尋找有效的EC治療策略。

HP作為Trametes robiniophila Murr的提取物,其具有抗腫瘤潛力和免疫調(diào)節(jié)作用[11]。已有研究報(bào)道,HP可抑制乳腺癌進(jìn)展[12];HP可誘導(dǎo)透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡,阻礙增殖、遷移、侵襲[13]。以上研究表明HP可抑制腫瘤的進(jìn)展。本研究顯示,HP可抑制ishikawa細(xì)胞增殖、腫瘤生長(zhǎng)、遷移與侵襲,誘導(dǎo)凋亡,且HP的劑量越高,對(duì)應(yīng)的趨勢(shì)越明顯,表明HP在EC中發(fā)揮抑癌作用。CyclinD1是衡量細(xì)胞增殖的常用指標(biāo),其表達(dá)量越高表明細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)[14];Bax、Caspase-3是細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白,增加Bax、Caspase-3水平可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15];基質(zhì)金屬蛋白酶可促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲,作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族的成員,MMP-2和MMP-9在腫瘤中均具有高度活性,同時(shí)也能促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲[16]。本研究顯示,低、高劑量HP均可抑制ishikawa細(xì)胞中CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá),促進(jìn)Bax、Caspase-3蛋白表達(dá),證實(shí)了HP具有抑制ishikawa細(xì)胞增殖、遷移與侵襲,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

AEG-1是促進(jìn)腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵因素,其可通過促進(jìn)細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移、提高抗凋亡能力,進(jìn)而加速腫瘤的進(jìn)展[17]。據(jù)報(bào)道,AEG-1在肝癌細(xì)胞中高表達(dá),并促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[18];沉默AEG-1抑制了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲[19];EC組織中AEG-1表達(dá)增高,并可促進(jìn)腫瘤組織的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[20]。以上研究表明AEG-1在多種腫瘤中具有促癌的作用。本研究顯示,AEG-1蛋白在ishikawa細(xì)胞中高表達(dá),沉默AEG-1可抑制ishikawa細(xì)胞增殖、腫瘤生長(zhǎng)、侵襲與遷移,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,且低、高劑量HP均可抑制ishikawa細(xì)胞中AEG-1蛋白表達(dá),推測(cè)HP可能通過下調(diào)AEG-1抑制ishikawa細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲與遷移,誘導(dǎo)凋亡。為了驗(yàn)證該推測(cè),本研究在高劑量HP作用的基礎(chǔ)上再加上pcDNA-AEG-1干預(yù)ishikawa細(xì)胞或注射ishikawa細(xì)胞的裸鼠。結(jié)果顯示,pcDNA-AEG-1減弱了高劑量HP對(duì)ishikawa細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的抑制作用、細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用及對(duì)裸鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。證實(shí)了HP可能通過下調(diào)AEG-1抑制ishikawa細(xì)胞增殖、腫瘤生長(zhǎng)、侵襲與遷移,誘導(dǎo)凋亡。

綜上,HP可能通過下調(diào)AEG-1抑制ishikawa細(xì)胞增殖、腫瘤生長(zhǎng)、侵襲與遷移,誘導(dǎo)凋亡。其具體機(jī)制還待更深入的研究。