何宣宣,賈澤峰

(聊城大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 聊城 252059)

1 引言

Meyer在1825年新建了點衣屬OcellulariaG. Mey.。該屬隸屬于真菌界(Fungi)、子囊菌門(Ascomycota)、茶漬綱(Lecanoromycetes)、厚頂盤亞綱(Ostropomycetidae)、文字衣目(Graphidales)、疣孔衣科(Thelotremataceae)[1]。

該屬多分布于熱帶亞熱帶地區(qū),主要特征為地衣體殼狀,多為橄欖綠色,表面光滑或粗糙,厚0.1～0.5 mm;子囊盤圓形,直徑(0.1～)0.3～2 mm;多具軸柱;盤被炭化;子囊含1～8孢子;子囊孢子橫隔透鏡型或磚壁型,12～350 μm × 6～50 μm;I+紫羅蘭色或I-[2,3]。

目前世界范圍內(nèi)報道點衣屬400種[4,5]。最早報道自中國的點衣屬物種是采自臺灣的OcellulariaalbaMüll. Arg.[6],隨后,中國又報道了10種,主要分布于湖南、廣西、貴州、臺灣、香港等[7-14]。因此,有必要對我國點衣屬類群進(jìn)行進(jìn)一步研究,為我國地衣型真菌物種資源開發(fā)及利用提供基礎(chǔ)資料。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

本研究所用材料來自福建,現(xiàn)館藏于聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院菌物標(biāo)本室(LCUF)。

2.2 表型分析

采用OLYMPUS SZX16解剖顯微鏡對標(biāo)本進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和解剖,采用OLYMPUS BX53復(fù)合顯微鏡進(jìn)行觀察、拍照并記錄數(shù)據(jù)。用碘液檢測子囊及其孢子的淀粉樣度。滴加 10% KOH溶液、NaClO飽和水溶液、P 溶液(將對苯二胺溶于無水乙醇,配成5%乙醇溶液)進(jìn)行觀察顏色反應(yīng)。采用薄層層析法(TLC)對地衣化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行鑒定[15,16]。

2.3 基因型分析

DNA提取、PCR擴(kuò)增、測序。使用Sigma-Aldrich REDExtract-N-AmpTM植物PCR試劑盒從子囊盤中提取基因組 DNA,采用PCR擴(kuò)增核糖體RNA基因區(qū),即大亞基rDNA(nuLSU),引物為AL2R/LR6[17]。50 μL PCR反應(yīng)體系包含引物(AL2R與LR6)各2 μL,基因組2 μL DNA,19 μL ddH2O,25 μL 2×Taq PCR Master Mix。擴(kuò)增程序包括94 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min(共35個循環(huán));最后72 ℃延伸10 min。目的產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測序。序列信息見表1。

表1 系統(tǒng)發(fā)育分析所用標(biāo)本信息和 GenBank 登錄號

構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用軟件Geneious v.6.1.2(Biomatters Ltd., Auckland, NZ) 對原始序列進(jìn)行組合和編輯。選擇與點衣屬親緣關(guān)系較近的Leptotrema作為外類群[18,19],并從NCBI網(wǎng)站上下載所需的20條nuLSU序列(見表1),自測序列、NCBI下載序列和外類群序列運用Geneious v.6.1.2進(jìn)行序列比對并導(dǎo)出,用MAFFT version 7對導(dǎo)出的序列進(jìn)行校準(zhǔn)[20]。使用CIPRES Scientific gateway portal(http:∥www.phylo.org/portal2/)[21]進(jìn)行最大似然法(Maximum-likelihood, ML)和貝葉斯法(Bayesian inference, BI)分析。最大似然法(ML)使用RAxML-HPC BlackBox v. 8.2.12[22]進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,對各節(jié)點進(jìn)行1 000次重復(fù)以評價自展支持值;對于貝葉斯分析,使用jModelTest 2.1.6[23]計算最佳模型,在此基礎(chǔ)上,采用了GTR+I+G模型,最后使用MrBayes v. 3.2.7a構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。獲得的系統(tǒng)發(fā)育樹文件在Figtree v.1.4.4中查看和編輯。

3 結(jié)果

3.1 系統(tǒng)發(fā)育分析

在本研究中,最大似然法(Maximum-likelihood, ML)和貝葉斯法(Bayesian inference, BI)具有相同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu);因此,我們在這里只給出ML系統(tǒng)發(fā)育樹,自展支持值(bootstrap) ≥ 70%顯示在節(jié)點上;基于nuLSU序列構(gòu)建Ocellularia的系統(tǒng)發(fā)育樹,共包括21條序列,10個分類單元,其中Leptotremawightii(Taylor) Müll. Arg.作為外群。

圖1 基于 nuLSU 序列構(gòu)建的點衣屬系統(tǒng)發(fā)育樹(粗體表示本研究新測序列,其余為GenBank下載序列)

3.2 分類

檳榔點衣,如圖2。Ocellulariaarecae(Vain.) Hale, Mycotaxon 11(1): 136(1980)。

注:(a、b)地衣體和子囊器(標(biāo)尺1∶ 1.0 mm);(c)子囊盤橫切面(標(biāo)尺1∶200 μm);(d)子囊孢子(標(biāo)尺1∶100 μm)。圖2 檳榔點衣(馬振國 FJ220304)

Type: Thailand['Siam'] - Insula Koh Chang, ad corticemArecaecatechu. leg. Johs. Schmidt, 1900[TUR-VAIN 26767, holotype]。

地衣體殼狀,樹皮生,表面灰綠色,粗糙,無光澤,具微疣狀突起。

子囊盤近圓形,貼生,直徑0.6～2 mm;盤緣四周具疣狀突起,似花狀;中央具一黑色孔口;具炭化的軸柱;盤被炭化;子實層厚200～270 μm,清晰狀,透明;側(cè)絲較單一,平直,寬1～3 μm;囊層被淺黑色,厚15～27 μm;囊層基淺褐色,厚20～35 μm;子囊含有1個孢子;子囊孢子長棒狀,兩端稍尖,無色,磚壁型,孢室密集,165～210 μm × 24.5～37 μm,I+紫羅蘭色。

化學(xué)反應(yīng):K+紅棕色,C-,KC-,P-;含有副原冰島衣酸(hypoprotocetraric acid)(TLC)。

基物:樹皮。

研究標(biāo)本:福建:漳州市,貢鴨山國家森林公園,觀音亭,海拔1 158 m,2022年7月13日,馬振國 FJ220304(LCUF)。

世界分布:澳大利亞[24],泰國[25]。中國新記錄種。

討論:該物種主要特征為地衣體殼狀,具炭化的軸柱,子囊1孢,子囊孢子磚壁型,含有副原冰島衣酸(hypoprotocetraric acid)。本研究標(biāo)本與模式標(biāo)本(Thailand)特征一致;本研究標(biāo)本與澳大利亞(Australia)的標(biāo)本特征基本一致,但本研究只檢測出副原冰島衣酸(hypoprotocetraric acid),而澳大利亞標(biāo)本特征描述中還含有其他微量酸(2-hydroxyhypoprotocetraric acid, 2-hydroxynornotatic acid)。

Ocellulariaarecae(Vain.) Hale的分類特征類似于O.eumorpha(Stirt.) Hale,后者子囊1孢,子囊孢子磚壁型,大小為150～245 μm × 28～50 μm,含有副原冰島衣酸(hypoprotocetraric acid),但后者不具有炭化的軸柱[3]。該種與O.eumorphoidesFrisch也較相似,不同之處在于后者的子囊孢子較小(70～125 μm × 19～28 μm)[3]。

根據(jù)分子數(shù)據(jù)分析,該種與Ocellularia其他物種明顯分開,且與O.arecae聚為一獨立分支,支持值高達(dá) 100%,綜合以上特征鑒定為O.arecae。

4 致謝

感謝國家自然科學(xué)基金(31750001)的支持,感謝標(biāo)本采集者提供實驗材料的幫助。