師毅君，王康君，郭明明，張廣旭，譚一羅，李曉峰，何茂盛，徐大勇，樊繼偉

（連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 連云港 222000）

甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶（glycerol-3-phosph-ateacyltransferase, GPAT）是三酰甘油（Triacylglycerol, TAG）生物合成的關(guān)鍵酶，催化并限制其第一步反應(yīng)的速度，是細(xì)胞膜、表皮蠟質(zhì)、種內(nèi)油脂等重要組分，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆能力具有重要影響［1］。具體而言，GPATs分為兩類(lèi)：一類(lèi)為sn-1型GPAT，負(fù)責(zé)將脂肪?；鶑孽；??；d體蛋白（-acyl-ACP）或?；o酶A（-acyl-CoA）向sn-1轉(zhuǎn)移；另一類(lèi)屬于sn-2型GPAT，具有磷酸酶活性［2-4］。目前，已在多種植物中鑒定到GPAT基因家族成員，如擬南芥［5］、棉花［6］、玉米［7］、青稞［8］、大麥［9-10］等，其中，擬南芥GPAT家族包含10個(gè)成員［5］，ATS1和AtGPAT9 屬于sn-1型GPAT，AtGPAT1~8 為陸生植物特有的sn-2型GPAT，這些酶參與磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol, PG）［11-12］、植物膜脂、植物油脂、角質(zhì)和軟木脂［4,13］等多種脂質(zhì)的生物合成［14］。研究發(fā)現(xiàn)，GPAT在植物響應(yīng)冷、熱等脅迫中起著關(guān)鍵作用［15］，例如，在不同抗冷性水稻中，GPAT核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列差異與抗冷性差異正相關(guān)［16］。番茄LeGPAT基因表達(dá)受低溫誘導(dǎo)，過(guò)表達(dá)可以提高甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶含量而增強(qiáng)植株的耐冷性，抑制表達(dá)則可以增強(qiáng)耐熱性并影響番茄的育性［17］。百合LpGPAT基因也被證明與低溫脅迫有關(guān)［18］。在水稻品種J9516的葉綠體類(lèi)囊體膜磷脂分子中，不飽和PG含量較高的植株能抵御低溫誘導(dǎo)的光抑制作用［16］。反之，GPAT酶通過(guò)提高質(zhì)體中類(lèi)囊體膜脂的飽和度來(lái)增加植物對(duì)高溫的耐受性。顏坤等［19-21］研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下，轉(zhuǎn)入GPAT基因的煙草類(lèi)囊體膜上脂質(zhì)飽和度增加，其光合速率較野生型的變化慢。

四倍體小麥分為硬粒小麥和野生二粒小麥，是栽培小麥的近緣物種，近年來(lái)，隨著其基因組測(cè)序的完成，已逐漸成為新的研究熱點(diǎn)，許多其他關(guān)于GPAT基因及其功能的類(lèi)似研究已經(jīng)被報(bào)道［14,22］。然而，人們對(duì)該基因家族在四倍體小麥中的作用知之甚少，特別是它們?cè)诶浠驘崦{迫中的潛在作用。為了解四倍體小麥中GPAT基因家族進(jìn)化及其功能，本研究通過(guò)比較基因組學(xué)系統(tǒng)分析硬粒小麥和野生二粒小麥GPAT基因家族的結(jié)構(gòu)特性，進(jìn)化關(guān)系等內(nèi)容，為深入探索麥類(lèi)作物GPAT基因家族的功能提供更多的信息。

1 材料與方法

1.1 四倍體小麥GPAT基因家族成員的鑒定及理化性質(zhì)分析

從植物參考基因組數(shù)據(jù)庫(kù)EnsemblPlants（https://plants.ensembl.org/index.html）下載硬粒小麥、野生二粒小麥以及擬南芥的基因組數(shù)據(jù)，包括基因組序列文件、注釋文件、蛋白序列文件。利用從Uniportswissport（https://www.uniprot.org/）下載擬南芥GPAT蛋白序列，在Pfam網(wǎng)站（http://pfam-legacy.xfam.org/）下載GPAT蛋白保守結(jié)構(gòu)域（PF01553）的隱馬爾可夫模型，使用TBtools（https://github.com/CJ-Chen/TBtools）軟件［23］在硬粒小麥和野生二粒小麥蛋白質(zhì)庫(kù)進(jìn)行BLASTP和HMMER搜索，得到包含結(jié)構(gòu)域模型的蛋白序列。將HMMER和BLASTP的結(jié)果去冗余后，將序列提交到NCBI-CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其結(jié)構(gòu)域進(jìn)行鑒定，保留包含有完整結(jié)構(gòu)域的基因。通過(guò)網(wǎng)站ExPASY（https://www.expasy.org/）來(lái)分析硬粒小麥和野生二粒小麥GPAT基因家族成員分子量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)，并用網(wǎng)站W(wǎng)oLFPSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）來(lái)預(yù)測(cè)其家族成員的亞細(xì)胞定位信息。

1.2 四倍體小麥GPAT基因家族系統(tǒng)發(fā)育分析

使用軟件MEGA 11.0軟件內(nèi)置muscle對(duì)硬粒小麥、野生二粒小麥、擬南芥的所有GPAT基因進(jìn)行多序列對(duì)比分析，使用鄰接法Neighbor-joiningTree構(gòu)建GPAT基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap值取1000。通過(guò)網(wǎng)站ITOL（https://itol.embl.de/）進(jìn)行美化。

1.3 四倍體小麥GPAT基因家族基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

硬粒小麥、野生二粒小麥和擬南芥GPAT基因結(jié)構(gòu)分析使用TBtools軟件中Visualize Gene Structure（Basic）工具，根據(jù)其基因組注釋gff3文件提取內(nèi)含子和外顯子信息；通過(guò)網(wǎng)站MEME（http://memesuite.org/）預(yù)測(cè)蛋白的保守結(jié)構(gòu)域（Motif設(shè)為10）；通過(guò)網(wǎng)站NCBI-CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）確認(rèn)GPAT家族成員的保守結(jié)構(gòu)域。使用TBtools軟件的GeneStructureView工具將上述結(jié)果進(jìn)行合成及可視化。

1.4 四倍體小麥GPAT基因家族共線性分析

根據(jù)硬粒小麥、野生二粒小麥和擬南芥全基因組及注釋文件，使用TBtools對(duì)其進(jìn)行可視化的共線性關(guān)系分析，以此發(fā)現(xiàn)三者GPAT基因家族間的同源基因?qū)Α?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 GPAT基因家族成員的鑒定結(jié)果及理化性質(zhì)分析

利用擬南芥GPAT蛋白序列，在硬粒小麥和野生二粒小麥蛋白質(zhì)庫(kù)進(jìn)行BLASTP和HMMER搜索鑒定，最終確定硬粒小麥和野生二粒小麥各有33個(gè)GPAT基因家族成員。由表1可知，GPATs蛋白質(zhì)成員的氨基酸長(zhǎng)度為149（TdGPAT19）~589（TtGPAT1），分子量為16.22 kDa（TdGPAT19）~62.76 kDa（TtGPAT1），等電點(diǎn)為5.92（TdGPAT5）~11.39（TdGPAT7），但絕大多數(shù)蛋白（56個(gè)）的pI大于8，說(shuō)明大多數(shù)GPATs蛋白富含堿性氨基酸，屬堿性蛋白。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示：有40.9%成員定位在質(zhì)膜，25.7%成員定位在葉綠體，12.1%成員定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，10.6%成員定位在細(xì)胞液，6%成員定位在線粒體，1.5%成員定位在細(xì)胞壁，1.5%成員定位在細(xì)胞核，1.5%成員定位在液泡，結(jié)果暗示GPATs蛋白成員參與不同過(guò)程。

2.2 GPAT基因家族系統(tǒng)發(fā)育分析

為解讀GPAT基因家族成員進(jìn)化關(guān)系，以擬南芥、硬粒小麥和野生二粒小麥構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖1），將76個(gè)GPAT基因家族成員大致劃分為3類(lèi)：其中GroupⅠ（5個(gè)）約占6.57%，GroupⅡ（16個(gè)）約占21.05%，GroupⅢ（55個(gè)）約占72.36%，Group Ⅲ中又分為3個(gè)小類(lèi)（Ⅲ-a有21個(gè)、Ⅲ-b有8個(gè)、Ⅲ-c有26個(gè)），3個(gè)植物GPAT基因家族成員在3個(gè)大類(lèi)中的分布見(jiàn)表2。

圖1 擬南芥、硬粒小麥、野生二粒小麥GPAT基因家族進(jìn)化分析

表2 GPAT基因家族成員在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的分布情況

2.3 基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

為了進(jìn)一步研究GPAT蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域，以此推測(cè)相同結(jié)構(gòu)域可能具備的功能，利用MEME在線軟件對(duì)GPAT成員蛋白序列進(jìn)行分析，如圖2A所示，同一分組的大多數(shù)家族成員具有相似的Motif構(gòu)成，GroupⅠ和GroupⅡ的Motif缺失較為嚴(yán)重，而GroupⅢ幾乎涵蓋所有Motif，所有家族成員均含有Motif-2，推測(cè)該Motif可能具有特別的生物學(xué)功能。其中，Group Ⅰ除硬粒小麥GPAT蛋白成員外其他成員僅含有Motif-2。GroupⅡ所有GPAT蛋白成員均含有Motif-1、Motif-2，部分GPAT蛋白成員有Motif-3、Motif-5、Motif-7、Motif-9。

圖2 GPAT蛋白質(zhì)保守基序（A）、保守蛋白結(jié)構(gòu)功能域（B）和基因結(jié)構(gòu)分析（C）

同時(shí)，從圖2-B可知，GPAT家族成員中共檢測(cè)到7個(gè)保守蛋白結(jié)構(gòu)功能域，其分組與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的聚類(lèi)分析相似，在保守結(jié)構(gòu)域方面進(jìn)一步支持了GPAT基因家族分類(lèi)。其中，GroupⅠ家族成員蛋白結(jié)構(gòu)域較為保守，在組內(nèi)成員中均發(fā)現(xiàn)PLN02349結(jié)構(gòu)域；GroupⅡ組內(nèi)成員保守結(jié)構(gòu)域多樣性較高，鑒定到PLN02833、LPLAT_LPCAT1-like、LPLAT結(jié)構(gòu)域；GroupⅢ中發(fā)現(xiàn)PLN02177、PLN02499、PLN02588結(jié)構(gòu)域。

硬粒小麥與野生二粒小麥GPAT基因家族結(jié)構(gòu)大致可以分為2類(lèi)，這與大麥和青稞在基因結(jié)構(gòu)方面表現(xiàn)相似［8,10］。如圖2C所示，GroupⅠ和GroupⅡ內(nèi)基因的內(nèi)含子較多，大多在7~12個(gè)之間，硬粒小麥中TtGPAT2、TtGPAT6、TtGPAT30、TtGPAT32，野生二粒小麥中TdGPAT2、TdGPAT11、TdGPAT31、TdGPAT32的內(nèi)含子最多，由12個(gè)內(nèi)含子組成；GroupⅢ內(nèi)的基因結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，插入的內(nèi)含子較少，大部分在1~3個(gè)之間。

2.4 共線性分析

對(duì)擬南芥、硬粒小麥和野生二粒小麥進(jìn)行共線性分析，結(jié)果表明：硬粒小麥和擬南芥基因組中僅有2個(gè)基因存在共線性關(guān)系，硬粒小麥和野生二粒小麥的共線性基因?qū)?shù)目為66個(gè)，說(shuō)明四倍體小麥組間關(guān)系較為親密（圖3）。

圖3 GPAT基因在擬南芥、硬粒小麥和野生二粒小麥間的共線性分析

3 討論

本研究從硬粒小麥和野生二粒小麥中各鑒定到33個(gè)小麥GPAT基因家族成員，在數(shù)量上超過(guò)了大麥、青稞等其他禾本科作物。理化性質(zhì)結(jié)果表明：GPAT成員氨基酸長(zhǎng)度為149（TdGPAT19）~589（TtGPAT1），分子量為16.22 kDa（TdGPAT19）~62.76 kDa（TtGPAT1），等電點(diǎn)為5.92（TdGPAT5）~11.39（TdGPAT7），但絕大多數(shù)蛋白（56個(gè)）的pI大于8，說(shuō)明大多數(shù)GPATs蛋白富含堿性氨基酸，這與其他物種相似。

系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，四倍體小麥GPAT家族成員可分為3個(gè)分支，與擬南芥、玉米、大麥等其他物種研究結(jié)果相似［6-7,10］，硬粒小麥和野生二粒小麥GPAT家族成員分布在3個(gè)分支的基因數(shù)量幾乎一致，表明四倍體小麥組間相似性較高。結(jié)合基因結(jié)構(gòu)分析，GroupⅠ和GroupⅡ內(nèi)大部分成員含7~12個(gè)內(nèi)含子，GroupⅢ內(nèi)大部分成員僅含1~3個(gè)內(nèi)含子，表明相同亞家族中GPAT基因有著相似的基因結(jié)構(gòu)，且其進(jìn)化進(jìn)程和基因功能也具有一定的相似性。共線性分析顯示，硬粒小麥基因與擬南芥的共線性較低，但是與野生二粒小麥的共線性關(guān)系較高，說(shuō)明四倍體小麥之間親緣關(guān)系更近。