王婉麗，樊 馨，楊亞彬，李婷婷*

（1.西雙版納職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 景洪 666100； 2.西雙版納傣族自治州人民醫(yī)院，云南 景洪 666100）

馬兜鈴酸主要存在于馬兜鈴科的植物中，常見于關(guān)木通、廣防己等藥材，具有抗感染、抗腫瘤、增強(qiáng)細(xì)胞免疫等功能［1-2］。服用含馬兜鈴酸的中草藥或中成藥制劑會(huì)引起不同程度腎損害，被稱為馬兜鈴酸腎病［3-4］。馬兜鈴酸腎病是一種快速進(jìn)展的間質(zhì)性腎炎，不僅多種炎癥細(xì)胞在腎臟浸潤(rùn)、聚集和活化，參與腎小管的損傷過程，同時(shí)伴有多種炎癥因子水平上調(diào)［5-6］。因此，控制過度的炎癥反應(yīng)是對(duì)抗馬兜鈴酸腎毒性的重要途徑。

倒心盾翅藤為傣族常用“解藥”，系金虎尾科植物倒心盾翅藤AspidopterysobcordataHemsl.var.obcordata的干燥藤莖，收載于2005 年版《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)—傣族藥》，用于治療急慢性腎炎，療效確切［7-8］。作為傣醫(yī)臨床用量最大的藥材，倒心盾翅藤受到越來越多的關(guān)注，其化學(xué)成分和抗結(jié)石、抗腫瘤等生物活性的研究均取得了一定的進(jìn)展［9-10］。但是倒心盾翅藤抗炎的活性成分和治療腎炎的作用尚未完全明確。本研究建立脂多糖 （LPS） 刺激RAW264.7 細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型，對(duì)倒心盾翅藤抗炎活性成分進(jìn)行篩選，并評(píng)價(jià)其對(duì)馬兜鈴酸腎病過程中炎癥反應(yīng)的干預(yù)作用及機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 雄性SPF 級(jí)SD 大鼠，體質(zhì)量220 ～240 g，購(gòu)自斯貝福（北京） 生物技術(shù)有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （京） 2019-0010］，飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所SPF 動(dòng)物房，溫度22～28 ℃，相對(duì)濕度40% ～60%，12 h/12 h 明暗交替，自由攝食飲水，經(jīng)隔離觀察、適應(yīng)環(huán)境5 d 后用于實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)云南分所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)20190013）。

1.2 細(xì)胞 RAW264.7 細(xì)胞（貨號(hào)CM0190），購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司，使用含有10% 胎牛血清、1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%C O2［11］。每2 d 更換培養(yǎng)基，細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上時(shí)進(jìn)行傳代。

1.3 試劑與藥物 DMEM 高糖培養(yǎng)基、PBS （美國(guó)HyClone 公司，批號(hào)AD2496722、AE29431651）； 胰酶（美國(guó)Gibco 公司，批號(hào)2085646）； 胎牛血清（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，批號(hào)1919401）； LPS （美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)L2880）； CCK-8 試劑、NO 檢測(cè)試劑盒、弗氏完全佐劑（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)C0043、S0021S、P2036）； 蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒、電發(fā)光試劑盒、制膠試劑盒、電泳液、轉(zhuǎn)膜液、TBST、二抗goat anti-mouse、goat anti-rabbit （江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司，批號(hào)01364、30333、20405、60447、50439、01438、50451、40427、20426）； 大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA 檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Invitrogen 公司，批號(hào)KMC0061、BMS6002、BMS607-3）； 脫脂奶粉（美國(guó)BD公司，批號(hào)4239539）； p-p38、p-p65、β-actin 抗體（美國(guó)OriGene 公司，貨號(hào)RC206605、TA325803、TA81100S）；硝酸纖維素膜（德國(guó)Millipore 公司）； 多聚甲醛（合肥白鯊生物科技有限公司，批號(hào)BL539A）。醋酸潑尼松片（津藥藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)181019）。倒心盾翅藤、關(guān)木通均由西雙版納傣族自治州人民醫(yī)院提供，經(jīng)西雙版納傣族自治州人民醫(yī)院李婷婷副研究員分別鑒定為金虎尾科植物倒心盾翅藤AspidopterysobcordataHemsl.var.obcordata、馬兜鈴科植物木通馬兜鈴AristolochiamanshuriensisKom.。

1.4 儀器 SW-CJ-1F 超凈工作臺(tái)（江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司）； CKX41 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）； Spectra Max i3 酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular 公司）； DV 215CD 十萬分之一天平（美國(guó)OHAUS 公司）； 5200 Multi 全自動(dòng)熒光圖像分析系統(tǒng)、EPS300 電源（天能集團(tuán)）； 脫水機(jī)、包埋機(jī)、切片機(jī)、染色劑（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）。

2 方法

2.1 倒心盾翅藤不同部位提取物和關(guān)木通水提物的制備 倒心盾翅藤飲片粉碎后，加6 倍量50%乙醇回流提取，減壓濃縮至稠膏，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水萃取，減壓干燥獲得不同極性提取物，準(zhǔn)確稱取適量，加二甲基亞砜超聲溶解，調(diào)整質(zhì)量濃度為20 mg/mL。關(guān)木通飲片加8 倍量水回流提取2 次，每次2 h，合并藥液，減壓濃縮至生藥量為2 g/mL。

2.2 RAW264.7 細(xì)胞毒性檢測(cè) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7 細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)整密度為5.0×104/mL，每孔200 μL，接種到96 孔板中，待細(xì)胞貼壁后加入倒心盾翅藤不同部位提取物，質(zhì)量濃度分別為12.5、25、50、100、200 μg/mL，空白孔加入含1% 二甲基亞砜 （DMSO） 的DMEM 培養(yǎng)基，LPS 對(duì)照孔加入含1 μg/mL LPS 的DMEM培養(yǎng)基，各組均設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，孵育24 h 后，棄去含藥培養(yǎng)基，每孔加入DMEM 培養(yǎng)基100 μL、CCK-8 試劑10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，于酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.3 RAW264.7 細(xì)胞NO 水平檢測(cè) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7 細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)整密度為5.0×104/mL，每孔200 μL，接種到24 孔板中，培養(yǎng)24 h 后加藥進(jìn)行刺激。給藥組細(xì)胞加入不同質(zhì)量濃度倒心盾翅藤提取物（以不影響RAW264.7 細(xì)胞增殖為宜），空白組、LPS 組加入DMEM 培養(yǎng)基，各組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，孵育6 h 后棄去培養(yǎng)基。除空白組外各孔加入含1 μg/mL LPS 的DMEM 培養(yǎng)基，孵育24 h，每孔取細(xì)胞培養(yǎng)液50 μL 于96 孔板中，加入Griess Reagent Ⅰ、Ⅱ各50 μL，于540 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)A，以亞硝酸鈉為對(duì)照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算NO 水平。

2.4 動(dòng)物分組、給藥及取材 大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性組和倒心盾翅藤高、中、低劑量組，每組10 只。除空白組外，其余各組大鼠每天灌胃關(guān)木通水提液（60 g/kg），連續(xù)5 d［12］，第6 天將大鼠置于代謝籠中收集24 h 尿液，次日各組分別給藥。倒心盾翅藤低、中、高劑量組分別灌胃給予15、30、60 g/kg 倒心盾翅藤二氯甲烷部位的羧甲基纖維素鈉（CMC-Na） 混懸液，陽性組灌胃給予2.7 mg/kg 醋酸潑尼松，空白組、模型組灌胃給予等量CMCNa，連續(xù)7 d，末次給藥后再次收集24 h 尿液。大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈取血，全血靜置30 min，3 500 r/min 離心15 min，取上層血清于-20 ℃冰箱中保存待測(cè)； 處死大鼠，取雙腎，左腎于4%多聚甲醛中固定，右腎經(jīng)液氮冷凍后于-80 ℃冰箱中保存待測(cè)。

2.5 大鼠24 h 尿蛋白量、血清IL-1β、TNF-α、IL-6 水平檢測(cè)及腎組織HE 染色 BCA 法檢測(cè)大鼠尿液蛋白濃度后，根據(jù)尿液體積計(jì)算24 h 尿蛋白量。按照ELISA 試劑盒說明書檢測(cè)大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6 水平。大鼠腎組織經(jīng)多聚甲醛固定72 h，按常規(guī)程序脫水后包埋于石蠟中，連續(xù)失狀切片后進(jìn)行HE 染色。每個(gè)切片隨機(jī)選取3 個(gè)視野，觀察腎臟損傷情況，并參考文獻(xiàn)［13］ 報(bào)道方法進(jìn)行0 ～4半定量評(píng)分，標(biāo)準(zhǔn)為0 分，未發(fā)生病變； 1 分，病變部分≤20%； 2 分，病變部分20% ～40%； 3 分，病變部分40% ～80%； 4 分，病變部分≥80%。

2.6 Western blot 法檢測(cè)大鼠腎組織p38 MAPK/NF-κB p65信號(hào)通路蛋白表達(dá) 提取大鼠腎組織蛋白，BCA 法定量后稀釋至同一濃度。SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)膜，根據(jù)Marker 剪取目標(biāo)條帶，經(jīng)脫脂奶粉溶液封閉后，一抗4 ℃孵育過夜，TBST 清洗3 次后二抗室溫孵育2 h，TBST 清洗，ECL 試劑孵育3 min，凝膠成像系統(tǒng)顯影，使用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以內(nèi)參β-actin 灰度值進(jìn)行歸一化處理，計(jì)算p-p38、p-p65 蛋白表達(dá)。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過Graphpad Prism 6.01 軟件進(jìn)行處理，服從正態(tài)分布、方差齊性的數(shù)據(jù)以（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析，病理切片評(píng)分采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 倒心盾翅藤對(duì)RAW264.7 細(xì)胞增殖的影響 如表1 所示，與空白組比較，100、200 μg/mL 倒心盾翅藤石油醚部位，200 μg/mL 二氯甲烷部位，25 ～200 μg/mL 正丁醇部位，100、200 μg/mL 水提部位組細(xì)胞存活率降低（P＜0.05，P＜0.01），故將未明顯影響RAW264.7 細(xì)胞生長(zhǎng)的質(zhì)量濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 倒心盾翅藤對(duì)RAW264.7 細(xì)胞增殖的影響（±s，n＝3）

注： 與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別質(zhì)量濃度/（μg·mL-1） 細(xì)胞存活率/%空白組—100.00±0.00倒心盾翅藤石油醚部位組12.5101.27±4.56 25104.51±5.61 50101.80±4.31 10079.41±4.79**20052.62±4.64**倒心盾翅藤二氯甲烷部位組12.5103.44±3.54 25103.23±4.18 50102.27±3.55 100104.33±4.02 20084.48±6.20**倒心盾翅藤乙酸乙酯部位組12.5102.50±2.46 25102.41±4.01 50102.97±3.76 100100.54±5.01 200103.51±5.76倒心盾翅藤正丁醇部位組12.5102.74±3.54 2593.04±2.05*5077.99±5.28**10023.58±1.84**20027.91±2.38**倒心盾翅藤水部位組12.5101.12±2.57 25103.91±5.78 50101.88±4.47 10073.04±4.28**20056.37±5.49**

3.2 倒心盾翅藤二氯甲烷部位對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞釋放NO 的影響 如表2 所示，RAW264.7 細(xì)胞在正常狀態(tài)下，釋放NO 水平較低。與空白組比較，LPS 組RAW264.7細(xì)胞NO 水平升高（P＜0.01），表明細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型建立成功； 與LPS 組比較，25、50、100 μg/mL 倒心盾翅藤二氯甲烷部位組NO 釋放量降低（P＜0.05，P＜0.01），表明它可在該濃度范圍內(nèi)劑量依賴性地抑制LPS 誘導(dǎo)的NO釋放。

表2 倒心盾翅藤對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞NO 水平的影響（±s，n＝3）

表2 倒心盾翅藤對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞NO 水平的影響（±s，n＝3）

注： 與空白組比較，＃＃P＜0.01； 與LPS 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別質(zhì)量濃度/（μg·mL-1） NO/（μmol·L-1）空白組—7.28±2.27 LPS 組—71.50±5.27＃＃倒心盾翅藤石油醚部位組12.572.56±5.27 2566.77±5.26 5063.11±2.57倒心盾翅藤二氯甲烷部位組12.561.75±6.40 2555.25±5.45*5039.52±5.24**10023.89±3.49**倒心盾翅藤乙酸乙酯部位組12.569.25±3.28 2567.84±2.79 5070.84±2.47 10074.88±5.70 20064.35±3.12倒心盾翅藤正丁醇部位組12.567.13±6.79倒心盾翅藤水部位組12.566.15±3.60 2572.40±6.52 5069.21±3.55

3.3 倒心盾翅藤二氯甲烷部位對(duì)馬兜鈴酸腎病大鼠24 h尿蛋白量、血清炎癥因子水平的影響 如表3 所示，與空白組比較，模型組大鼠24 h 尿蛋白量和血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，倒心盾翅藤二氯甲烷部位各劑量組和陽性組24 h 尿蛋白量、血清炎癥因子水平降低（P＜0.01），提示倒心盾翅藤二氯甲烷部位可減輕馬兜鈴酸引起的腎臟損傷。

表3 各組大鼠24 h 尿蛋白量、血清炎癥因子水平比較（±s，n＝10）

表3 各組大鼠24 h 尿蛋白量、血清炎癥因子水平比較（±s，n＝10）

注： 與空白組比較，＃＃P＜0.01； 與模型組比較，**P＜0.01。

組別24 h 尿蛋白量/mgIL-1β/（μg·L-1）IL-6/（μg·L-1）TNF-α/（μg·L-1）空白組0.98±0.2321.25±4.0871.60±11.5822.45±3.08模型組5.60±1.31＃＃91.61±9.57＃＃259.91±16.01＃＃119.89±9.24＃＃陽性組2.56±1.00**45.24±7.56**111.94±13.15**37.98±6.07**倒心盾翅藤高劑量組2.64±0.68**44.59±4.76**151.71±16.12**42.83±5.70**倒心盾翅藤中劑量組3.29±0.86**48.16±6.13**167.50±19.11**66.08±6.14**倒心盾翅藤低劑量組3.39±0.71**68.09±4.75**205.64±15.40**89.38±5.96**

3.4 倒心盾翅藤二氯甲烷部位對(duì)馬兜鈴酸腎病大鼠腎組織病理形態(tài)的影響 如圖1、表4 所示，空白組大鼠腎組織無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腎小管上皮結(jié)構(gòu)完整，間質(zhì)血管無充血、擴(kuò)張，未見組織纖維化等病理改變； 模型組可見腎小管上皮細(xì)胞刷毛緣脫落、管腔擴(kuò)張、水變性、空泡變性、完全壞死，部分腎小球發(fā)生萎縮，球囊腔上皮脫落，腎間質(zhì)存在充血、出血、炎細(xì)胞浸潤(rùn)的現(xiàn)象，病理評(píng)分高于空白組（P＜0.01）； 與模型組比較，陽性組、倒心盾翅藤各劑量組大鼠腎小管損傷、變性，腎小球萎縮、間質(zhì)充血、炎細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變有不同程度的減輕，病理評(píng)分低于模型組（P＜0.05，P＜0.01）。

圖1 各組大鼠腎組織HE 染色（×200）

表4 各組大鼠腎組織病理評(píng)分比較（±s，n＝10）

表4 各組大鼠腎組織病理評(píng)分比較（±s，n＝10）

注： 與空白組比較，＃＃P ＜0.01； 與模型組比較，*P ＜0.05，**P＜0.01。

組別病理評(píng)分/分空白組1.00±0.00模型組3.73±0.45＃＃陽性組2.17±0.46**倒心盾翅藤高劑量組2.13±0.51**倒心盾翅藤中劑量組2.73±0.52*倒心盾翅藤低劑量組2.73±0.69*

3.5 倒心盾翅藤二氯甲烷部位對(duì)馬兜鈴酸腎病大鼠腎組織p38 MAPK/NF-κB p65 信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響 如圖2、表5 所示，與空白組比較，模型組大鼠腎組織p-p38、p-p65蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）； 與模型組比較，倒心盾翅藤二氯甲烷部位各劑量組p-p38、p-p65 蛋白表達(dá)降低 （P＜0.01），提示倒心盾翅藤抗炎作用與抑制p38 MAPK/NF-κBp65 信號(hào)通路活化、炎癥因子產(chǎn)生有關(guān)。

圖2 各組大鼠腎組織p-p38、p-p65 蛋白條帶

表5 各組大鼠腎組織p-p38、p-p65 蛋白表達(dá)比較（±s，n＝3）

表5 各組大鼠腎組織p-p38、p-p65 蛋白表達(dá)比較（±s，n＝3）

注： 與空白組比較，＃＃P＜0.01； 與模型組比較，**P＜0.01。

組別p-p38/β-actinp-p65/β-actin空白組2.55±0.1531.88±1.79模型組55.68±2.03＃＃42.04±2.71＃＃陽性組11.03±0.46**12.99±1.44**倒心盾翅藤高劑量組14.08±0.92**10.61±1.38**倒心盾翅藤中劑量組20.02±1.88**18.49±1.99**倒心盾翅藤低劑量組23.60±1.88**19.64±2.23**

4 討論

馬兜鈴酸腎病是由馬兜鈴酸引起的腎損傷，主要損傷部位在腎小管，根據(jù)病程進(jìn)展和病變程度可以分為急性型、慢性型和腎小管功能障礙型［14］。在多種急性型馬兜鈴腎病的動(dòng)物模型中，有多個(gè)炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活，說明炎癥參與了馬兜鈴酸損傷腎臟過程［15-17］。本研究利用LPS 誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 建立了體外炎癥模型［18］。在活化的RAW264.7 細(xì)胞中NO 的合成和釋放增加，過量NO 導(dǎo)致細(xì)胞損傷、組織壞死，進(jìn)而促進(jìn)炎癥的發(fā)生和發(fā)展。經(jīng)過體外的篩選，倒心盾翅藤二氯甲烷部位可以抑制巨噬細(xì)胞的活化，減少NO 的釋放，因此進(jìn)一步通過體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究其對(duì)馬兜鈴酸腎病的腎保護(hù)作用。

本研究利用關(guān)木通水提物灌胃復(fù)制了大鼠急性馬兜鈴腎病模型，造模7 d 后，大鼠24 h 尿蛋白量增加，血清中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 水平升高，說明腎臟出現(xiàn)損傷的同時(shí)伴有體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。模型組大鼠腎臟病理表現(xiàn)主要為急性腎小管壞死，腎小管上皮細(xì)胞崩解脫落，裸基底膜形成，細(xì)胞碎屑充填腎小管腔，腎間質(zhì)水腫，細(xì)胞浸潤(rùn)。經(jīng)過陽性藥或者倒心盾翅藤二氯甲烷部位干預(yù)后，24 h尿蛋白量和血清中炎癥因子水平降低，病理損傷有所減輕，提示倒心盾翅藤二氯甲烷部位的保護(hù)作用與抗炎存在一定關(guān)聯(lián)。

p38 MAPK/NF-κB p65 信號(hào)通路是炎癥反應(yīng)中重要的信號(hào)通路，MAPK 激活后可以通過活化NF-κB，促進(jìn)其轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，促使下游多種炎癥因子如IL-1β、IL-6、TNF-α 等表達(dá)，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生［19-20］。本研究結(jié)果表明，醋酸潑尼松和倒心盾翅藤二氯甲烷部位干預(yù)后，均能下調(diào)馬兜鈴酸腎病大鼠腎組織p38和p65 蛋白的磷酸化水平，從而抑制炎癥因子IL-1β、TNFα、IL-6 的合成和釋放。

綜上所述，倒心盾翅藤二氯甲烷部位能減輕馬兜鈴酸引起的急性腎臟損傷，該作用與調(diào)控p38 MAPK/NF-κB p65信號(hào)通路，抑制炎癥因子的產(chǎn)生相關(guān)。