婁瑩瑩，李佃貴，楊 倩，李 燕，王思月，王志成，胡 賀

（1.河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050011； 2.河北省中西醫(yī)結合胃腸病研究重點實驗室，河北 石家莊 050011； 3.河北中醫(yī)藥大學，河北 石家莊 050200）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC） 又稱為慢性非特異性潰瘍性結腸炎，現(xiàn)病因不明并且反復發(fā)作、輕重不等，腹部疼痛、便中帶黏液膿血、頻繁腹瀉、里急后重為其臨床表現(xiàn)，病位在乙狀結腸和直腸。該病發(fā)病率逐年上升，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)約有1/5 慢性UC 患者可能發(fā)展成結直腸癌［1-2］，稱之為“綠色癌癥”。UC 難以治愈，容易反復發(fā)作，嚴重影響個人健康和生活質量，對我國公共衛(wèi)生系統(tǒng)和社會造成巨大的挑戰(zhàn)［3］。

UC 普遍被認為與感染、精神心理、先天遺傳、自身免疫等綜合因素相關，但發(fā)病機制尚未完全明確［4］。內質網(wǎng)是細胞內的重要細胞器，腸上皮細胞（intestinal epithelial cells，IECs） 中含有大量豐富的內質網(wǎng)結構，在內質網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS） 持續(xù)、嚴重的情況下，激活蛋白激酶R 樣內質網(wǎng)激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK） -真核細胞起始因子2α （eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α） -C/EBP 同源蛋白 （C/EBP homologous protein，CHOP） 凋亡信號通路會引起細胞過度凋亡，導致腸黏膜損傷，是UC 發(fā)病的重要病理機制［5-6］。李佃貴教授以化濁解毒法為基本治療大法，在此基礎上提出潰瘍性結腸炎濁毒致病論，建立化濁解毒有效方劑——化濁解毒消癰方。前期研究表明，該方通過恢復Th1/Th2平衡、抑制UC 大鼠結腸上皮細胞的過度凋亡發(fā)揮抗炎作用［7-8］。本實驗進一步從調控PERK/eIF2α/ATF4/CHOP 信號通路角度出發(fā)，探討化濁解毒消癰方對UC 小鼠結腸黏膜的保護作用，從而探討其深層作用機制，為其臨床應用提供客觀依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物 化濁解毒消癰方由白頭翁12 g、藿香12 g、佩蘭12 g、茵陳15 g、黃連12 g、黃柏9 g、當歸12 g、白芍20 g、白花蛇舌草15 g、半枝蓮12 g、半邊蓮12 g、秦皮15 g、苦參9 g、廣木香9 g 組成，購于河北省中醫(yī)院中藥房，經(jīng)河北省中醫(yī)院相聰坤主任藥師鑒定為正品。美沙拉嗪腸溶片（0.25 g/片，批號210817），購自葵花藥業(yè)集團股份有限公司。

1.2 動物 SPF 級健康雄性C57BL/6 小鼠，體質量18 ～22 g，6～8 周齡，購自斯貝福（北京） 生物技術有限公司［實驗動物生產許可證號SCXK （京） 2019-0010］，飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院實驗動物中心動物房［實驗動物使用許可證號SYXK （冀） 2022-011］，SPF 級標準環(huán)境，溫度（23±5）℃，相對濕度30% ～60%，光照/黑暗12 h/12 h。本實驗通過河北中醫(yī)藥大學倫理委員會批準（倫理號DWLL2021053）。

1.3 試劑 葡聚糖硫酸鈉（DSS，北京百諾威生物科技有限公司，批號S414）； β-actin、eIF2α、ATF4 一抗（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號 AC2020730004、157018041802、82019051502）； PERK 一抗（美國CST 公司，批號437028）； CHOP 一抗（武漢三鷹生物技術有限公司，批號10003427）。

1.4 儀器 D3024R 臺式高速冷凍離心機［大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京） 股份公司］； Epoch 酶標檢測儀（美國BioTek公司）； NanoDrop2000 超微量分光光度計 （美國Thermo Fisher Scientific 公司）； alphaEaseFC 灰度分析軟件（美國Alpha Innotech 公司）； BV-2 垂直電泳儀（武漢賽維爾生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 將小鼠隨機分為正常組、模型組、美沙拉嗪組和化濁解毒消癰方高、中、低劑量組，每組8 只。除正常組外，其余各組給予小鼠2.5%葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS） 溶液自由飲用7 d，其間禁水，并每日更換新鮮DSS 溶液，誘導小鼠UC 模型。模型制備成功的標準為（1） 小鼠體質量明顯下降，出現(xiàn)腹瀉、便血癥狀； （2） 光鏡下HE 染色可見大量炎性細胞浸潤，伴有隱窩膿腫，杯狀細胞缺失，甚則可見潰瘍形成。根據(jù)人與小鼠劑量換算［9］，造模成功后化濁解毒消癰方高、中、低劑量組分別灌胃給予28.68、14.34、7.17 g/kg化濁解毒消癰方，美沙拉嗪組灌胃給予0.45 g/kg 美沙拉嗪，正常組和模型組灌胃給予等量生理鹽水，每天1 次，連續(xù)7 d。

2.2 疾病活動指數(shù)（DAI） 評分 參照Murano 等制定的DAI 評分標準，觀察整個實驗過程中小鼠的生理狀況，包括精神狀態(tài)、糞便、活動、毛發(fā)、體質量、飲食等變化，進行DAI 評分，評分標準見表1。DAI ＝ （體質量下降分數(shù)＋糞便性狀分數(shù)＋便血情況分數(shù)） /3。

表1 DAI 評分標準

2.3 結腸黏膜大體觀與組織病理學觀察 取結腸組織，肉眼觀察其形態(tài)變化。取部分上述組織，經(jīng)脫水、包埋、制備切片后行常規(guī)HE 染色，于光鏡下觀察病理形態(tài)變化。

2.4 RT-qPCR 法檢測結腸組織PERK、eIF2α、ATF4、CHOPmRNA 表達 取100 mg 結腸組織，TRIzol 一步法提取總RNA，使用Nanodrop 2000 超微量分光光度計檢測RNA 濃度、純度，稀釋至終質量濃度100 ～500 ng/μL。RNA 于PCR 儀上進行反轉錄，然后進行PCR 擴增反應，以GAPDH為內參，2-ΔΔCT法計算目的基因mRNA 相對表達。引物序列見表2。

2.5 Western blot 法檢測結腸組織PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表達 取100 mg 結腸組織，加10 倍量裂解液進行勻漿，于冰上裂解30 min，離心后取上清液，使用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，蛋白加熱變性后上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉膜后，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉30 min，加一抗（1 ∶1 000） 4 ℃搖床孵育過夜，次日洗膜3 次，加二抗（1 ∶3 000） 室溫孵育30 min，洗膜3 次后在暗室中顯影、定影，使用Alpha 軟件處理并分析目標條帶的光密度值，計算目的蛋白相對表達。

2.6 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 26.0 軟件，計量資料以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊者組間比較采用LSD 檢驗，方差不齊者組間比較采用Dunnett’s 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 各組小鼠一般情況 正常組小鼠皮毛光滑，精神狀態(tài)佳，反應靈敏，飲水量及進食量正常，體質量稍增加； 模型組小鼠皮毛光澤度差，易掉毛，精神狀態(tài)差，反應遲鈍，飲水量、進食量及體質量下降； 給藥7 d 后，美沙拉嗪組和化濁解毒消癰方各劑量組小鼠一般情況改善，掉毛減少，精神狀態(tài)尚可，活動度尚可，飲水量、進食量及體質量有一定程度恢復。實驗過程中模型組死亡2 只，化濁解毒消癰方高、中劑量組各死亡1 只，低劑量組死亡1 只。

3.2 化濁解毒消癰方對UC 小鼠DAI 評分的影響 與正常組比較，模型組小鼠DAI 評分升高（P＜0.05）； 與模型組比較，化濁解毒消癰方各劑量組和美沙拉嗪組小鼠DAI 評分均降低（P＜0.05）； 與美沙拉嗪組比較，化濁解毒消癰方高劑量組小鼠DAI 評分無明顯變化（P＞0.05），中、低劑量組小鼠DAI 評分升高（P＜0.05），見表3。

表3 各組小鼠DAI 評分比較（±s）

表3 各組小鼠DAI 評分比較（±s）

注： 與正常組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與美沙拉嗪組比較，▲P＜0.05。

組別動物數(shù)/只DAI 評分/分正常組80.00±0.00模型組62.25±0.24*美沙拉嗪組80.92±0.24?；瘽峤舛鞠b方高劑量組71.07±0.43?；瘽峤舛鞠b方中劑量組71.67±0.27?！瘽峤舛鞠b方低劑量組61.62±0.30＃▲

3.3 化濁解毒消癰方對UC 小鼠結腸組織病理形態(tài)的影響 正常組小鼠結腸組織正常，黏膜光滑，可見上皮組織與腺體結構完整、排列整齊，未出現(xiàn)充血、水腫及潰瘍；模型組小鼠結腸組織嚴重損傷，黏膜水腫、充血，發(fā)現(xiàn)糜爛、潰瘍灶形成，腺體排列紊亂，有大量炎性細胞浸潤腸組織； 與模型組比較，化濁解毒消癰方高劑量組和美沙拉嗪組小鼠結腸組織病理性損傷緩解，黏膜基本光滑，充血、水腫程度減輕，潰瘍較少并出現(xiàn)已愈合的潰瘍面，有基本完整的腺體結構伴隨較少的被炎性細胞浸潤的腸組織； 化濁解毒消癰方中、低劑量組結腸組織病理性損傷減輕，黏膜表面欠光滑，輕度充血水腫，可見潰瘍面和少量被破壞的腺體結構，出現(xiàn)潰瘍面及邊緣覆少量新生腺體，見圖1。

圖1 各組小鼠結腸組織HE 染色

3.4 化濁解毒消癰方對UC 小鼠結腸組織PERK、eIF2α、ATF4、CHOPmRNA 表達的影響 與正常組比較，模型組小鼠結腸組織PERK、eIF2α、ATF4、CHOPmRNA 表達升高（P＜0.05）； 與模型組比較，化濁解毒消癰方各劑量組和美沙拉嗪組小鼠結腸組織PERK、eIF2α、ATF4、CHOPmRNA 表達降低（P＜0.05）； 與美沙拉嗪組比較，化濁解毒消癰方高劑量組小鼠結腸組織PERK、eIF2α、ATF4、CHOPmRNA 表達無明顯變化（P＞0.05），中、低劑量組PERK、eIF2α、ATF4、CHOPmRNA 表達升高（P＜0.05），見表4。

表4 各組小鼠結腸組織PERK、eIF2α、ATF4、CHOP mRNA 表達比較（±s）

表4 各組小鼠結腸組織PERK、eIF2α、ATF4、CHOP mRNA 表達比較（±s）

注： 與正常組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與美沙拉嗪組比較，▲P＜0.05。

組別動物數(shù)/只PERKeIF2αATF4CHOP正常組80.68±0.070.77±0.090.89±0.090.78±0.11模型組61.71±0.14*1.90±0.18*2.08±0.14*2.34±0.29*美沙拉嗪組80.92±0.05＃1.07±0.04＃1.16±0.05＃1.09±0.14?；瘽峤舛鞠b方高劑量組70.88±0.09＃1.06±0.13＃1.19±0.12＃1.11±0.12＃化濁解毒消癰方中劑量組71.09±0.11?！?.34±0.13＃▲1.44±0.11?！?.43±0.09＃▲化濁解毒消癰方低劑量組61.39±0.12?！?.62±0.13＃▲1.70±0.12?！?.85±0.10＃▲

3.5 化濁解毒消癰方對UC 小鼠結腸組織PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組小鼠結腸組織PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表達升高（P＜0.05）； 與模型組比較，化濁解毒消癰方各劑量組和美沙拉嗪組小鼠結腸組織PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表達降低（P＜0.05）； 與美沙拉嗪組比較，化濁解毒消癰方高劑量組小鼠結腸組織PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表達無明顯變化 （P＞0.05），中、低劑量組PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表達升高（P＜0.05），見表5、圖2。

圖2 各組小鼠結腸組織 PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白條帶

表5 各組小鼠結腸組織PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表達比較（±s）

表5 各組小鼠結腸組織PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表達比較（±s）

注： 與正常組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與美沙拉嗪組比較，▲P＜0.05。

組別動物數(shù)/只PERK/β-actineIF2α/β-actinATF4/β-actinCHOP/β-actin正常組80.30±0.030.22±0.020.08±0.010.19±0.01模型組60.88±0.02*0.49±0.14*0.46±0.03*0.66±0.02*美沙拉嗪組80.38±0.01＃0.25±0.01＃0.12±0.01＃0.30±0.16?；瘽峤舛鞠b方高劑量組70.41±0.01＃0.27±0.01＃0.18±0.02＃0.29±0.12?；瘽峤舛鞠b方中劑量組70.57±0.02＃▲0.31±0.02?！?.17±0.02?！?.45±0.16＃▲化濁解毒消癰方低劑量組60.71±0.04?！?.38±0.02＃▲0.27±0.12?！?.60±0.17?！?/p>

4 討論

UC 作為炎癥性腸病中的一種，發(fā)病率和患病率增長迅速，預計到2025 年我國將有150 萬例炎癥性腸病患者［10］，且具有發(fā)展成結直腸癌的風險［11-13］。UC 發(fā)生發(fā)展的重要原因之一是腸上皮細胞的過度凋亡［14］。通過抑制腸上皮細胞的過度凋亡，可以促進腸黏膜愈合，實現(xiàn)治療UC 的作用。

細胞凋亡可以通過內在線粒體通路、外在死亡受體通路和內質網(wǎng)通路來觸發(fā)。內質網(wǎng)通路主要是通過ERS 誘導細胞凋亡，強烈持續(xù)的ERS 是誘導腸上皮細胞凋亡的重要途徑。細胞器受到內外環(huán)境應激因素的刺激，胞內穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化，尤其是內質網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER） 功能紊亂，導致未折疊或錯誤折疊的蛋白大量堆積，引起ERS，細胞內穩(wěn)態(tài)被破壞，引起蛋白質翻譯程度下降、靶基因轉錄上調，這種反應稱為未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）［15］。嚴重且持續(xù)的ERS 會造成內質網(wǎng)反應超負荷，促生存模式的UPR 會立即轉為促凋亡模式，下游通路PERK/eIF2α/ATF4、IRE1/JNK/caspase12 和ATF6 分別激活，形成ERS 介導的細胞凋亡信號轉導途徑［16］。本實驗發(fā)現(xiàn)通過PERK/eIF2α/ATF4/CHOP 途徑可以調控ERS介導細胞凋亡。PERK 通過對自身磷酸化并且催化elF2α，對細胞中蛋白質的合成起到抑制作用，進而減輕內質網(wǎng)壓力，同時通過活化轉錄活化因子4 （activating transcription factor 4，ATF4），上調內質網(wǎng)應激誘導細胞凋亡標志性蛋白CHOP 的表達。CHOP 一方面對抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達抑制，另一方面對抗促凋亡蛋白基因BAX/BA、BIM 的表達上調，破壞內質網(wǎng)膜完整性，使Ca2＋向胞質外流； 同時CHOP 激活一系列信號傳導途徑上調caspase3 表達，最終誘發(fā)細胞凋亡［17-19］。研究發(fā)現(xiàn)，腸上皮細胞發(fā)生ERS 時，PERK/eIF2α 通路的激活可導致UC 發(fā)生發(fā)展［20-21］。

目前中醫(yī)藥治療UC 在臨床上效果顯著。國醫(yī)大師李佃貴教授首創(chuàng)中醫(yī)新理論—— “濁毒理論”，認為濁毒稽留體內，會對人體氣血、臟腑等造成影響，致使人體陰陽平衡失調而發(fā)病，“濁毒” 貫穿UC 發(fā)展始終，肝郁、脾弱、腎虛為本，以濁毒、瘀為標［22］?；瘽峤舛鞠b方由白頭翁湯、當歸芍藥散、香連丸三方加減化裁而來，治療UC 療效顯著。本研究結果表明，經(jīng)化濁解毒消癰方干預后，UC 小鼠DAI 評分降低，結腸組織病理形態(tài)有所改善。與正常組比較，模型組小鼠PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 表達均升高； 經(jīng)化濁解毒消癰方給藥后，小鼠PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 表達均降低，其中高劑量組作用最佳，并且與美沙拉嗪組效果相當。

綜上所述，DSS 誘導UC 小鼠中，ERS 參與了UC 發(fā)生發(fā)展，化濁解毒消癰方對UC 小鼠的腸黏膜保護作用可能是通過抑制ERS 介導的PERK/eIF2α/ATF4/CHOP 信號通路，抑制腸上皮細胞凋亡，減輕腸道黏膜損傷實現(xiàn)的。本研究為開發(fā)UC 相關的新靶點藥物提供了新的依據(jù)。課題組將進一步挖掘化濁解毒中藥深層作用機制，探討與中醫(yī)“濁毒”契合的分子基礎，為臨床治療UC 進一步提供特色、有效藥物。