羅 田，賀智勇，茅向軍，2，沈祥春，陶 玲*，許乾麗，3*

［1.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州省天然藥物資源高效利用工程中心（貴州省高等學(xué)校天然藥物藥理與成藥性評價特色重點實驗室，貴州醫(yī)科大學(xué)-貴陽市聯(lián)合重點實驗室，天然藥物資源優(yōu)效利用重點實驗室），貴州 貴陽 550025； 2.貴州省藥品監(jiān)督管理局檢查中心，貴州 貴陽 550081； 3.貴州省食品檢驗檢測院，貴州 貴陽 550004］

藥品質(zhì)量檢驗方法是保證藥品合格性的關(guān)鍵［1］，進一步發(fā)展藥品質(zhì)量檢驗方法具有一定意義。燈盞花乙素是從菊科植物燈盞花中提取出的主要活性成分［2］，具有抗炎、抗氧化、抑制血小板聚集、保護血管內(nèi)皮等作用［3-5］，可用于治療各種心腦血管疾病［6-8］。但該成分脂水溶解性差，生物利用度低，導(dǎo)致相關(guān)傳統(tǒng)劑型限制了其臨床應(yīng)用。

脂微球遞送系統(tǒng)是平均粒徑為200 nm 的亞微乳遞送系統(tǒng)，作為一種新型藥物轉(zhuǎn)運系統(tǒng)具有選擇性蓄積于炎癥部位的特點和優(yōu)勢［9］。課題組前期根據(jù)文獻［10-12］ 報道，先將燈盞花乙素制成磷脂復(fù)合物以提高其脂溶性，再進一步將其制成脂微球，以期為開發(fā)可更好透過血腦屏障的相關(guān)制劑提供參考。

另外，乳劑中游離脂肪酸過高會導(dǎo)致心力衰竭、高血壓、2 型糖尿病［13-15］； 油相容易氧化產(chǎn)生過氧化物，破壞人體細胞膜的正常生理功能，引發(fā)安全問題［16］，故游離脂肪酸含量、過氧化值、甲氧基苯胺值等是衡量脂肪乳質(zhì)量的重要指標。為了保障燈盞花乙素磷脂復(fù)合物脂微球安全性，本實驗測定上述指標以建立該制劑質(zhì)量控制方法。

1 材料

85-2B 型恒溫加熱磁力攪拌器（金壇市科析儀器有限公司）； ME104/02 型電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司］； PB-10 型PH 計（德國賽多利斯公司）；BS-223S 型電子天平 （北京賽多利斯儀器有限公司）；KQ3200 型超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；UltiMate 3000 型高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher 公司）； NanoBrook 90Plus PALS 型激光粒度儀（美國布魯克海文儀器公司）。

燈盞花乙素對照品（成都克洛瑪生物科技有限公司，批號CHB18060，純度≥95%）。注射用大豆磷脂、蛋黃卵磷脂（上海太偉藥業(yè)股份有限公司）； 注射用中鏈脂肪酸甘油三酯、注射用甘油（浙江遂昌惠康藥業(yè)有限公司）；注射用大豆油（浙江田雨山藥用油有限公司）； 泊洛沙姆188 （F-68，西安悅來醫(yī)藥科技有限公司）； 對甲氧基苯胺（薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司）； 棕櫚酸（梯希愛上海化成工業(yè)有限公司，純度≥97.0%）； 油酸、四氫呋喃（西隴科學(xué)股份有限公司）。乙腈、甲醇為色譜純（美國天地公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 磷脂復(fù)合物制備 根據(jù)文獻［10-12］ 報道和課題組前期優(yōu)化結(jié)果，精密稱取燈盞花乙素原料藥0.6 g、大豆磷脂1.8 g，溶于20 mL 混合溶劑（甲醇∶四氫呋喃＝1 ∶1）中，35 ℃水浴恒溫冷凝回流2.5 h，減壓回收溶劑，加入適量二氯甲烷以充分溶解大豆磷脂、磷脂復(fù)合物，過0.22 μm 微孔濾膜，適量二氯甲烷沖洗濾膜，合并濾液、洗液，減壓除去二氯甲烷，即得，干燥12 h，收集濾膜上的沉淀，計算復(fù)合率，公式為復(fù)合率＝ ［（W總-W沉） /W總］ ×100%（W沉為未復(fù)合燈盞花乙素沉淀量，W總為燈盞花乙素投藥量），結(jié)果為（93.21±1.09）%。

2.2 脂微球制備 稱取F-68 0.3 g、注射用甘油1.25 g，分散于適量超純水中，65 ℃磁力攪拌混合均勻，作為水相； 稱取蛋黃卵磷脂0.6 g、中鏈脂肪酸甘油三酯3.75 g、大豆油1.25 g、油酸0.25 g，磷脂復(fù)合物25 mg，超聲溶解，作為油相，用注射器將油相緩慢加到水相中，高速剪切得初乳，稀NaOH 調(diào)節(jié)pH 值，待溫度降至室溫后進行均質(zhì)，即得。同法制備不含磷脂復(fù)合物的空白脂微球。

2.3 燈盞花乙素含量測定 采用HPLC 法。

2.3.1 色譜條件 Ultiamte?LP-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相乙腈-0.2%磷酸（20 ∶80）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測波長334 nm； 進樣量10 μL。

2.3.2 溶液制備

2.3.2.1 對照品溶液 精密稱取燈盞花乙素對照品10 mg，置于50 mL 量瓶中，適量甲醇溶解并定容，得0.2 mg/mL貯備液，精密吸取1 mL 至10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2.2 供試品溶液 精密吸取脂微球乳液0.8 mL，置于10 mL 量瓶中，加適量甲醇超聲破乳溶解，定容，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2.3 空白溶液 精密吸取空白脂微球溶液0.8 mL，置于10 mL 量瓶中，加適量甲醇超聲破乳溶解，定容，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 方法學(xué)考察

2.3.3.1 專屬性試驗 精密吸取對照品、供試品、空白溶液各10 μL，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，輔料對測定無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 燈盞花乙素HPLC 色譜圖

2.3.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取貯備液0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20、6.40 mL，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，制成系列質(zhì)量濃度，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定。以對照品峰面積（Y） 對質(zhì)量濃度（X） 進行回歸，得方程為Y＝0.417X-0.112 7 （r＝0.999 8），在1～128 μg/mL 范圍內(nèi)內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3.3 精密度試驗 取對照品溶液適量，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定6 次，測得燈盞花乙素峰面積RSD為0.95%，表明儀器精密度良好。

2.3.3.4 重復(fù)性試驗 精密吸取脂微球6 份，按“2.3.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定，測得燈盞花乙素含量RSD 為1.35%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3.5 穩(wěn)定性試驗 精密吸取脂微球乳液0.8 mL，置于10 mL 量瓶中，按“2.3.2.2” 項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、6、8、10、12 h 在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定，測得燈盞花乙素峰面積RSD 為2.22%，表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3.6 加樣回收率試驗 精密吸取空白脂微球0.8 mL，共9 份，置于10 mL 量瓶中，分別精密加入200 μg/mL 貯備液100、125、150 μL，按“2.3.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，燈盞花乙素平均加樣回收率分別為89.85%、97.52%、92.98%，RSD 分別為1.87%、1.12%、0.35%。

2.3.4 樣品含量測定 精密量取脂微球乳液3 份，按“2.3.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定，計算含量。結(jié)果，燈盞花乙素平均含量為（35.77±0.14） μg/g。

2.4 外觀形態(tài)觀察 所得脂微球為乳白色，在透射電鏡下呈球形或類球形，流動性良好，分布均一，見圖2。

圖2 燈盞花乙素磷脂復(fù)合物脂微球透射電鏡圖

2.5 專屬性試驗 取對照品、供試品溶液適量，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定。結(jié)果，兩者中燈盞花乙素色譜峰保留時間一致，均為7.46 min，并且分離度理想，表明該方法專屬性良好。

2.6 pH 值測定 制備3 批樣品，按照2020 年版《中國藥典》 四部（通則0631） 測定pH 值，結(jié)果為7.00 ～7.05，符合人體pH 值。

2.7 粒徑測定 取脂微球乳液適量，適量水稀釋后加到樣品池中，測定其粒徑，結(jié)果平均值為（160.59±4.46） nm，見圖3。

圖3 燈盞花乙素磷脂復(fù)合物脂微球粒徑分布

2.8 酸值測定 稱取脂微球適量，按照2020 年版《中國藥典》 四部 （通則0713） 測定酸值，結(jié)果平均值為（0.94±0.01） mg/g。

2.9 甲氧基苯胺值測定 參考文獻［17］ 報道。

精密稱取脂微球5 g，置于50 mL 圓底燒瓶中，加20 mL無水乙醇，60 ℃水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)15 min，重復(fù)3次以除盡水分，加異丙醇-異辛烷混合溶液（2 ∶8） 使殘渣溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL 量瓶中，混合溶液稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

精密吸取上述供試品溶液、混合溶液各5 mL，分別置于甲、乙2 支10 mL 具塞試管中，精密加入含0.25%對甲氧基苯胺的冰醋酸溶液1 mL （當天制備，以異丙醇-異辛烷為參比，1.00 cm 比色池，在350 nm 波長處測定吸光度，其數(shù)值不得大于0.2），振搖，避光放置10 min，以乙管中溶液為空白，采用紫外-可見分光光度法在350 nm 波長處測定甲管中樣品溶液吸光度； 另取供試品溶液適量，以混合溶液為空白，在350 nm 的波長處測定吸光度A0。結(jié)果，3 批樣品中甲氧基苯胺值分別為0.81、0.77、0.83，未超過5.0，均符合限度要求。

2.10 游離脂肪酸含量測定 參考文獻［18］ 報道。

精密稱取棕櫚酸（因處方中含有油酸，故稱取量為0.153 9 g），置于50 mL 量瓶中，正庚烷稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

精密吸取上述對照品、“2.3.2.2” 項下供試品溶液各1 mL，置于10 mL 具塞試管中，加入異丙醇-正庚烷-0.5 mol/L 硫酸混合溶液（40 ∶10 ∶1） 5.0 mL，振搖1 min，靜置10 min，供試品溶液中精密加入正庚烷、水各3 mL，對照品溶液中精密加入正庚烷2 mL、水4 mL，密塞，上下翻轉(zhuǎn)10 次，靜置至少15 min 分層，精密量取上層液3 mL，置于10 mL 離心管中，加尼羅藍指示液l mL，在通氮氣條件下用氫氧化鈉滴定液滴至溶液顯淡紫色，規(guī)定供試品溶液消耗氫氧化鈉滴定液（0.01 mol/L） 體積不得大于對照品溶液消耗氫氧化鈉滴定液（0.01 mol/L） 體積。結(jié)果，3批樣品中游離脂肪酸含量分別為3.61、3.49、3.61 mmol/L，未超過7 mmol/L，均符合限度要求。

2.11 過氧化值測定 參考文獻［19］ 報道。取三氯甲烷-冰醋酸混合溶液（2 ∶3） 30 mL，置于150 mL 碘量瓶中，通氮氣10 min，精密稱取脂微球5.0 g，迅速加到碘量瓶中，蓋上塞子輕輕振搖，精密加入碘化鉀飽和溶液0.5 mL，密塞避光，振搖萃取3 min，加新沸并放冷的水30 mL，Na2S2O3滴定液（0.01 mol/L） 滴定并充分振搖直至黃色消失，加淀粉指示液5 mL，Na2S2O3滴定液（0.01 mol/L）滴定并充分振搖至紫藍色消失，同時進行空白試驗校正，規(guī)定消耗的Na2S2O3滴定液（0.01 mol/L） 體積不得超過1.0 mL。結(jié)果，3 批樣品過氧化值分別為0.56、0.40、0.40 mmol/kg，未超過6 mmol/kg，均符合限度要求。

2.12 有關(guān)物質(zhì)檢查 參考文獻［20］ 報道。

2.12.1 色譜條件 同“2.3.1” 項。

2.12.2 破壞性試驗 未破壞： 精密吸取“2.3.2.2” 項下供試品溶液1.0 mL，置于25 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，再精密吸取1 mL 至10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度。

酸破壞： 精密吸取 “2.3.2.2” 項下供試品溶液1.0 mL，置于150 mL 錐形瓶中，加入1 mol/L 鹽酸10 mL，加熱回流4 h，冷卻，甲醇反復(fù)洗滌后移至25 mL 量瓶中，精密吸取1 mL 至10 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，作為酸破壞產(chǎn)物。

堿破壞： 精密吸取 “2.3.2.2” 項下供試品溶液1.0 mL，置于150 mL 錐形瓶中，加入1 mol/L 氫氧化鈉10 mL，加熱回流4 h，冷卻，甲醇反復(fù)洗滌后移至25 mL 量瓶中，精密吸取1 mL 至10 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，作為堿破壞產(chǎn)物。

氧化破壞： 精密吸取 “2.3.2.2” 項下供試品溶液1.0 mL，加入30%過氧化氫10 mL，靜置2 h，精密吸取1 mL至10 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，作為氧化產(chǎn)物。

熱破壞： 精密吸取 “2.3.2.2” 項下供試品溶液1.0 mL，置于坩堝中，放到150 ℃烘箱中干燥2 h，冷卻，甲醇反復(fù)洗滌后移至25 mL 量瓶中并定容，精密吸取1.0 mL至10 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，作為熱解產(chǎn)物。

2.12.3 結(jié)果分析 圖4B、4C、4E 顯示，燈盞花乙素色譜峰完全消失，其前后無雜質(zhì)峰出現(xiàn)，表明脂微球在酸性、堿性、高溫條件下均被破壞，而且無相關(guān)雜質(zhì)產(chǎn)生； 圖4D顯示，燈盞花乙素色譜峰峰面積減小，說明脂微球在氧化條件下穩(wěn)定性較差。

圖4 破壞性試驗HPLC 色譜圖

3 討論與結(jié)論

2020 年版《中國藥典》 規(guī)定，當待測成分含量小于100 μg/g 時，其加樣回收率限度為85% ～110%，而本實驗測得3 批燈盞花乙素磷脂復(fù)合物脂微球中原料藥平均含量為（35.77±0.14） μg/g，加樣回收率為89.85% ～97.52%，符合上述要求。另外，該制劑粒徑范圍為46.60 ～564.75 nm，平均值為160 nm，并且90%的乳滴粒徑均在1 μm 以下，未檢測出＞5 μm 者［21］，表明其分布范圍合理。

在游離脂肪酸含量、過氧化值測定過程中均通入氮氣，可避免從空氣中導(dǎo)入額外的氧化產(chǎn)物而產(chǎn)生誤差。在甲氧基苯胺測定過程中采用少量多次的方法加入乙醇，并減壓回收該溶劑以除盡水分，可防止相關(guān)氧化物質(zhì)干擾，并控制氧含量。在燈盞花乙素磷脂復(fù)合物制備過程中采用四氫呋喃、二氯甲烷、甲醇，三者均屬于二類有機溶劑。

文獻［22］ 報道，在差示掃描量熱法檢測過程中殘留溶劑會升溫吸熱，產(chǎn)生吸熱峰。但課題組前期發(fā)表的燈盞花乙素磷脂復(fù)合物表征文獻中，熱分析結(jié)果顯示未產(chǎn)生其他明顯吸熱峰，故本實驗未對其溶劑殘留進行檢測。

在有關(guān)物質(zhì)檢查過程中，酸堿破壞選擇回流方式，可減少加熱過程中溶劑揮發(fā)及反應(yīng)物混入生成物中，從而提高相關(guān)雜質(zhì)的純度。

綜上所述，上述方法檢測靈敏度高，專屬性強，重復(fù)性好，可較好地評價燈盞花乙素磷脂復(fù)合物脂微球質(zhì)量。