周海玲,王靜,艾弗遜,王曉琳,尹穎

（污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京大學環(huán)境學院，南京，210023）

顆粒態(tài)污染物由于獨特的性質被廣泛應用于生產生活，但在生產運輸及使用中難以避免進入環(huán)境并產生生態(tài)效應，在環(huán)境中常常通過吸附、絡合等途徑與其他污染物相互作用，最終毒性表現出協(xié)同或拮抗作用.例如微塑料（MPs）可通過吸附作用減少納米銅及Cu2+的毒害作用，降低對中肋骨條藻（Skeletonema costatum）的毒性［1］，但同時也可與納米金表現出協(xié)同作用，增強對大型蚤（Daphnia magna）的生殖毒性并誘導子代死亡［2］.

納米氧化鋅（ZnO NPs）作為一種常見的顆粒態(tài)污染物，憑借其優(yōu)良性質被廣泛應用，同時對生態(tài)系統(tǒng)及其中的生物產生作用［3］.研究表明，ZnO NPs 可對生物造成氧化損傷［4］，還具有胚胎毒性和神經毒性［5］等.Kaya et al［6］報道了ZnO NPs 對尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）的不同器官都造成了一定程度的氧化損傷，且粒徑為10～30 nm 的ZnO NPs 毒性強于粒徑為100 nm 的ZnO NPs.劉倩等［7］研究ZnO NPs 對D.magna的效應時發(fā)現ZnO NPs 可以黏附在D.magna腸道和體表，從而對其產生個體及行為毒性.

MPs 因其粒徑小，比表面積大，所以具有較強的吸附能力，可以吸附環(huán)境中的重金屬［8］及各種污染物［9］，并作為載體改變它們在生物體內的積累情況和生物毒性，最終產生的毒性表現為協(xié)同、相加和拮抗作用［10-11］.MPs 可改變貽貝（Perna viridis）對全氟辛烷磺酸類物質的氧化應激響應，使內臟中MDA 含量升高［12］.粒徑為50 nm 的聚苯乙烯MPs（Polystyrene Microplastic，PS MPs）和菲共暴露對D.magna的毒性具有相加效應［11］，在14 d 的培養(yǎng)過程中PS MPs 顯著增加了生物體內的菲累積.目前對于MPs 與其他污染物的復合效應，研究對象多為有機污染物和重金屬，而與納米金屬氧化物的復合影響研究較少，兩種典型的顆粒態(tài)污染物是否會在水生態(tài)系統(tǒng)中不穩(wěn)定或易沉降，從而改變污染物的生態(tài)效應，現階段鮮見報道.

本實驗通過不同濃度PS MPs 與ZnO NPs 的共暴露實驗，研究兩者在水環(huán)境中的賦存狀態(tài)及其對錦鯽的生物效應，為MPs 和納米金屬氧化物對水生態(tài)環(huán)境的影響及機制研究提供更多的理論依據.

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑ZnO NPs（上海麥克林生化科技有限公司，中國）粒徑為（30±10）nm，純度99.9%.苯乙烯（上海凌峰化學試劑有限公司，中國）使用前先經減壓蒸餾純化處理去除所含阻燃劑.錦鯽（Carassius auratus）購于南京市夫子廟花鳥市場.

PS MPs 的制備：采用分散聚合的方式制備實驗所用PS MPs［13］，向140 mL 純水中充入N210 min 后，保持180 r·min-1滴加苯乙烯，在室溫下攪拌分散10 min.再加入10 mL 已通N25 min 的過硫酸鉀溶液（23 g·L-1），調節(jié)N2流速至平衡系統(tǒng)勻速冒泡.之后使用油浴鍋（98-3 型，予華儀器有限公司，中國）在78 ℃條件下加熱1～2 h，繼續(xù)反應24 h.反應過程中持續(xù)通入N2防止產物發(fā)生氧化，連續(xù)合成24 h 后取出產物洗滌純化.

1.2 實驗設計隨機選取生長狀態(tài)一致的健康錦鯽分別暴露于設置的濃度條件下（表1），每組八條魚，每缸中共30 L 暴露液.經10 d 適應階段及馴養(yǎng)階段，前3 d 為適應階段，不喂食不換水，后續(xù)7 d 為馴養(yǎng)階段，間隔一天換水喂食，之后開始暴露實驗.本研究采取靜態(tài)暴露，按照對應濃度分別稱取PS MPs 和ZnO NPs 粉末加入到100 mL 超純水中，超聲分散10 min 后轉移到魚缸中.暴露實驗持續(xù)兩周，其間采用半換水法.

表1 各處理組污染物濃度Table 1 The materials and contents of each group

1.3 樣品采集暴露結束后撈出錦鯽，用超純水沖洗干凈皮膚，稱重后迅速解剖，剪下左側魚肉，取出肝臟稱重后制成肝臟勻漿，經低速離心后取上清液用于測定.之后依次取出性腺、腸道、鰓、眼、腦并稱重，置于-20 ℃冰箱中冷凍保存?zhèn)溆?

1.4 分析方法PS MPs 與ZnO NPs 的形貌表征：分別取少量兩種固體粉末在透射電子顯微鏡（TEM，JEM-2100，JEOL Ltd.，日本）下采集圖像，使用Nano Measure 1.2 軟件統(tǒng)計兩種顆粒污染物粒徑.

水體粒徑及Zeta 電位的測量：準確稱量適量PS MPs 與ZnO NPs 粉末，加入100 mL 超純水中，超聲分散10 min 后，再稀釋至所需濃度（表1），并使用納米粒度及Zeta 電位分析儀（Zetasizer NaNo ZS，英國馬爾文公司，英國）測定兩種污染物水合粒徑及體系Zeta 電位［14］.

水中Zn2+釋放量的測定：取水樣加入硝酸酸化，在4 ℃條件下3500 r·min-1離心10 min，取上清液過0.22 μm 有機微孔濾膜，利用ICP-MS（Nex-ION 300X，Perkinelmer，USA）測定水體中溶解鋅的濃度［15］.

組織中Zn 富集量的檢測：組織對Zn 的富集量按照劉林［16］的方法進行測定.樣品經解凍、干燥、稱重后，加入5 mL 濃硝酸預消解12 h，控制溫度為90 ℃消解1 h，在120 ℃條件下繼續(xù)消解至溶液剩余1 mL.加入5 mL 濃硝酸和1 mL 高氯酸，消解至無白煙，再加入10 mL 硝酸（2%），轉移至25 mL 容量瓶中，用硝酸（2%）定容.混勻后過0.22 μm 有機微孔濾膜，取5 mL 消解液用ICPMS 測定Zn 含量（dw，mg·kg-1）.

肝臟組織氧化損傷指標的測定：蛋白的測定采用考馬斯亮藍法，以小牛血清蛋白為標準，加入考馬斯亮藍顯色劑混勻，反應2 min 后使用紫外-分光光度計在595 nm 處測定吸光度，計算蛋白含量.超氧化物酶活性（SOD）、丙二醛含量（MDA）及活性氧水平（ROS）分析試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，將制備的勻漿液按照試劑盒說明書操作步驟進行測定.

1.5 數據處理實驗結果用平均值±標準差（mean±SD）表示，使用SPSS 21.0 軟件進行數據統(tǒng)計分析，并采用單變量方差分析和協(xié)方差分析（One Way ANOVA）確定處理組間差異的統(tǒng)計學意義，以p＜0.05 來表示顯著性差異.

2 結果

2.1 TEM 表征圖1 為透射電鏡（Transmission Electron microscope，TEM）下PS MPs 與ZnO NPs 的形貌圖，可以看出，PS MPs 呈規(guī)則球狀，外表光滑，粒徑約為430 nm；ZnO NPs 多為不規(guī)則的塊狀和顆粒狀，粒徑分布為23.17±14.72 nm（n=400），顆粒大小差異較大，有明顯團聚.

圖1 PS MPs (A)與ZnO NPs (B)的TEM 圖像Fig.1 TEM images of PS MPs (A) and ZnO NPs (B)

2.2 水合粒徑顆粒態(tài)污染物在水體中通常表現出較強的團聚性，影響其生物可利用性.實驗中ZnO NPs 的水合粒徑為（425.8±32.08）nm，在水中發(fā)生明顯聚集，在與PS MPs 復合后，粒徑分別增大至（568.0±62.99）nm 和（581.8±24.42）nm（p＜0.05），PS MPs 的濃度對ZnO NPs 的水合粒徑無影響.PS MPs 在水中同樣也發(fā)生聚集，但濃度與復合對其粒徑無顯著影響.加入ZnO NPs 后，1 mg·L-1與10 mg·L-1的PS MPs 粒徑分別為（572.7±24.39）nm 與（594.8±13.28）nm，組間不存在顯著差異.如圖2 所示.

圖2 PS MPs 與ZnO NPs 水體粒徑Fig.2 Particle size of PS MPs and ZnO NPs in water

2.3 Zeta 電位Zeta 電位可反映膠體分散體系的穩(wěn)定性，影響顆粒物的聚集與離子釋放.一般認為Zeta 電位在-30～30 mV 時物質處于不穩(wěn)定的狀態(tài)，小于-30 mV 或者大于30 mV 時，體系具有良好的穩(wěn)定性和分散性［17］.單一ZnO NPs 的Zeta 電位約為-14 mV，而單一PS MPs 的Zeta 電位接近-30 mV（圖3），PS MPs 在水中介穩(wěn)性高于ZnO NPs.與ZnO NPs 相比，ZnO NPs 與PS MPs 復合后Zeta 電位絕對值顯著增大（p＜0.05），在水體中穩(wěn)定性增強.1 mg·L-1PS MPs 復合組的Zeta 電位絕對值低于10 mg·L-1PS MPs復合組，表明濃度會影響復合體系的穩(wěn)定性.

圖3 不同組別水體的Zeta 電位Fig.3 Zeta potential of different groups

2.4 水體中Zn2+的含量金屬離子的釋放是納米金屬顆粒造成水生生物毒性的主要原因［18］.實驗中未添加ZnO NPs 的三組水體中鋅含量極低，單一ZnO NPs 組、1 mg·L-1PS MPs 復合組以及10 mg·L-1PS MPs 復合組的Zn2+溶出率分別為64.6 %，62.9 %，58.5%（圖4），10 mg·L-1PS MPs 復合組水體中Zn2+含量顯著低于前兩組（p＜0.05），表明10 mg·L-1PS MPs 復合可減少ZnO NPs 中Zn2+的釋放，從而可能降低其帶來的毒性效應.

圖4 養(yǎng)殖水體中Zn2+的釋放量Fig.4 Release of Zn2+ in aquaculture water of different groups

2.5 Zn 在錦鯽各組織中的分布金屬氧化物顆粒及其溶解釋放出的金屬離子可通過多種途徑蓄積在靶器官中，并對生物產生毒性.Zn 在錦鯽各器官中含量排序為：腸＞眼＞鰓＞肉＞性腺＞腦（表2）.相較于ZnO NPs 單一脅迫，復合脅迫對腸道、魚肉、鰓和性腺中Zn 含量并無顯著作用；在眼部，PS MPs 的添加與濃度均可影響Zn 的富集，ZnO NPs 單一脅迫下Zn 含量為（426.1±95.4）mg·kg-1，10 mg·kg-1PS MPs 復合后Zn 含量顯著增大（（555.8±154.2）mg·kg-1），高濃度PS MPs（10 mg·kg-1）可促進眼中Zn 的富集；與眼部不同的是，在富集量最低的腦中，低濃度 PS MPs（1 mg·L-1）復合后可抑制腦中Zn 的轉運與富集（p＜0.05），而高濃度則無顯著影響.

表2 錦鯽各器官Zn 的富集量(單位：mg·kg-1)Tab.2 Zn accumulation in different organs of Carassius auratus (unit: mg·kg-1)

2.6 肝臟組織的氧化損傷指標污染物對生物的毒性通常包括氧化損傷作用，具體表現為相關生物標志物含量產生變化.由圖5 可知，相較空白組，各組SOD 活性和ROS 均未產生顯著差異；ZnO NPs 和PS MPs 單一脅迫都未影響肝臟細胞MDA 含量，但1 mg·L-1PS MPs 復合后MDA 含量顯著升高（p＜0.05），而10 mg·L-1PS MPs 復合并無顯著作用，說明兩種污染物復合暴露可造成錦鯽膜脂過氧化損傷，PS MPs 濃度的差異會影響該作用.

圖5 肝臟組織中的氧化應激：(a) SOD;(b) ROS;(c) MDAFig.5 Oxidative stress indicators in liver: (a) SOD,(b) ROS,(c) MDA

3 討論

ZnO NPs 粒徑為（30±10）nm，水溶液中粒徑可增大至439.8 nm，在水體中具有很強的團聚性，之前也有報道［19］.而當其與PS MPs 復合后，粒徑進一步增大，這可能與PS MPs 較強的吸附性有關.由于PS MPs 具有較強吸附顆粒態(tài)金屬污染物的特性［8］，它與ZnO NPs 復合后可在表面吸附更多的ZnO NPs，使得ZnO NPs 水合粒徑由于被吸附聚集而增大.Tong et al［20］在0.1 μm PS MPs 對ZnO NPs 在水中溶解釋放的影響研究中也出現類似的現象，PS MPs 與ZnO NPs 在光照條件下發(fā)生明顯團聚現象，表現為更容易發(fā)生聚集沉淀.Li et al［21］的研究也報道PS MPs 可作為納米銀的載體，吸附水體中的納米銀顆粒.

納米金屬氧化物的離子釋放被認為是致毒的重要原因［22］，而MPs 的作用可影響Zn2+的溶解與釋放.相較于ZnO NPs 單一脅迫和1 mg·L-1PS MPs 復合組，與10 mg·L-1PS MPs 復合后養(yǎng)殖水中Zn2+的含量顯著下降.研究報道MPs 可通過物理吸附等作用吸附金屬離子，從而降低它們在溶液中的豐度［23］.同時隨著與PS MPs 的復合與濃度增大，體系的穩(wěn)定性增強，可能減少ZnO NPs的溶解與釋放.

Zn 作為體內的微量元素，生物各組織Zn 富集量維持在一定水平.在本研究中ZnO NPs 和PS MPs 的單一與復合暴露并未造成腸道、鰓和魚肉中Zn 含量顯著增加，只有腦部例外.對于魚類來說，口腔攝入是顆粒態(tài)污染物進入體內重要方式之一［24］，腸道則是納米顆粒在水生動物體內富集的主要器官［25］.而PS MPs 的復合與濃度對腸道中Zn 的富集無明顯影響，這或許與ZnO NPs強烈的聚集性相關.ZnO NPs 在水中發(fā)生明顯聚集，而與微塑料復合后粒徑進一步增大，從而影響腸道的吸收和富集.

在腦部，相較于單一脅迫組，ZnO NPs 與1 mg·L-1PS MPs 復合后Zn 含量下降，而與10 mg·L-1PS MPs 復合則無差異，較低濃度的PS MPs可減少Zn 在腦中的富集.由于血腦屏障的存在，較大的顆粒態(tài)納米金屬氧化物無法進入腦中，離子態(tài)是金屬進入腦中的主要形式［26］.1 mg·L-1PS MPs 復合組體系Zeta 電位絕對值更小，ZnO NPs穩(wěn)定性差，Zn2+溶出率更高，從而提高腦中Zn 的含量.但也有研究發(fā)現濃度為0.76 mg·L-1的ZnO NPs 與PS MPs 復合后對腦中Zn 的富集并無顯著影響［27］，可能是由于顆粒物粒徑與濃度的差異使得復合后并未能改變水體Zn2+含量與腦對Zn 的吸收富集.

SOD 可通過清除生物體內超氧陰離子而保護機體免受氧化損傷［28］，是生物體內抗氧化系統(tǒng)重要酶系之一.實驗中錦鯽暴露于污染物兩周后，各組肝臟中SOD 含量十分接近，污染物的濃度和復合對肝臟SOD 活性無明顯影響.同樣在Meng et al［29］的研究中，0.8 mg·L-1ZnO NPs 脅迫下，PS MPs 的粒徑大小與污染物的復合對SOD活性也未產生顯著影響.本實驗ZnO NPs 濃度為1 mg·L-1，可能未達到產生顯著影響的閾值［30］.

MDA 是膜脂過氧化損傷的產物，機體遭受氧化脅迫時往往會大量累積.本研究中除了ZnO NPs 與1 mg·L-1PS MPs 復合后肝臟細胞氧化損傷加劇，其余各組均無顯著效應，表明較低濃度的PS MPs 與ZnO NPs 復合暴露可造成氧化損傷.另外與通常認知不同的是，低濃度復合組MDA含量增大，卻未觀察到生物體內的強氧化劑ROS含量發(fā)生明顯變化，推測這可能是錦鯽體內的抗氧化酶作用以消除ROS 產生的氧化損傷，使得產生的ROS 很快被生物體清除.

4 結論

ZnO NPs 在水體中與PS MPs 復合后，兩者的相互作用可增強ZnO NPs 團聚性，使團聚體粒徑增大，體系穩(wěn)定性提高，且高濃度（10 mg·L-1）PS MPs 復合可能通過吸附作用降低了水體中游離Zn2+的含量.在復合實驗中，PS MPs 的濃度對不同組織的Zn 富集表現出不同的效應，高濃度復合促進了Zn 在眼部的富集，而低濃度復合減少了腦部Zn 的富集，PS MPs 可通過影響ZnO NPs 在體系中的穩(wěn)定性及Zn2+溶出改變組織對Zn 的富集；兩者在低濃度下的復合增加了對肝臟的膜脂過氧化損傷，提高了生物毒性.