張 碩,周雨瀟,吳海波,索 倫

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院,上海 200011)

CIRSPR/Cas9基因編輯技術(shù)自誕生以來(lái),因其設(shè)計(jì)簡(jiǎn)便、操作簡(jiǎn)單等諸多優(yōu)點(diǎn),先后被應(yīng)用于畜牧業(yè)的各個(gè)領(lǐng)域,如改良家畜性狀、生產(chǎn)無(wú)過(guò)敏原的動(dòng)物源性產(chǎn)品、動(dòng)物福利優(yōu)化以及生產(chǎn)含外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等[1]。CRISPR/Cas9的有效性分別在細(xì)胞系[2-3]、小鼠[4]、豬[5-7]、牛[8-9]以及家禽[10]上均已獲得驗(yàn)證,為遺傳育種、宿主改造、構(gòu)建疾病模型和疾病治療等的研究提供有效的技術(shù)手段[11]。

CRISPR/Cas系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌[12-14],包括3種主要類型,目前廣泛應(yīng)用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)是在Ⅱ型系統(tǒng)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造而來(lái)[14]。CRISPR/Cas9主要作用過(guò)程為:在sgRNA(small guide RNA,sgRNA)的指導(dǎo)下,Cas9蛋白對(duì)與其結(jié)合的靶向序列進(jìn)行切割,導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂(double strand breaking,DSB),斷裂的DNA可以通過(guò)同源重組修復(fù)[15](homologous directed repair,HDR)或者非同源末端連接[16](non-homologous end joining,NHEJ)兩條途徑進(jìn)行修復(fù),從而實(shí)現(xiàn)基因改造的目的。

研究發(fā)現(xiàn),CRISPR/Cas9系統(tǒng)不僅可以在雞胚中穩(wěn)定表達(dá)編輯[17],還可以在豬、綿羊、牛等大型動(dòng)物上表達(dá)編輯[18]。截至目前,Shi等[19]使用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)BMP15外顯子1號(hào)區(qū)域進(jìn)行編輯,獲得了雜合子母豬,并展現(xiàn)出較高的繁殖性能,為定向育種提供了有效的實(shí)施方法;Whitworth等[20-21]使用該技術(shù)成功生產(chǎn)出抗PRRSV(porcine reproductive and respiratory syndrome virus)的基因編輯豬,大大提高了豬抗病能力,Ikeda等[22]運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)和體細(xì)胞核移植技術(shù)成功獲得IARS致病基因被糾正的胎牛,進(jìn)而降低了牛感染的機(jī)率,因此,CRISPR/Cas9技術(shù)在抗病育種方面展示出巨大的優(yōu)勢(shì)。此外,CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)為改善畜牧業(yè)相關(guān)產(chǎn)品的品質(zhì)提供了有效的技術(shù)手段,Wang等[23-24]成功將二花臉豬上的MSTN基因進(jìn)行突變,獲得雙肌表型,使得豬的肌肉更加豐滿,Oishi等[25]使用CRISPR/Cas系統(tǒng)敲除了蛋清中卵清蛋白和卵黏蛋白的基因,進(jìn)而去除雞蛋中的過(guò)敏原。

然而,目前CRISPR/Cas9的生殖系導(dǎo)入方式主要是采用胚胎顯微注射的方式進(jìn)行,對(duì)動(dòng)物的胚胎生物技術(shù)要求較高[26],而某些家畜生殖細(xì)胞體外操作技術(shù)并不成熟[27],這嚴(yán)重阻礙了該技術(shù)的應(yīng)用。業(yè)界提出通過(guò)病毒介導(dǎo)的方式進(jìn)行在體生殖系的長(zhǎng)效基因編輯,但長(zhǎng)效CRISPR系統(tǒng)作用下,基因編輯動(dòng)態(tài)結(jié)局為何,長(zhǎng)效編輯是否會(huì)增加脫靶風(fēng)險(xiǎn)目前尚未可知。

為此,本研究借助慢病毒整合系統(tǒng),先后將Cas9基因序列和靶基因序列整合到U-2 OS細(xì)胞基因組中進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組長(zhǎng)期穩(wěn)定編輯的目的,并選擇FANCF和VEGFA基因?yàn)檠芯繉?duì)象,分析在CRISPR/Cas9基因編輯工具長(zhǎng)期作用下靶點(diǎn)序列編輯效率和修復(fù)的動(dòng)態(tài)結(jié)局,比較靶點(diǎn)序列位置對(duì)CRISPR/Cas9編輯效率和修復(fù)結(jié)局的影響,追蹤C(jī)RISPR/Cas9長(zhǎng)效作用下FANCF靶點(diǎn)的脫靶效應(yīng),為CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物育種的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 本試驗(yàn)使用的感受態(tài)細(xì)胞為T(mén)rans-T1菌株,購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;U-2 OS細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù);Cas9誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒Tet on-Cas9-Neo-TLCV2、sgRNA質(zhì)粒U6-sgRNA-TLCV2-Puromycin與慢病毒包裝質(zhì)粒(PsPAX和PMD2.G)均由上海交通大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予。

1.1.2 試劑與試劑盒 本試驗(yàn)分子克隆所需的T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、DNA高保真聚合酶均購(gòu)自NEB公司;質(zhì)粒中量小提試劑盒購(gòu)自天根生化有限公司;DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素溶液、胎牛血清均購(gòu)自Invitrogen公司;LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Thermo Fisher Scientific;DNA抽提試劑盒(DNeasy Blood &Tissue Kits)購(gòu)自QIAGEN公司;TruePrep Index Kit V2 for Illumina購(gòu)自諾維贊生物科技有限公司;Sure PAGE預(yù)制膠購(gòu)自金斯瑞生物科技有限公司;抗體試劑購(gòu)自Cell Signaling Technology公司和Invitrogen公司。

1.1.3 主要儀器 PCR儀購(gòu)自Applied Biosystem;高速離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf,核酸蛋白定量?jī)x為Nanodrop 2000購(gòu)自Thermo Fisher Scientific。

1.1.4 生物合成及測(cè)序服務(wù) 試驗(yàn)所需的各類引物合成(sgRNA寡核苷酸引物、PCR相關(guān)引物等)及后續(xù)的一代測(cè)序、二代測(cè)序均由生工生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 靶點(diǎn)表達(dá)載體構(gòu)建 本試驗(yàn)所用2個(gè)靶區(qū)位點(diǎn)(FANCF和VEGFA)sgRNA克隆方法:1)使用引物(表1)以U6-sgRNA-TLCV2-Puromycin載體為模板進(jìn)行PCR:①使用引物Vector primer F&R擴(kuò)增TLCV2載體骨架;②使用引物scaffold-CMV primer F&R擴(kuò)增載體啟動(dòng)子區(qū)域;③使用引物FANCFsite primer F&R或VEGFAsite primer F&R將基因?qū)?yīng)的sgRNA片段連入載體啟動(dòng)子區(qū)域;2)使用NEBuilder?HiFi DNA Assembly Master Mix將載體骨架與sgRNA啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行連接,以構(gòu)建完整的靶點(diǎn)病毒表達(dá)載體;3)使用Trans1-T1感受態(tài)完成轉(zhuǎn)化過(guò)程并過(guò)夜培養(yǎng);4)挑取克隆進(jìn)行測(cè)序,并選擇測(cè)序結(jié)果正確的克隆進(jìn)行擴(kuò)增,去內(nèi)毒素質(zhì)粒中量小提后以用于后續(xù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。

表1 引物信息

1.2.2 慢病毒包裝 HEK293T細(xì)胞使用含10% FBS、100 μg·mL-1青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。使用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑分別將Tet on-Cas9-Neo-TLCV2質(zhì)粒、U6-FANCFsgRNA-TLCV2-Puromycin質(zhì)粒、U6-VEGFAsgRNA-TLCV2-Puromycin與病毒包裝質(zhì)粒PsPAX2、PMD2.G共轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293T細(xì)胞,在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清,使用0.45 μM濾器過(guò)濾后使用。

1.2.3 Tet on-Cas9慢病毒感染U-2 OS細(xì)胞 U-2 OS細(xì)胞使用含10% FBS、100 μg·mL-1青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。將U-2 OS細(xì)胞按照3×105個(gè)·孔-1的密度接種于6孔板中,在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后,按照病毒滴度為MOI=0.05感染U-2 OS細(xì)胞,慢病毒感染24 h后,將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為含1 mg·mL-1G418的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)3～5 d,得到誘導(dǎo)表達(dá)Cas9蛋白的U-2 OS細(xì)胞株。

1.2.4 靶點(diǎn)慢病毒感染Tet on-Cas9-U-2 OS細(xì)胞 將Cas9-U-2 OS細(xì)胞按照3×105個(gè)·孔-1的密度接種于6孔板中,在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后,按照病毒滴度為MOI=0.05感染Cas9-U-2 OS細(xì)胞,慢病毒感染24 h后,將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為含2 mg·mL-1Puromycin的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d,得到穩(wěn)定表達(dá)靶點(diǎn)sgRNA以及誘導(dǎo)表達(dá)Cas9蛋白的U-2 OS細(xì)胞株。

1.2.5 誘導(dǎo)Cas9蛋白表達(dá) 將U-2 OS-Cas9細(xì)胞和穩(wěn)定表達(dá)靶點(diǎn)sgRNA-Target以及Cas9蛋白的U-2 OS穩(wěn)轉(zhuǎn)株分別使用含10% FBS、5% 100 μg·mL-1青霉素-鏈霉素以及2 μg·mL-1Doxycycline的DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),持續(xù)誘導(dǎo)Cas9蛋白表達(dá),選擇不同編輯時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞,使用DNeasy Blood &Tissue Kits(QIAGEN)提取細(xì)胞基因組DNA用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.6 蛋白免疫印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) 取2 μg·mL-1Doxycycline誘導(dǎo)第3天的U-2 OS-Cas9細(xì)胞,加入100 μL含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液,刮刀將細(xì)胞從培養(yǎng)皿底刮下并轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中,置于冰上孵育30 min后4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min,吸取上清,加入5×Loading Buffer混合均勻,95 ℃金屬浴加熱10 min使蛋白充分變性。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯影等步驟得到蛋白印跡圖。

1.2.7 DNA測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建、二代高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析 針對(duì)靶點(diǎn)的DNA文庫(kù)構(gòu)建流程如下:1)①以外源性靶點(diǎn)為中心設(shè)計(jì)含有index序列的特異性引物OUT-NGS-F&R、FANCF-OUT-NGS-F&R、VEGFA-OUT-NGS-F&R(表1);②以內(nèi)源性靶點(diǎn)為中心設(shè)計(jì)含有index序列的特異性引物ONT-NGS-F&R、FANCF-ONT-NGS-F&R、VEGFA-

ONT-NGS-F&R(表1);③以FANCF靶點(diǎn)GUIDE-SEQ預(yù)測(cè)的7個(gè)脫靶位點(diǎn)為中心,分別設(shè)計(jì)含有不同index序列信息的特異性引物F1.1/1.2/1.3-NGS-F&1R、F2.1/2.2/2.3-NGS-F&2R、F3.1/3.2/3.3-NGS-F&3R、F4.1/4.2/4.3-NGS-F&4R、F5.1/5.2/5.3-NGS-F&5R、F6.1/6.2/6.3-NGS-F&6R、F7.1/7.2/7.3-NGS-F&7R(表1)。使用上述引物擴(kuò)增出長(zhǎng)約200 bp的DNA片段,用于第二輪擴(kuò)增的底物。PCR組分和用量:10 μL 2×Q5 Master Mix,0.5 μL primer F(10 μmol·L-1),0.5 μL primer R(10 μmol·L-1),1 μL基因組DNA模板,RNase-Free Water補(bǔ)齊至20 μL。PCR參數(shù):98 ℃預(yù)變性30 s;98 ℃變性10 s,67 ℃退火30 s,72 ℃延伸10 s,重復(fù)30個(gè)循環(huán);72 ℃徹底延伸5 min;4 ℃儲(chǔ)存;2)第二輪PCR建庫(kù)使用TruePrep Index Kit V2 for Illumina接頭引物,PCR組分和用量:10 μL 2×Q5 Master Mix,0.5 μL primer P7(10 μmol·L-1),0.5 μL primer N5(10 μmol·L-1),1 μL一輪PCR產(chǎn)物,RNase-Free Water補(bǔ)齊至20 μL。PCR參數(shù):98 ℃預(yù)變性30 s;98 ℃變性10 s,64 ℃退火30 s,72 ℃延伸10 s,重復(fù)20個(gè)循環(huán);72 ℃徹底延伸5 min;4 ℃儲(chǔ)存;3)PCR結(jié)束確認(rèn)條帶大小正確后,將所有樣品混勻后吸取200 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,經(jīng)膠回收純化測(cè)定濃度后,將純化產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究試驗(yàn)數(shù)據(jù)先采用Excel 2019進(jìn)行整理,然后使用GraphPad Prism 7.0軟件分析數(shù)據(jù)并作圖,所有數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)”表示。采用單因素方差分析對(duì)每個(gè)外源靶點(diǎn)在不同時(shí)間點(diǎn)的基因編輯效率差異進(jìn)行分析,采用雙因素方差分析各基因內(nèi)、外源靶點(diǎn)的編輯效率差異,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,*代表P<0.05,**代表P<0.01,***代表P<0.001,****代表P<0.000 1。

2 結(jié) 果

2.1 靶點(diǎn)的構(gòu)建及驗(yàn)證

本試驗(yàn)針對(duì)FANCF基因的第一個(gè)外顯子區(qū)域以及VEGFA基因的第二個(gè)外顯子區(qū)域,各自設(shè)計(jì)一個(gè)長(zhǎng)20 bp的靶區(qū),并合成含有N20以及N20-CGG的特異性序列(表1),將sgRNA(N20)和Target(N20-CGG)序列連入U(xiǎn)6-sgRNA-TCLV2-Puromycin的慢病毒表達(dá)載體中(圖1A)。測(cè)序結(jié)果顯示,該克隆分別含有完整的sgRNA序列和target序列(圖1 B和1C),且二者由669個(gè)堿基的linker連接,將上述測(cè)序正確的sgRNA和靶點(diǎn)克隆用于后續(xù)試驗(yàn)。

此外,為了保證細(xì)胞模型中同時(shí)表達(dá)sgRNA序列和Cas9蛋白,本研究構(gòu)建了誘導(dǎo)型Cas9蛋白表達(dá)載體,并與PsPAX2、PMD2.G慢病毒包裝載體共同轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中用于生產(chǎn)慢病毒感染U-2 OS細(xì)胞(圖1D),蛋白免疫印跡結(jié)果表明,在Doxycycline作用濃度為2 μg·mL-1時(shí),可成功誘導(dǎo)Cas9蛋白表達(dá)(圖1E)。

2.2 長(zhǎng)效CRISPR/Cas9系統(tǒng)不同作用時(shí)間對(duì)編輯效率的影響

本試驗(yàn)將上述成功構(gòu)建的含F(xiàn)ANCF、VEGFAsgRNA和其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的TLCV2慢病毒表達(dá)載體進(jìn)行慢病毒包裝并感染整合有Cas9的U-2 OS細(xì)胞,在Doxycycline誘導(dǎo)不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞樣品并抽提基因組DNA用于檢測(cè)基因編輯效率(圖2A)。

A.加入Doxycycline后使用二代測(cè)序檢測(cè)細(xì)胞中外源和內(nèi)源靶點(diǎn)區(qū)DNA的編輯情況;B.外源FANCF靶點(diǎn)在不同時(shí)間點(diǎn)的編輯效率單因素方差分析結(jié)果;C.外源VEGFA靶點(diǎn)在不同時(shí)間點(diǎn)的編輯效率單因素方差分析結(jié)果;D. 內(nèi)源FANCF靶點(diǎn)在不同時(shí)間點(diǎn)的編輯效率;E.內(nèi)源VEGFA靶點(diǎn)在不同時(shí)間點(diǎn)的編輯效率。*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001;****. P<0.000 1。下同A. Detection of DNA editing at exogenous and endogenous target regions in cells using next-generation sequencing following the addition of Doxycycline; B. Editing efficiency of FANCF exogenous targets at different editing times by one way ANOVA; C. Editing efficiency of VEGFA exogenous targets at different editing times by one way ANOVA; D. Editing efficiency of FANCF endogenous targets at different editing times; E. Editing efficiency of VEGFA endogenous targets at different editing times. *.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001;****. P<0.000 1. The same as below圖2 不同誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)對(duì)CRISPR/Cas9編輯效率的影響Fig.2 Effect of different Doxycycline treatment time points on CRISPR/Cas9 gene editing efficiency

使用特異性引物分別對(duì)外源靶點(diǎn)和內(nèi)源靶點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過(guò)二代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)CRISPR/Cas9編輯后的靶點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序,并統(tǒng)計(jì)各位點(diǎn)編輯效率的情況,經(jīng)過(guò)分析發(fā)現(xiàn),FANCF外源靶點(diǎn)在第4天編輯效率達(dá)到峰值(圖2B),VEGFA外源靶點(diǎn)在第3天編輯效率達(dá)到峰值(圖2C);對(duì)應(yīng)上述靶區(qū)的內(nèi)源靶點(diǎn)達(dá)到峰值的時(shí)間點(diǎn)與外源靶點(diǎn)基本一致(圖2D和2E)。上述結(jié)果表明,隨著Cas9蛋白誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間的增加,編輯效率逐漸升高,第4天以后編輯效率逐漸趨于穩(wěn)定,靶點(diǎn)位置對(duì)CRISPR/Cas9編輯效率的整體趨勢(shì)無(wú)明顯影響。

2.3 靶點(diǎn)位置對(duì)CRISPR/Cas9編輯效率的影響

為比較基因靶區(qū)位置對(duì)基因編輯效率的影響,本試驗(yàn)針對(duì)同一靶區(qū),分別比較了內(nèi)、外源靶點(diǎn)在第4～7天的編輯效率,結(jié)果顯示編輯效率在不同時(shí)間點(diǎn)趨于穩(wěn)定,但對(duì)于上述兩個(gè)編輯靶區(qū),其內(nèi)源靶點(diǎn)在各時(shí)間點(diǎn)的編輯效率均顯著高于外源靶點(diǎn)(圖3A和3B)。

2.4 不同編輯時(shí)間點(diǎn)對(duì)內(nèi)源基因堿基序列的影響

本試驗(yàn)使用特異PCR引物對(duì)內(nèi)源靶點(diǎn)的堿基序列進(jìn)行擴(kuò)增并選取數(shù)據(jù)量排名前20位的結(jié)果進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),內(nèi)源FANCF靶點(diǎn)在第4～7天堿基的刪除、插入、替換結(jié)局改變穩(wěn)定(圖4A-D),內(nèi)源VEGFA靶點(diǎn)在編輯的各時(shí)間點(diǎn)堿基的刪除、插入、替換結(jié)局改變也穩(wěn)定(圖4E-H)。上述結(jié)果說(shuō)明,加入Doxycycline誘導(dǎo)Cas9蛋白表達(dá)在第4～7天各編輯時(shí)間點(diǎn),內(nèi)源靶點(diǎn)堿基的改變結(jié)局呈穩(wěn)定狀態(tài)。

2.5 不同編輯時(shí)間點(diǎn)對(duì)外源基因堿基序列的影響

本試驗(yàn)采用上述相同的方法對(duì)外源靶點(diǎn)的修復(fù)結(jié)局進(jìn)一步分析,結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn),在加入Doxycycline第4～7天,外源FANCF靶點(diǎn)堿基的刪除、插入、替換結(jié)局改變穩(wěn)定(圖5A-D);在該編輯時(shí)間段,外源VEGFA靶點(diǎn)堿基的刪除、插入、替換結(jié)局改變也穩(wěn)定(圖5E-H)。上述結(jié)果說(shuō)明,在CRISPR/Cas9作用的第4～7天,外源靶點(diǎn)堿基序列的改變呈穩(wěn)定狀態(tài)。

2.6 靶點(diǎn)位置對(duì)編輯結(jié)局的影響

本試驗(yàn)對(duì)各基因內(nèi)、外源靶點(diǎn)誘導(dǎo)7 d后編輯結(jié)局進(jìn)一步比對(duì)發(fā)現(xiàn),FANCF內(nèi)源靶點(diǎn)編輯結(jié)局中插入占比為18%,刪除占比為69%,其它類型占比為13%(圖6A),FANCF外源靶點(diǎn)編輯結(jié)局中插入占比為18%,刪除占比為80%,其它類型占比為2%(圖6B);VEGFA內(nèi)源靶點(diǎn)編輯結(jié)局中插入占比為13%,刪除占比為85%,其它類型占比為2%(圖6C),VEGFA外源靶點(diǎn)編輯結(jié)局中插入占比為13%,刪除占比為86%,其它類型占比為1%(圖6D)。上述結(jié)果說(shuō)明,FANCF內(nèi)源靶點(diǎn)和外源靶點(diǎn)編輯結(jié)局比重趨勢(shì)一致,從大到小均依次為刪除、插入、其它類型,VEGFA內(nèi)源靶點(diǎn)和外源靶點(diǎn)各編輯結(jié)局占比也呈現(xiàn)相同的狀況,表明基因靶點(diǎn)所處位置并不影響基因編輯后各結(jié)局占比順序。

A.內(nèi)源FANCF靶點(diǎn)編輯結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖;B.外源FANCF靶點(diǎn)編輯結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖;C.內(nèi)源VEGFA靶點(diǎn)編輯結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖;D.外源VEGFA靶點(diǎn)編輯結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖A. Statistical chart of endogenous FANCF target editing results; B. Statistical chart of exogenous FANCF target editing results; C. Statistical chart of endogenous VEGFA target editing results; D. Statistical chart of exogenous VEGFA target editing results圖6 靶點(diǎn)編輯結(jié)局統(tǒng)計(jì)分析Fig.6 Statistical analysis of target editing outcomes

2.7 長(zhǎng)效CRISPR/Cas9編輯對(duì)脫靶的影響

本試驗(yàn)針對(duì)FANCF編輯位點(diǎn),采用GUIDE-SEQ預(yù)測(cè)出6個(gè)潛在脫靶位點(diǎn)[28](圖7),分別使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過(guò)二代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序分析,各脫靶位點(diǎn)具體的序列信息及測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)沒(méi)有脫靶現(xiàn)象的產(chǎn)生。

3 討 論

目前,CRISPR/Cas9編輯工具主要通過(guò)AAV(adneo-associated virus)、AdV(adneoviral vector)、LV(lentiviral vector)和VLP(virus-like particle)等病毒載體傳遞進(jìn)入體內(nèi)[29],進(jìn)而達(dá)到長(zhǎng)效基因編輯的目的[30-31]。研究發(fā)現(xiàn),借助慢病毒載體整合到豬基因組的DNA片段在其4歲時(shí)的表達(dá)水平與其幼時(shí)相當(dāng),在羊、雞等動(dòng)物體內(nèi)也觀察到相似的現(xiàn)象,在小鼠多代傳遞后整合片段尚未發(fā)現(xiàn)明顯的沉默現(xiàn)象[32]。目前,表達(dá)Cas9蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠模型已用于試驗(yàn)研究中,通過(guò)病毒整合的方式將sgRNA整合到宿主體內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)宿主任意細(xì)胞或器官的編輯[33],但長(zhǎng)效CRISPR/Cas9提高編輯效率的同時(shí)也出現(xiàn)了相應(yīng)的挑戰(zhàn),如基因編輯動(dòng)物中CRISPR/Cas9的脫靶問(wèn)題[34],且CRISPR/Cas9持續(xù)表達(dá)下基因編輯的動(dòng)態(tài)也尚未可知。因此,為追蹤長(zhǎng)效CRISPR/Cas9作用下基因編輯的動(dòng)態(tài)過(guò)程,本研究針對(duì)基因FANCF和VEGFA各自設(shè)計(jì)一個(gè)Target靶區(qū),并將sgRNA序列和Target靶區(qū)序列構(gòu)建到TLCV2質(zhì)粒載體中,Cas9基因序列和靶點(diǎn)序列分別借助病毒載體隨機(jī)整合到細(xì)胞基因組中。研究發(fā)現(xiàn),在加入Doxycycline誘導(dǎo)Cas9蛋白表達(dá)后,對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的編輯效率和結(jié)局進(jìn)行追蹤分析,研究結(jié)果表明,CRISPR/Cas9持續(xù)作用的第4天之后編輯效率和結(jié)局呈現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài),這為追蹤長(zhǎng)效CRISPR/Cas9基因組的編輯情況提供了有力的數(shù)據(jù)參考。

本研究通過(guò)對(duì)編輯第7天的內(nèi)源靶點(diǎn)和外源靶點(diǎn)的編輯效率進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn),內(nèi)源靶點(diǎn)的編輯效率顯著高于外源靶點(diǎn)。推測(cè),外源靶點(diǎn)編輯效率顯著性降低一方面可能與外源靶點(diǎn)整合進(jìn)入基因組中的位置有關(guān),以往研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)慢病毒可以將目的序列隨機(jī)整合到基因組中多個(gè)位點(diǎn)[35-39],在Cas9豐度相同的情況下,外源位點(diǎn)拷貝數(shù)遠(yuǎn)大于內(nèi)源位點(diǎn),導(dǎo)致未被編輯位點(diǎn)的占比提高,進(jìn)而降低CRISPR/Cas9對(duì)外源位點(diǎn)的編輯效率[40]。在CRISPR/Cas9基因編輯的過(guò)程中,隨著外源靶點(diǎn)整合到基因組中位置的不同,將顯著影響DNA三維結(jié)構(gòu),進(jìn)而影響了外源靶點(diǎn)的編輯效率,導(dǎo)致外源靶點(diǎn)的編輯效率低于內(nèi)源靶點(diǎn)。另一方面可能與靶點(diǎn)兩翼的特異性序列有關(guān),研究表明Cas9蛋白活性受非靶點(diǎn)序列以外其它序列信息的影響[41],本研究中由于慢病毒載體中靶點(diǎn)序列的兩翼序列與基因組中不同,從而導(dǎo)致了CRISPR/Cas9在外源靶點(diǎn)和內(nèi)源靶點(diǎn)編輯效率的不同。然而,內(nèi)源靶點(diǎn)與外源靶點(diǎn)編輯效率的不同并不影響對(duì)CRISPR/Cas9修復(fù)結(jié)局動(dòng)態(tài)過(guò)程的追蹤。通過(guò)控制Doxycycline誘導(dǎo)時(shí)間,進(jìn)而人為控制Cas9蛋白表達(dá)并編輯基因組過(guò)程,在不同作用時(shí)間節(jié)點(diǎn)觀察基因編輯的動(dòng)態(tài)。

本研究發(fā)現(xiàn),無(wú)論是FANCF位點(diǎn)還是VEGFA位點(diǎn),通過(guò)NHEJ途徑修復(fù)后,內(nèi)源靶點(diǎn)和外源靶點(diǎn)刪除、插入及其它類型編輯結(jié)局占比順序一致,這一結(jié)論在Shen等[42]的研究中發(fā)現(xiàn)相同現(xiàn)象:采用相同的策略將sgRNA和target序列構(gòu)建入一個(gè)載體中,對(duì)經(jīng)NHEJ途徑修復(fù)后內(nèi)外源靶點(diǎn)的編輯結(jié)局中堿基刪除與插入占比分析發(fā)現(xiàn)其順序一致。

目前,本研究只在細(xì)胞層面研究了CRISPR/Cas9編輯及修復(fù)的動(dòng)態(tài)過(guò)程,動(dòng)物活體中CRISPR/Cas9編輯的具體情況尚不清晰。在未來(lái),需要生產(chǎn)含有CRISPR系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,來(lái)進(jìn)一步研究動(dòng)物活體中基因編輯及修復(fù)的動(dòng)態(tài)過(guò)程,進(jìn)而為長(zhǎng)效CRISPR/Cas9技術(shù)在定向育種、改良家畜性狀方面的進(jìn)一步應(yīng)用提供更為詳實(shí)的研究數(shù)據(jù)。

4 結(jié) 論

在長(zhǎng)效CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用下,靶點(diǎn)的編輯效率在第3或第4天達(dá)到峰值,且內(nèi)外源各編輯結(jié)局類型占比趨勢(shì)一致。此外,對(duì)于FANCF位點(diǎn)而言,CRISPR作用時(shí)間增加不會(huì)增加脫靶風(fēng)險(xiǎn)。該研究結(jié)果為動(dòng)物體內(nèi)追蹤C(jī)RISPR/Cas9長(zhǎng)效作用后的編輯效率和結(jié)局提供了初步的科學(xué)參考。