袁雷，胡亞東

（1.西藏農(nóng)牧學(xué)院，西藏特色農(nóng)牧資源省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，西藏自治區(qū) 林芝 860000；2.中國科學(xué)院成都生物研究所，四川 成都 610041）

腫瘤防治是一個全球性難題，2013年《Science》雜志將腫瘤的免疫治療評為當(dāng)年十大科技進(jìn)展之首，2018年抑制免疫負(fù)向調(diào)控用于腫瘤治療的研究被授予諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎，從而使腫瘤免疫治療成為時代主流。與傳統(tǒng)的直接靶向腫瘤細(xì)胞的治療方法不同，通過激活宿主的免疫系統(tǒng)從而達(dá)到消除腫瘤是腫瘤免疫療法的主要作用機(jī)制［1］。

重塑腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）是癌癥免疫治療的有效策略［2-3］。TAM 是腫瘤微環(huán)境（TME）的重要組成部分之一，占腫瘤體積的50%，可分為兩種亞型，即典型激活的巨噬細(xì)胞（M1）和交替激活的巨噬細(xì)胞（M2）。簡單地說，M1 亞型具有強(qiáng)大的抗原呈遞能力，可以促進(jìn)Th1 免疫以殺死腫瘤細(xì)胞。然而，TME 中的大多數(shù)TAM 傾向于分化為M2 表型。M2 巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)組織修復(fù)和血管生成的Th2 型免疫，從而促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移［3-4］。因此，將TAM 極化為M1 亞型的免疫調(diào)節(jié)劑是近年來研究的熱點。

多糖的免疫調(diào)節(jié)作用是其最重要的生物活性之一，靈芝多糖［5］、紅花多糖［6］、紫錐菊多糖［7］、蛹蟲草多糖［8］等均可通過調(diào)控巨噬細(xì)胞極化抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。血滿草（Sambucus adnata）為我國民間常用藥，也是藏藥的藥源植物之一，其味辛、澀、性溫，具有祛風(fēng)、利水、活血、通絡(luò)的功效，主治急慢性腎炎、風(fēng)濕疼痛等癥［9］。前期研究中，本課題組詳細(xì)解析了血滿草多糖（Sambucus adnatepolysaccharide，SPS-1）的結(jié)構(gòu)特征，并發(fā)現(xiàn)SPS-1 與TLR2 受體結(jié)合并通過MAPKs 和NF-κB 信號通路激活RAW 264.7 細(xì)胞的免疫活性［10］。本研究在前期研究基礎(chǔ)上通過探討SPS-1 對巨噬細(xì)胞極化的影響及在共培養(yǎng)條件下對Lewis 細(xì)胞的抑制作用研究，以期為深入開展血滿草多糖SPS-1的抗腫瘤作用及實際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 細(xì)胞株

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 和小鼠肺癌細(xì)胞Lewis由武漢普諾賽生命科技有限公司提供。

1.1.2 實驗藥物

血滿草多糖SPS-1 為本課題組自制，糖含量94.76%。

1.1.3 主要試劑

DMEM 高糖細(xì)胞培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素雙抗和胎牛血清（美國Gibco公司）；白細(xì)胞介素-4（IL-4，美國PeproTech 公司）；Trizol（美國Ambion 公司）；小鼠單抗β-肌動蛋白（β-actin）、辣根過氧化物酶/HRP標(biāo)記羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司）；兔多抗巨噬細(xì)胞甘露糖受體（CD206）、E-鈣黏蛋白（ECadherin）、N-鈣黏蛋白（N-Cadherin）和波形纖維蛋白（Vimentin）（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；兔多抗磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDHF，杭州賢至生物有限公司）；兔單抗B 淋巴細(xì)胞瘤-2 蛋白（Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）（美國Abcam 公司）；A 型血管表皮生長因子（VEGF-A）、缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1α）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；兔多抗白細(xì)胞分化抗原（CD86）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；引物合成（北京擎科生物科技有限公司）；其他試劑均為分析純或色譜純。

1.1.4 主要儀器

電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，型號：CPA225D）；酶標(biāo)儀（美國Thermo 公司，型號：mμlISKANMK3）；熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司，型號：QuantStudio 6）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（日本SANYO 公司，型號：MCO-15AC）；流式細(xì)胞儀（美國Beckman coulter 公司，型號：cytoFLEX）；離心機(jī)（美國Eppendorf公司，型號：5702R）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將液氮保存的RAW264.7 細(xì)胞和Lewis 細(xì)胞于37 ℃水浴中溶解凍存液；并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有5 mL培養(yǎng)基的離心管中，常溫條件下1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞；用高糖DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）懸浮細(xì)胞，接種至培養(yǎng)皿，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。后續(xù)實驗選擇對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.3 巨噬細(xì)胞極化分析

將RAW264.7細(xì)胞接種于6孔板中，加入20 ng/mL的IL-4 培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞并用PBS 清洗2 次，得到M2 型巨噬細(xì)胞。隨機(jī)分為M0 組（對照組）、M2 組（M2極化組）、M21 組（M2 極化組 + 200 μg/mL SPS-1）、M22 組（M2 極化組+ 400 μg/mL SPS-1）和M23 組（M2 極化組 + 800 μg/mL SPS-1），給予相應(yīng)藥物處理24 h。

1.3.1 表面標(biāo)志物的檢測

采用Western blot 技術(shù)分析不同極化狀態(tài)RAW264.7 細(xì)胞的表面標(biāo)志物（CD206 和CD86）。各組培養(yǎng)24 h后用胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，RIPA 裂解液將細(xì)胞裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，取上清測定蛋白質(zhì)濃度。樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉1 h 后，一抗孵育過夜，TBST 洗滌5 次，孵育二抗，用ECL 試劑盒進(jìn)行顯影，成像系統(tǒng)顯像并采用BandScan 軟件分析條帶灰度值，重復(fù)3 次。一抗包括抗CD206（1∶500）、抗CD86（1∶1 000）和抗β-actin（1∶500），二抗包括山羊抗兔/小鼠IgG-HRP。以目的蛋白條帶與內(nèi)參β-actin 蛋白條帶的灰度值之比表示目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.3.2 TNF-α、iNOS、IL-10、TGF-β 和Arg-1 基因表達(dá)水平

各組培養(yǎng)24 h后去除培養(yǎng)基，按照Trizol法提取總RNA，檢測純度后，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行RT-qPCR 反應(yīng)。根據(jù)GenBank 中基因序列設(shè)計PCR 引物，檢測TNF-α、iNOS、IL-10、TGF-β 和Arg-1 基因的表達(dá)水平，以β-actin 為內(nèi)參。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s；60 ℃退火60 s，共40 個循環(huán)。每組設(shè)置3 個復(fù)孔，以2-△△Ct值表示目的基因的相對表達(dá)水平。RT-qPCR引物信息見表1。

表1 RT-qPCR各目的基因引物序列

1.4 對細(xì)胞遷移、侵襲及凋亡的影響

1.4.1 細(xì)胞遷移和侵襲試驗

將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞以3×105個/孔移植于無血清DMEM的6孔板中，根據(jù)分組加入不同試劑（終濃度800 μg/mL 的SPS-1 或/和終濃度20 ng/mL的IL-4），培養(yǎng)24 h 后收集上清，得到條件培養(yǎng)基（Conditioned medium，CM），備用。

實驗分組：Control 組（Lewis 細(xì)胞）、CM0 組（SPS-1 + Lewis 細(xì)胞）、CM1 組（RAW264.7 + IL-4 的條件培養(yǎng)基 + Lewis細(xì)胞）、CM2組（RAW264.7 + SPS-1的條件培養(yǎng)基 + Lewis細(xì)胞）和CM3組（RAW264.7 + IL-4 +SPS-1 的條件培養(yǎng)基 + Lewis 細(xì)胞），處理24 h 后收集細(xì)胞開展遷移和侵襲試驗。體外細(xì)胞的侵襲和遷移實驗用24孔板Transwell小室進(jìn)行檢測。侵襲實驗，在小室的上層鋪100 μg 的基質(zhì)膠。遷移實驗不鋪基質(zhì)膠。并于Transwell 小室上室加入3×105個/mL 的Lewis 細(xì)胞200 μL，培養(yǎng)24 h 后吸棄培養(yǎng)液，小心擦掉小室上層沒有發(fā)生侵襲或遷移的細(xì)胞，PBS 沖洗2 次后，10%甲醇固定30 min，5%結(jié)晶紫染色20 min 后進(jìn)行拍照計數(shù)。

1.4.2 HIF-1α和VEGF-A的測定

將Lewis細(xì)胞按106個/mL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入不同培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，收集上清液，采用ELISA法檢測HIF-1α和VEGF-A含量。

1.4.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞凋亡

實驗分組同“1.4.1”，培養(yǎng)24 h 后收集6 孔板中Lewis 細(xì)胞，使用AnnexinV-APC/7-AAD 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測Lewis細(xì)胞凋亡。

1.4.4 免疫印跡試驗

采用Western blot 技術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和凋亡相關(guān)蛋白E-Cadherin（1∶5 000）、N-Cadherin（1∶2 000）、Vimentin（1∶2 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶2 000）的表達(dá)水平，方法同“1.3.1”項，以目的蛋白條帶與內(nèi)參GAPDH（1∶1 000）蛋白條帶的灰度值之比表示目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗重復(fù)3 次，實驗結(jié)果采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。實驗數(shù)據(jù)采用IBM SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，不同組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（One-way ANOVA），并使用Origin 8.1 軟件進(jìn)行繪圖。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SPS-1 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞由M2 表型向M1 表型極化

20 ng/mL IL-4 處理RAW264.7 細(xì)胞可增加膜表面分子CD206 和減少CD86 的表達(dá)，這表明形成了極化的M2 型巨噬細(xì)胞。在SPS-1 處理后，CD86/CD206 以劑量依賴性方式顯著增加，SPS-1 濃度為400、800 μg/mL 時，CD86/CD206 比值較M2 組具有極顯著差異（P＜0.01）。結(jié)果見圖1。與M1 表型相關(guān)的炎癥因子TNF-α mRNA 的表達(dá)量升高，特異性M1 指標(biāo)iNOS mRNA 的表達(dá)量也顯著上調(diào)；與之相反，IL-10、TGF-β mRNA 及特異性M2 指標(biāo)Arg-1 mRNA 的表達(dá)量則顯著下調(diào)，與M2 組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），見表2。綜上，SPS-1 可誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞由M2 表型向M1 表型極化。

圖1 SPS-1對RAW264.7細(xì)胞膜表面CD206和CD86蛋白表達(dá)的影響

表2 各組對RAW264.7巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量的比較（±s）

表2 各組對RAW264.7巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量的比較（±s）

注：與M0組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與M2組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別M0組M2組M21組M22組M23組Arg-1 0.94±0.08 3.29±0.21**2.64±0.16**2.07±0.14**△△1.58±0.18△△TNF-α 1.03±0.12 0.39±0.06*0.84±0.06△△1.16±0.16△1.84±0.14*△△iNOS 1.02±0.15 0.49±0.04 0.89±0.08△1.30±0.13△1.91±0.04*△△IL-10 1.05±0.13 1.43±0.12 1.24±0.05 1.01±0.06 0.81±0.04△TGF-β 1.01±0.11 2.52±0.17**2.05±0.11**1.65±0.11*△1.38±0.13△△

2.2 SPS-1 調(diào)控M1/M2 巨噬細(xì)胞極化抑制Lewis 細(xì)胞的遷移與凋亡

SPS-1 調(diào)控M1/M2 巨噬細(xì)胞極化抑制Lewis 細(xì)胞的遷移與凋亡的實驗結(jié)果見表3 和圖2。共培養(yǎng)條件下，與對照組相比，CM0、CM2、CM3 組均可不同程度地降低Lewis細(xì)胞的遷移能力，與CM1組相比，CM0、CM2組均可極顯著降低Lewis 細(xì)胞的遷移（P＜0.01），CM3組也可顯著或極顯著的降低Lewis 細(xì)胞的遷移能力（P＜0.05，P＜0.01）。ELISA 和Western blot 實驗結(jié)果顯示，CM0、CM2、CM3 組均可顯著或極顯著的降低HIF-1α和VEGF的分泌及N-Cadherin和Vimentin的表達(dá)，而E-Cadherin 表達(dá)則極顯著增加（P＜0.01）。以上結(jié)果表明SPS-1 可通過誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞極化為M1 亞型抑制Lewis 細(xì)胞的遷移能力。流式細(xì)胞儀檢測Lewis 細(xì)胞凋亡，與對照組和CM1 組相比，CM0、CM2、CM3 組共培養(yǎng)體系中，Lewis 細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.01）。進(jìn)一步通過Western blot實驗檢測Lewis 細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 和Bax 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示經(jīng)SPS-1 處理，可顯著降低Lewis 細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)及提高促凋亡蛋白Bax 的表達(dá)，以上結(jié)果表明，SPS-1 可誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞極化促進(jìn)Lewis細(xì)胞的凋亡。

圖2 共培養(yǎng)條件下SPS-1對Lewis細(xì)胞轉(zhuǎn)移及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表3 各組對Lewis細(xì)胞的抑制作用比較（±s）

表3 各組對Lewis細(xì)胞的抑制作用比較（±s）

注：與Control組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與CM1組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別Control組CM0組CM1組CM2組CM3組凋亡指數(shù)4.13±0.12△△24.10±0.67**△△3.19±0.10**39.36±1.07**△△19.38±1.17**△△遷移率/%100.00±3.03 62.12±4.01**△△128.28±7.63 40.40±1.75**△△85.35±3.15*△侵襲率/%100.00±2.29△△55.00±2.29**△△121.50±3.97*35.00±1.73**△△90.00±2.60*△△HIF-1α/（pg/mL）575.20±43.75△△287.03±18.96*△△868.79±35.87**186.19±11.58*△△477.54±34.59△△VEGF/（pg/mL）229.96±25.66△△112.78±11.94*△333.59±30.52 62.58±6.79*△188.57±20.51△

3 討論

非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是肺癌的主要類型，約占肺癌的85%～90%［11］。目前免疫治療、靶向治療等新的治療方法已引入到NSCLC 治療中［12］。作為腫瘤組織中主要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在腫瘤的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［13］。但是，巨噬細(xì)胞存在著高度異質(zhì)，會在局部微環(huán)境刺激下從M0 階段極化到不同的亞型即M1和M2型，顯示完全相反的功能。

在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的極化普遍存在，M1 型和M2 型巨噬細(xì)胞在表型、標(biāo)記物、精氨酸代謝和對腫瘤的影響方面存在差異。M1 型巨噬細(xì)胞是典型激活的促炎性細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）的統(tǒng)稱，其細(xì)胞膜分子CD40、CD80 和CD86等表達(dá)增加［14］。M2 型巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出更高的甘露糖受體（CD206）轉(zhuǎn)錄表達(dá)，并通過分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10、TGF-β 等下調(diào)免疫應(yīng)答，減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生［15］。它們也可以根據(jù)精氨酸代謝相互區(qū)分，其中M1 型巨噬細(xì)胞優(yōu)先通過誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）將精氨酸代謝為NO，而M2 樣巨噬細(xì)胞優(yōu)先通過精氨酸酶-1（Arg-1）將精氨酸代謝為鳥氨酸［16］。本研究發(fā)現(xiàn)血滿草多糖（SPS-1）能促進(jìn)M1 型巨噬細(xì)胞極化，上調(diào)其特征標(biāo)記CD86、下調(diào)清道夫受體CD206 表達(dá)。SPS-1 處理的RAW264.7 細(xì)胞具有濃度依賴的TNF-α、iNOS mRNA 水平升高及IL-10、TGF-β、Arg-1 mRNA 水平降低，可顯著誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞由M2型向M1型極化。

抑制腫瘤的侵襲和遷移能力是藥物發(fā)揮抗癌作用的一個重要因素。血管的生成在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的作用［17］，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的快速生長，從而進(jìn)一步加速實體腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移［18］。HIF-1α 通過活化上調(diào)P13K/Akt 信號通路在轉(zhuǎn)錄水平介導(dǎo)VEGF 蛋白表達(dá)。VEGF 是一種血管生成因子，參與許多生理和病理過程，其意義與促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移有關(guān)［19］。缺氧也會引發(fā)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），EMT 是原發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)展的重要生物學(xué)機(jī)制，它的主要變現(xiàn)是極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換為活動能力強(qiáng)的間質(zhì)細(xì)胞并獲得侵襲和遷移能力［20］。上皮標(biāo)志物如ECadherin 等表達(dá)下調(diào)、間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin 和N-Cadherin 表達(dá)的增加是EMT 表型改變的主要特征，這導(dǎo)致EMT過程的發(fā)生，導(dǎo)致轉(zhuǎn)移的起始［21-23］。本研究的Transwell 實驗結(jié)果表明，共培養(yǎng)條件下，SPS-1 通過調(diào)控RAW264.7 細(xì)胞極化顯著抑制Lewis 細(xì)胞的侵襲和遷移，并降低HIF-1α和VEGF的分泌及NCadherin 和Vimentin 的表達(dá)，同時顯著上調(diào)ECadherin 的表達(dá)，從而起到抑制Lewis 細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。凋亡實驗結(jié)果顯示，SPS-1 亦可通過調(diào)控RAW264.7細(xì)胞極化顯著促進(jìn)Lewis細(xì)胞的凋亡。

4 結(jié)論

SPS-1 可促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1 型極化并通過調(diào)控巨噬細(xì)胞極化抑制Lewis細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及促進(jìn)其凋亡。