亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        血滿草多糖介導巨噬細胞M1型極化抑制肺癌的作用機制研究

        2023-10-29 06:50:54袁雷胡亞東
        中醫(yī)藥信息 2023年10期
        關(guān)鍵詞:表型極化多糖

        袁雷,胡亞東

        (1.西藏農(nóng)牧學院,西藏特色農(nóng)牧資源省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,西藏自治區(qū) 林芝 860000;2.中國科學院成都生物研究所,四川 成都 610041)

        腫瘤防治是一個全球性難題,2013年《Science》雜志將腫瘤的免疫治療評為當年十大科技進展之首,2018年抑制免疫負向調(diào)控用于腫瘤治療的研究被授予諾貝爾生理學與醫(yī)學獎,從而使腫瘤免疫治療成為時代主流。與傳統(tǒng)的直接靶向腫瘤細胞的治療方法不同,通過激活宿主的免疫系統(tǒng)從而達到消除腫瘤是腫瘤免疫療法的主要作用機制[1]。

        重塑腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAM)是癌癥免疫治療的有效策略[2-3]。TAM 是腫瘤微環(huán)境(TME)的重要組成部分之一,占腫瘤體積的50%,可分為兩種亞型,即典型激活的巨噬細胞(M1)和交替激活的巨噬細胞(M2)。簡單地說,M1 亞型具有強大的抗原呈遞能力,可以促進Th1 免疫以殺死腫瘤細胞。然而,TME 中的大多數(shù)TAM 傾向于分化為M2 表型。M2 巨噬細胞可誘導組織修復和血管生成的Th2 型免疫,從而促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[3-4]。因此,將TAM 極化為M1 亞型的免疫調(diào)節(jié)劑是近年來研究的熱點。

        多糖的免疫調(diào)節(jié)作用是其最重要的生物活性之一,靈芝多糖[5]、紅花多糖[6]、紫錐菊多糖[7]、蛹蟲草多糖[8]等均可通過調(diào)控巨噬細胞極化抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。血滿草(Sambucus adnata)為我國民間常用藥,也是藏藥的藥源植物之一,其味辛、澀、性溫,具有祛風、利水、活血、通絡(luò)的功效,主治急慢性腎炎、風濕疼痛等癥[9]。前期研究中,本課題組詳細解析了血滿草多糖(Sambucus adnatepolysaccharide,SPS-1)的結(jié)構(gòu)特征,并發(fā)現(xiàn)SPS-1 與TLR2 受體結(jié)合并通過MAPKs 和NF-κB 信號通路激活RAW 264.7 細胞的免疫活性[10]。本研究在前期研究基礎(chǔ)上通過探討SPS-1 對巨噬細胞極化的影響及在共培養(yǎng)條件下對Lewis 細胞的抑制作用研究,以期為深入開展血滿草多糖SPS-1的抗腫瘤作用及實際應用奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        1.1.1 細胞株

        小鼠單核巨噬細胞RAW264.7 和小鼠肺癌細胞Lewis由武漢普諾賽生命科技有限公司提供。

        1.1.2 實驗藥物

        血滿草多糖SPS-1 為本課題組自制,糖含量94.76%。

        1.1.3 主要試劑

        DMEM 高糖細胞培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素雙抗和胎牛血清(美國Gibco公司);白細胞介素-4(IL-4,美國PeproTech 公司);Trizol(美國Ambion 公司);小鼠單抗β-肌動蛋白(β-actin)、辣根過氧化物酶/HRP標記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司);兔多抗巨噬細胞甘露糖受體(CD206)、E-鈣黏蛋白(ECadherin)、N-鈣黏蛋白(N-Cadherin)和波形纖維蛋白(Vimentin)(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司);兔多抗磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDHF,杭州賢至生物有限公司);兔單抗B 淋巴細胞瘤-2 蛋白(Bcl-2)、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白(Bax)(美國Abcam 公司);A 型血管表皮生長因子(VEGF-A)、缺氧誘導因子-1(HIF-1α)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司);兔多抗白細胞分化抗原(CD86)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green(南京諾唯贊生物科技股份有限公司);引物合成(北京擎科生物科技有限公司);其他試劑均為分析純或色譜純。

        1.1.4 主要儀器

        電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司,型號:CPA225D);酶標儀(美國Thermo 公司,型號:mμlISKANMK3);熒光定量PCR 儀(美國ABI 公司,型號:QuantStudio 6);CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO 公司,型號:MCO-15AC);流式細胞儀(美國Beckman coulter 公司,型號:cytoFLEX);離心機(美國Eppendorf公司,型號:5702R)。

        1.2 細胞培養(yǎng)

        將液氮保存的RAW264.7 細胞和Lewis 細胞于37 ℃水浴中溶解凍存液;并將細胞轉(zhuǎn)移至含有5 mL培養(yǎng)基的離心管中,常溫條件下1 000 r/min離心5 min收集細胞;用高糖DMEM 培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)懸浮細胞,接種至培養(yǎng)皿,37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。后續(xù)實驗選擇對數(shù)生長期細胞。

        1.3 巨噬細胞極化分析

        將RAW264.7細胞接種于6孔板中,加入20 ng/mL的IL-4 培養(yǎng)24 h,收集細胞并用PBS 清洗2 次,得到M2 型巨噬細胞。隨機分為M0 組(對照組)、M2 組(M2極化組)、M21 組(M2 極化組 + 200 μg/mL SPS-1)、M22 組(M2 極化組+ 400 μg/mL SPS-1)和M23 組(M2 極化組 + 800 μg/mL SPS-1),給予相應藥物處理24 h。

        1.3.1 表面標志物的檢測

        采用Western blot 技術(shù)分析不同極化狀態(tài)RAW264.7 細胞的表面標志物(CD206 和CD86)。各組培養(yǎng)24 h后用胰蛋白酶消化并收集細胞,RIPA 裂解液將細胞裂解30 min,4 ℃、12 000 r/min 離心10 min,取上清測定蛋白質(zhì)濃度。樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉1 h 后,一抗孵育過夜,TBST 洗滌5 次,孵育二抗,用ECL 試劑盒進行顯影,成像系統(tǒng)顯像并采用BandScan 軟件分析條帶灰度值,重復3 次。一抗包括抗CD206(1∶500)、抗CD86(1∶1 000)和抗β-actin(1∶500),二抗包括山羊抗兔/小鼠IgG-HRP。以目的蛋白條帶與內(nèi)參β-actin 蛋白條帶的灰度值之比表示目的蛋白的相對表達水平。

        1.3.2 TNF-α、iNOS、IL-10、TGF-β 和Arg-1 基因表達水平

        各組培養(yǎng)24 h后去除培養(yǎng)基,按照Trizol法提取總RNA,檢測純度后,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,進行RT-qPCR 反應。根據(jù)GenBank 中基因序列設(shè)計PCR 引物,檢測TNF-α、iNOS、IL-10、TGF-β 和Arg-1 基因的表達水平,以β-actin 為內(nèi)參。PCR擴增條件:95 ℃預變性10 min;95 ℃變性15 s;60 ℃退火60 s,共40 個循環(huán)。每組設(shè)置3 個復孔,以2-△△Ct值表示目的基因的相對表達水平。RT-qPCR引物信息見表1。

        表1 RT-qPCR各目的基因引物序列

        1.4 對細胞遷移、侵襲及凋亡的影響

        1.4.1 細胞遷移和侵襲試驗

        將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞以3×105個/孔移植于無血清DMEM的6孔板中,根據(jù)分組加入不同試劑(終濃度800 μg/mL 的SPS-1 或/和終濃度20 ng/mL的IL-4),培養(yǎng)24 h 后收集上清,得到條件培養(yǎng)基(Conditioned medium,CM),備用。

        實驗分組:Control 組(Lewis 細胞)、CM0 組(SPS-1 + Lewis 細胞)、CM1 組(RAW264.7 + IL-4 的條件培養(yǎng)基 + Lewis細胞)、CM2組(RAW264.7 + SPS-1的條件培養(yǎng)基 + Lewis細胞)和CM3組(RAW264.7 + IL-4 +SPS-1 的條件培養(yǎng)基 + Lewis 細胞),處理24 h 后收集細胞開展遷移和侵襲試驗。體外細胞的侵襲和遷移實驗用24孔板Transwell小室進行檢測。侵襲實驗,在小室的上層鋪100 μg 的基質(zhì)膠。遷移實驗不鋪基質(zhì)膠。并于Transwell 小室上室加入3×105個/mL 的Lewis 細胞200 μL,培養(yǎng)24 h 后吸棄培養(yǎng)液,小心擦掉小室上層沒有發(fā)生侵襲或遷移的細胞,PBS 沖洗2 次后,10%甲醇固定30 min,5%結(jié)晶紫染色20 min 后進行拍照計數(shù)。

        1.4.2 HIF-1α和VEGF-A的測定

        將Lewis細胞按106個/mL接種于96孔細胞培養(yǎng)板中,加入不同培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,收集上清液,采用ELISA法檢測HIF-1α和VEGF-A含量。

        1.4.3 流式細胞術(shù)檢測腫瘤細胞凋亡

        實驗分組同“1.4.1”,培養(yǎng)24 h 后收集6 孔板中Lewis 細胞,使用AnnexinV-APC/7-AAD 細胞凋亡檢測試劑盒檢測Lewis細胞凋亡。

        1.4.4 免疫印跡試驗

        采用Western blot 技術(shù)檢測腫瘤細胞轉(zhuǎn)移和凋亡相關(guān)蛋白E-Cadherin(1∶5 000)、N-Cadherin(1∶2 000)、Vimentin(1∶2 000)、Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶2 000)的表達水平,方法同“1.3.1”項,以目的蛋白條帶與內(nèi)參GAPDH(1∶1 000)蛋白條帶的灰度值之比表示目的蛋白的相對表達水平。

        1.5 統(tǒng)計學方法

        實驗重復3 次,實驗結(jié)果采用均值±標準差(±s)表示。實驗數(shù)據(jù)采用IBM SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析,不同組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(One-way ANOVA),并使用Origin 8.1 軟件進行繪圖。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié)果

        2.1 SPS-1 誘導RAW264.7 細胞由M2 表型向M1 表型極化

        20 ng/mL IL-4 處理RAW264.7 細胞可增加膜表面分子CD206 和減少CD86 的表達,這表明形成了極化的M2 型巨噬細胞。在SPS-1 處理后,CD86/CD206 以劑量依賴性方式顯著增加,SPS-1 濃度為400、800 μg/mL 時,CD86/CD206 比值較M2 組具有極顯著差異(P<0.01)。結(jié)果見圖1。與M1 表型相關(guān)的炎癥因子TNF-α mRNA 的表達量升高,特異性M1 指標iNOS mRNA 的表達量也顯著上調(diào);與之相反,IL-10、TGF-β mRNA 及特異性M2 指標Arg-1 mRNA 的表達量則顯著下調(diào),與M2 組相比,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01),見表2。綜上,SPS-1 可誘導RAW264.7 細胞由M2 表型向M1 表型極化。

        圖1 SPS-1對RAW264.7細胞膜表面CD206和CD86蛋白表達的影響

        表2 各組對RAW264.7巨噬細胞極化相關(guān)基因mRNA相對表達量的比較(±s)

        表2 各組對RAW264.7巨噬細胞極化相關(guān)基因mRNA相對表達量的比較(±s)

        注:與M0組比較,*P<0.05,**P<0.01;與M2組比較,△P<0.05,△△P<0.01。

        組別M0組M2組M21組M22組M23組Arg-1 0.94±0.08 3.29±0.21**2.64±0.16**2.07±0.14**△△1.58±0.18△△TNF-α 1.03±0.12 0.39±0.06*0.84±0.06△△1.16±0.16△1.84±0.14*△△iNOS 1.02±0.15 0.49±0.04 0.89±0.08△1.30±0.13△1.91±0.04*△△IL-10 1.05±0.13 1.43±0.12 1.24±0.05 1.01±0.06 0.81±0.04△TGF-β 1.01±0.11 2.52±0.17**2.05±0.11**1.65±0.11*△1.38±0.13△△

        2.2 SPS-1 調(diào)控M1/M2 巨噬細胞極化抑制Lewis 細胞的遷移與凋亡

        SPS-1 調(diào)控M1/M2 巨噬細胞極化抑制Lewis 細胞的遷移與凋亡的實驗結(jié)果見表3 和圖2。共培養(yǎng)條件下,與對照組相比,CM0、CM2、CM3 組均可不同程度地降低Lewis細胞的遷移能力,與CM1組相比,CM0、CM2組均可極顯著降低Lewis 細胞的遷移(P<0.01),CM3組也可顯著或極顯著的降低Lewis 細胞的遷移能力(P<0.05,P<0.01)。ELISA 和Western blot 實驗結(jié)果顯示,CM0、CM2、CM3 組均可顯著或極顯著的降低HIF-1α和VEGF的分泌及N-Cadherin和Vimentin的表達,而E-Cadherin 表達則極顯著增加(P<0.01)。以上結(jié)果表明SPS-1 可通過誘導RAW264.7 細胞極化為M1 亞型抑制Lewis 細胞的遷移能力。流式細胞儀檢測Lewis 細胞凋亡,與對照組和CM1 組相比,CM0、CM2、CM3 組共培養(yǎng)體系中,Lewis 細胞凋亡率明顯增加(P<0.01)。進一步通過Western blot實驗檢測Lewis 細胞中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 和Bax 的表達水平,結(jié)果顯示經(jīng)SPS-1 處理,可顯著降低Lewis 細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達及提高促凋亡蛋白Bax 的表達,以上結(jié)果表明,SPS-1 可誘導RAW264.7 細胞極化促進Lewis細胞的凋亡。

        圖2 共培養(yǎng)條件下SPS-1對Lewis細胞轉(zhuǎn)移及凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

        表3 各組對Lewis細胞的抑制作用比較(±s)

        表3 各組對Lewis細胞的抑制作用比較(±s)

        注:與Control組比較,*P<0.05,**P<0.01;與CM1組比較,△P<0.05,△△P<0.01。

        組別Control組CM0組CM1組CM2組CM3組凋亡指數(shù)4.13±0.12△△24.10±0.67**△△3.19±0.10**39.36±1.07**△△19.38±1.17**△△遷移率/%100.00±3.03 62.12±4.01**△△128.28±7.63 40.40±1.75**△△85.35±3.15*△侵襲率/%100.00±2.29△△55.00±2.29**△△121.50±3.97*35.00±1.73**△△90.00±2.60*△△HIF-1α/(pg/mL)575.20±43.75△△287.03±18.96*△△868.79±35.87**186.19±11.58*△△477.54±34.59△△VEGF/(pg/mL)229.96±25.66△△112.78±11.94*△333.59±30.52 62.58±6.79*△188.57±20.51△

        3 討論

        非小細胞肺癌(NSCLC)是肺癌的主要類型,約占肺癌的85%~90%[11]。目前免疫治療、靶向治療等新的治療方法已引入到NSCLC 治療中[12]。作為腫瘤組織中主要的免疫調(diào)節(jié)細胞,腫瘤相關(guān)巨噬細胞在腫瘤的免疫反應中發(fā)揮重要作用[13]。但是,巨噬細胞存在著高度異質(zhì),會在局部微環(huán)境刺激下從M0 階段極化到不同的亞型即M1和M2型,顯示完全相反的功能。

        在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中,腫瘤相關(guān)巨噬細胞的極化普遍存在,M1 型和M2 型巨噬細胞在表型、標記物、精氨酸代謝和對腫瘤的影響方面存在差異。M1 型巨噬細胞是典型激活的促炎性細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的統(tǒng)稱,其細胞膜分子CD40、CD80 和CD86等表達增加[14]。M2 型巨噬細胞表現(xiàn)出更高的甘露糖受體(CD206)轉(zhuǎn)錄表達,并通過分泌抑制性細胞因子IL-10、TGF-β 等下調(diào)免疫應答,減少促炎細胞因子的產(chǎn)生[15]。它們也可以根據(jù)精氨酸代謝相互區(qū)分,其中M1 型巨噬細胞優(yōu)先通過誘導型一氧化氮合酶(iNOS)將精氨酸代謝為NO,而M2 樣巨噬細胞優(yōu)先通過精氨酸酶-1(Arg-1)將精氨酸代謝為鳥氨酸[16]。本研究發(fā)現(xiàn)血滿草多糖(SPS-1)能促進M1 型巨噬細胞極化,上調(diào)其特征標記CD86、下調(diào)清道夫受體CD206 表達。SPS-1 處理的RAW264.7 細胞具有濃度依賴的TNF-α、iNOS mRNA 水平升高及IL-10、TGF-β、Arg-1 mRNA 水平降低,可顯著誘導RAW264.7細胞由M2型向M1型極化。

        抑制腫瘤的侵襲和遷移能力是藥物發(fā)揮抗癌作用的一個重要因素。血管的生成在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的作用[17],可以促進腫瘤細胞的快速生長,從而進一步加速實體腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。HIF-1α 通過活化上調(diào)P13K/Akt 信號通路在轉(zhuǎn)錄水平介導VEGF 蛋白表達。VEGF 是一種血管生成因子,參與許多生理和病理過程,其意義與促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移有關(guān)[19]。缺氧也會引發(fā)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),EMT 是原發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移進展的重要生物學機制,它的主要變現(xiàn)是極性的上皮細胞轉(zhuǎn)換為活動能力強的間質(zhì)細胞并獲得侵襲和遷移能力[20]。上皮標志物如ECadherin 等表達下調(diào)、間充質(zhì)細胞標志物Vimentin 和N-Cadherin 表達的增加是EMT 表型改變的主要特征,這導致EMT過程的發(fā)生,導致轉(zhuǎn)移的起始[21-23]。本研究的Transwell 實驗結(jié)果表明,共培養(yǎng)條件下,SPS-1 通過調(diào)控RAW264.7 細胞極化顯著抑制Lewis 細胞的侵襲和遷移,并降低HIF-1α和VEGF的分泌及NCadherin 和Vimentin 的表達,同時顯著上調(diào)ECadherin 的表達,從而起到抑制Lewis 細胞轉(zhuǎn)移的作用。凋亡實驗結(jié)果顯示,SPS-1 亦可通過調(diào)控RAW264.7細胞極化顯著促進Lewis細胞的凋亡。

        4 結(jié)論

        SPS-1 可促進巨噬細胞M1 型極化并通過調(diào)控巨噬細胞極化抑制Lewis細胞的轉(zhuǎn)移及促進其凋亡。

        猜你喜歡
        表型極化多糖
        認知能力、技術(shù)進步與就業(yè)極化
        米胚多糖的組成及抗氧化性研究
        熟三七多糖提取工藝的優(yōu)化
        中成藥(2018年3期)2018-05-07 13:34:45
        建蘭、寒蘭花表型分析
        雙頻帶隔板極化器
        電子測試(2017年15期)2017-12-18 07:18:51
        GABABR2基因遺傳變異與肥胖及代謝相關(guān)表型的關(guān)系
        基于PWM控制的新型極化電源設(shè)計與實現(xiàn)
        慢性乙型肝炎患者HBV基因表型與血清學測定的臨床意義
        72例老年急性白血病免疫表型分析
        酶法降解白及粗多糖
        中成藥(2014年11期)2014-02-28 22:29:50
        日韩少妇人妻一区二区| 无码中文字幕日韩专区视频| 日本污ww视频网站| 中国丰满熟妇xxxx性| 亚洲伊人久久大香线蕉综合图片| 国产亚洲成年网址在线观看| 国产精品美女主播一区二区| 中文字幕日韩精品有码视频| 老师翘臀高潮流白浆| 久久福利资源国产精品999| 天堂av一区二区在线| 亚洲精品中文字幕乱码影院| 中出人妻中文字幕无码| 521色香蕉网站在线观看| 日韩av中文字幕亚洲天| 45岁妇女草逼视频播放| 精品三级av无码一区| 日韩久久一级毛片| 中文字幕中文一区中文字幕| 日韩人妖视频一区二区| 亚洲av无码一区二区三区观看| 图图国产亚洲综合网站| 在线视频播放观看免费| 欧美xxxxx高潮喷水麻豆| 中文字幕亚洲欧美日韩2019| 国产精品深夜福利免费观看| 日本少妇又色又紧又爽又刺激| 欧美做受又硬又粗又大视频| 爱情岛论坛亚洲品质自拍hd| 成年人免费黄色h网| 日本刺激视频一区二区| 夜夜揉揉日日人人青青| 午夜性刺激免费视频| 中文字幕国产精品专区| 一边摸一边做爽的视频17国产| 国产农村乱子伦精品视频| 毛片av在线播放亚洲av网站| 黄片国产一区二区三区| 三级全黄的视频在线观看| 欧美中文字幕在线| 精品国产麻豆免费人成网站|