袁雷,胡亞?wèn)|
(1.西藏農(nóng)牧學(xué)院,西藏特色農(nóng)牧資源省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,西藏自治區(qū) 林芝 860000;2.中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所,四川 成都 610041)
腫瘤防治是一個(gè)全球性難題,2013年《Science》雜志將腫瘤的免疫治療評(píng)為當(dāng)年十大科技進(jìn)展之首,2018年抑制免疫負(fù)向調(diào)控用于腫瘤治療的研究被授予諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng),從而使腫瘤免疫治療成為時(shí)代主流。與傳統(tǒng)的直接靶向腫瘤細(xì)胞的治療方法不同,通過(guò)激活宿主的免疫系統(tǒng)從而達(dá)到消除腫瘤是腫瘤免疫療法的主要作用機(jī)制[1]。
重塑腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)是癌癥免疫治療的有效策略[2-3]。TAM 是腫瘤微環(huán)境(TME)的重要組成部分之一,占腫瘤體積的50%,可分為兩種亞型,即典型激活的巨噬細(xì)胞(M1)和交替激活的巨噬細(xì)胞(M2)。簡(jiǎn)單地說(shuō),M1 亞型具有強(qiáng)大的抗原呈遞能力,可以促進(jìn)Th1 免疫以殺死腫瘤細(xì)胞。然而,TME 中的大多數(shù)TAM 傾向于分化為M2 表型。M2 巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)組織修復(fù)和血管生成的Th2 型免疫,從而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[3-4]。因此,將TAM 極化為M1 亞型的免疫調(diào)節(jié)劑是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。
多糖的免疫調(diào)節(jié)作用是其最重要的生物活性之一,靈芝多糖[5]、紅花多糖[6]、紫錐菊多糖[7]、蛹蟲(chóng)草多糖[8]等均可通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞極化抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。血滿(mǎn)草(Sambucus adnata)為我國(guó)民間常用藥,也是藏藥的藥源植物之一,其味辛、澀、性溫,具有祛風(fēng)、利水、活血、通絡(luò)的功效,主治急慢性腎炎、風(fēng)濕疼痛等癥[9]。前期研究中,本課題組詳細(xì)解析了血滿(mǎn)草多糖(Sambucus adnatepolysaccharide,SPS-1)的結(jié)構(gòu)特征,并發(fā)現(xiàn)SPS-1 與TLR2 受體結(jié)合并通過(guò)MAPKs 和NF-κB 信號(hào)通路激活RAW 264.7 細(xì)胞的免疫活性[10]。本研究在前期研究基礎(chǔ)上通過(guò)探討SPS-1 對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響及在共培養(yǎng)條件下對(duì)Lewis 細(xì)胞的抑制作用研究,以期為深入開(kāi)展血滿(mǎn)草多糖SPS-1的抗腫瘤作用及實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
1.1.1 細(xì)胞株
小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 和小鼠肺癌細(xì)胞Lewis由武漢普諾賽生命科技有限公司提供。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物
血滿(mǎn)草多糖SPS-1 為本課題組自制,糖含量94.76%。
1.1.3 主要試劑
DMEM 高糖細(xì)胞培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素雙抗和胎牛血清(美國(guó)Gibco公司);白細(xì)胞介素-4(IL-4,美國(guó)PeproTech 公司);Trizol(美國(guó)Ambion 公司);小鼠單抗β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)、辣根過(guò)氧化物酶/HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司);兔多抗巨噬細(xì)胞甘露糖受體(CD206)、E-鈣黏蛋白(ECadherin)、N-鈣黏蛋白(N-Cadherin)和波形纖維蛋白(Vimentin)(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司);兔多抗磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDHF,杭州賢至生物有限公司);兔單抗B 淋巴細(xì)胞瘤-2 蛋白(Bcl-2)、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白(Bax)(美國(guó)Abcam 公司);A 型血管表皮生長(zhǎng)因子(VEGF-A)、缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1α)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司);兔多抗白細(xì)胞分化抗原(CD86)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green(南京諾唯贊生物科技股份有限公司);引物合成(北京擎科生物科技有限公司);其他試劑均為分析純或色譜純。
1.1.4 主要儀器
電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司,型號(hào):CPA225D);酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo 公司,型號(hào):mμlISKANMK3);熒光定量PCR 儀(美國(guó)ABI 公司,型號(hào):QuantStudio 6);CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO 公司,型號(hào):MCO-15AC);流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman coulter 公司,型號(hào):cytoFLEX);離心機(jī)(美國(guó)Eppendorf公司,型號(hào):5702R)。
將液氮保存的RAW264.7 細(xì)胞和Lewis 細(xì)胞于37 ℃水浴中溶解凍存液;并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有5 mL培養(yǎng)基的離心管中,常溫條件下1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞;用高糖DMEM 培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)懸浮細(xì)胞,接種至培養(yǎng)皿,37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。
將RAW264.7細(xì)胞接種于6孔板中,加入20 ng/mL的IL-4 培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞并用PBS 清洗2 次,得到M2 型巨噬細(xì)胞。隨機(jī)分為M0 組(對(duì)照組)、M2 組(M2極化組)、M21 組(M2 極化組 + 200 μg/mL SPS-1)、M22 組(M2 極化組+ 400 μg/mL SPS-1)和M23 組(M2 極化組 + 800 μg/mL SPS-1),給予相應(yīng)藥物處理24 h。
1.3.1 表面標(biāo)志物的檢測(cè)
采用Western blot 技術(shù)分析不同極化狀態(tài)RAW264.7 細(xì)胞的表面標(biāo)志物(CD206 和CD86)。各組培養(yǎng)24 h后用胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞,RIPA 裂解液將細(xì)胞裂解30 min,4 ℃、12 000 r/min 離心10 min,取上清測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉1 h 后,一抗孵育過(guò)夜,TBST 洗滌5 次,孵育二抗,用ECL 試劑盒進(jìn)行顯影,成像系統(tǒng)顯像并采用BandScan 軟件分析條帶灰度值,重復(fù)3 次。一抗包括抗CD206(1∶500)、抗CD86(1∶1 000)和抗β-actin(1∶500),二抗包括山羊抗兔/小鼠IgG-HRP。以目的蛋白條帶與內(nèi)參β-actin 蛋白條帶的灰度值之比表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。
1.3.2 TNF-α、iNOS、IL-10、TGF-β 和Arg-1 基因表達(dá)水平
各組培養(yǎng)24 h后去除培養(yǎng)基,按照Trizol法提取總RNA,檢測(cè)純度后,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,進(jìn)行RT-qPCR 反應(yīng)。根據(jù)GenBank 中基因序列設(shè)計(jì)PCR 引物,檢測(cè)TNF-α、iNOS、IL-10、TGF-β 和Arg-1 基因的表達(dá)水平,以β-actin 為內(nèi)參。PCR擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性15 s;60 ℃退火60 s,共40 個(gè)循環(huán)。每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔,以2-△△Ct值表示目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。RT-qPCR引物信息見(jiàn)表1。
表1 RT-qPCR各目的基因引物序列
1.4.1 細(xì)胞遷移和侵襲試驗(yàn)
將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞以3×105個(gè)/孔移植于無(wú)血清DMEM的6孔板中,根據(jù)分組加入不同試劑(終濃度800 μg/mL 的SPS-1 或/和終濃度20 ng/mL的IL-4),培養(yǎng)24 h 后收集上清,得到條件培養(yǎng)基(Conditioned medium,CM),備用。
實(shí)驗(yàn)分組:Control 組(Lewis 細(xì)胞)、CM0 組(SPS-1 + Lewis 細(xì)胞)、CM1 組(RAW264.7 + IL-4 的條件培養(yǎng)基 + Lewis細(xì)胞)、CM2組(RAW264.7 + SPS-1的條件培養(yǎng)基 + Lewis細(xì)胞)和CM3組(RAW264.7 + IL-4 +SPS-1 的條件培養(yǎng)基 + Lewis 細(xì)胞),處理24 h 后收集細(xì)胞開(kāi)展遷移和侵襲試驗(yàn)。體外細(xì)胞的侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)用24孔板Transwell小室進(jìn)行檢測(cè)。侵襲實(shí)驗(yàn),在小室的上層鋪100 μg 的基質(zhì)膠。遷移實(shí)驗(yàn)不鋪基質(zhì)膠。并于Transwell 小室上室加入3×105個(gè)/mL 的Lewis 細(xì)胞200 μL,培養(yǎng)24 h 后吸棄培養(yǎng)液,小心擦掉小室上層沒(méi)有發(fā)生侵襲或遷移的細(xì)胞,PBS 沖洗2 次后,10%甲醇固定30 min,5%結(jié)晶紫染色20 min 后進(jìn)行拍照計(jì)數(shù)。
1.4.2 HIF-1α和VEGF-A的測(cè)定
將Lewis細(xì)胞按106個(gè)/mL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,加入不同培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,收集上清液,采用ELISA法檢測(cè)HIF-1α和VEGF-A含量。
1.4.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡
實(shí)驗(yàn)分組同“1.4.1”,培養(yǎng)24 h 后收集6 孔板中Lewis 細(xì)胞,使用AnnexinV-APC/7-AAD 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Lewis細(xì)胞凋亡。
1.4.4 免疫印跡試驗(yàn)
采用Western blot 技術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和凋亡相關(guān)蛋白E-Cadherin(1∶5 000)、N-Cadherin(1∶2 000)、Vimentin(1∶2 000)、Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶2 000)的表達(dá)水平,方法同“1.3.1”項(xiàng),以目的蛋白條帶與內(nèi)參GAPDH(1∶1 000)蛋白條帶的灰度值之比表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。
實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,不同組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(One-way ANOVA),并使用Origin 8.1 軟件進(jìn)行繪圖。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
20 ng/mL IL-4 處理RAW264.7 細(xì)胞可增加膜表面分子CD206 和減少CD86 的表達(dá),這表明形成了極化的M2 型巨噬細(xì)胞。在SPS-1 處理后,CD86/CD206 以劑量依賴(lài)性方式顯著增加,SPS-1 濃度為400、800 μg/mL 時(shí),CD86/CD206 比值較M2 組具有極顯著差異(P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)圖1。與M1 表型相關(guān)的炎癥因子TNF-α mRNA 的表達(dá)量升高,特異性M1 指標(biāo)iNOS mRNA 的表達(dá)量也顯著上調(diào);與之相反,IL-10、TGF-β mRNA 及特異性M2 指標(biāo)Arg-1 mRNA 的表達(dá)量則顯著下調(diào),與M2 組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01),見(jiàn)表2。綜上,SPS-1 可誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞由M2 表型向M1 表型極化。
圖1 SPS-1對(duì)RAW264.7細(xì)胞膜表面CD206和CD86蛋白表達(dá)的影響
表2 各組對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較(±s)
表2 各組對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較(±s)
注:與M0組比較,*P<0.05,**P<0.01;與M2組比較,△P<0.05,△△P<0.01。
組別M0組M2組M21組M22組M23組Arg-1 0.94±0.08 3.29±0.21**2.64±0.16**2.07±0.14**△△1.58±0.18△△TNF-α 1.03±0.12 0.39±0.06*0.84±0.06△△1.16±0.16△1.84±0.14*△△iNOS 1.02±0.15 0.49±0.04 0.89±0.08△1.30±0.13△1.91±0.04*△△IL-10 1.05±0.13 1.43±0.12 1.24±0.05 1.01±0.06 0.81±0.04△TGF-β 1.01±0.11 2.52±0.17**2.05±0.11**1.65±0.11*△1.38±0.13△△
SPS-1 調(diào)控M1/M2 巨噬細(xì)胞極化抑制Lewis 細(xì)胞的遷移與凋亡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3 和圖2。共培養(yǎng)條件下,與對(duì)照組相比,CM0、CM2、CM3 組均可不同程度地降低Lewis細(xì)胞的遷移能力,與CM1組相比,CM0、CM2組均可極顯著降低Lewis 細(xì)胞的遷移(P<0.01),CM3組也可顯著或極顯著的降低Lewis 細(xì)胞的遷移能力(P<0.05,P<0.01)。ELISA 和Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CM0、CM2、CM3 組均可顯著或極顯著的降低HIF-1α和VEGF的分泌及N-Cadherin和Vimentin的表達(dá),而E-Cadherin 表達(dá)則極顯著增加(P<0.01)。以上結(jié)果表明SPS-1 可通過(guò)誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞極化為M1 亞型抑制Lewis 細(xì)胞的遷移能力。流式細(xì)胞儀檢測(cè)Lewis 細(xì)胞凋亡,與對(duì)照組和CM1 組相比,CM0、CM2、CM3 組共培養(yǎng)體系中,Lewis 細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.01)。進(jìn)一步通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Lewis 細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 和Bax 的表達(dá)水平,結(jié)果顯示經(jīng)SPS-1 處理,可顯著降低Lewis 細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)及提高促凋亡蛋白Bax 的表達(dá),以上結(jié)果表明,SPS-1 可誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞極化促進(jìn)Lewis細(xì)胞的凋亡。
圖2 共培養(yǎng)條件下SPS-1對(duì)Lewis細(xì)胞轉(zhuǎn)移及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
表3 各組對(duì)Lewis細(xì)胞的抑制作用比較(±s)
表3 各組對(duì)Lewis細(xì)胞的抑制作用比較(±s)
注:與Control組比較,*P<0.05,**P<0.01;與CM1組比較,△P<0.05,△△P<0.01。
組別Control組CM0組CM1組CM2組CM3組凋亡指數(shù)4.13±0.12△△24.10±0.67**△△3.19±0.10**39.36±1.07**△△19.38±1.17**△△遷移率/%100.00±3.03 62.12±4.01**△△128.28±7.63 40.40±1.75**△△85.35±3.15*△侵襲率/%100.00±2.29△△55.00±2.29**△△121.50±3.97*35.00±1.73**△△90.00±2.60*△△HIF-1α/(pg/mL)575.20±43.75△△287.03±18.96*△△868.79±35.87**186.19±11.58*△△477.54±34.59△△VEGF/(pg/mL)229.96±25.66△△112.78±11.94*△333.59±30.52 62.58±6.79*△188.57±20.51△
非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是肺癌的主要類(lèi)型,約占肺癌的85%~90%[11]。目前免疫治療、靶向治療等新的治療方法已引入到NSCLC 治療中[12]。作為腫瘤組織中主要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞,腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在腫瘤的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[13]。但是,巨噬細(xì)胞存在著高度異質(zhì),會(huì)在局部微環(huán)境刺激下從M0 階段極化到不同的亞型即M1和M2型,顯示完全相反的功能。
在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中,腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的極化普遍存在,M1 型和M2 型巨噬細(xì)胞在表型、標(biāo)記物、精氨酸代謝和對(duì)腫瘤的影響方面存在差異。M1 型巨噬細(xì)胞是典型激活的促炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的統(tǒng)稱(chēng),其細(xì)胞膜分子CD40、CD80 和CD86等表達(dá)增加[14]。M2 型巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出更高的甘露糖受體(CD206)轉(zhuǎn)錄表達(dá),并通過(guò)分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10、TGF-β 等下調(diào)免疫應(yīng)答,減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[15]。它們也可以根據(jù)精氨酸代謝相互區(qū)分,其中M1 型巨噬細(xì)胞優(yōu)先通過(guò)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)將精氨酸代謝為NO,而M2 樣巨噬細(xì)胞優(yōu)先通過(guò)精氨酸酶-1(Arg-1)將精氨酸代謝為鳥(niǎo)氨酸[16]。本研究發(fā)現(xiàn)血滿(mǎn)草多糖(SPS-1)能促進(jìn)M1 型巨噬細(xì)胞極化,上調(diào)其特征標(biāo)記CD86、下調(diào)清道夫受體CD206 表達(dá)。SPS-1 處理的RAW264.7 細(xì)胞具有濃度依賴(lài)的TNF-α、iNOS mRNA 水平升高及IL-10、TGF-β、Arg-1 mRNA 水平降低,可顯著誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞由M2型向M1型極化。
抑制腫瘤的侵襲和遷移能力是藥物發(fā)揮抗癌作用的一個(gè)重要因素。血管的生成在腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[17],可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的快速生長(zhǎng),從而進(jìn)一步加速實(shí)體腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。HIF-1α 通過(guò)活化上調(diào)P13K/Akt 信號(hào)通路在轉(zhuǎn)錄水平介導(dǎo)VEGF 蛋白表達(dá)。VEGF 是一種血管生成因子,參與許多生理和病理過(guò)程,其意義與促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有關(guān)[19]。缺氧也會(huì)引發(fā)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),EMT 是原發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)展的重要生物學(xué)機(jī)制,它的主要變現(xiàn)是極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換為活動(dòng)能力強(qiáng)的間質(zhì)細(xì)胞并獲得侵襲和遷移能力[20]。上皮標(biāo)志物如ECadherin 等表達(dá)下調(diào)、間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin 和N-Cadherin 表達(dá)的增加是EMT 表型改變的主要特征,這導(dǎo)致EMT過(guò)程的發(fā)生,導(dǎo)致轉(zhuǎn)移的起始[21-23]。本研究的Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,共培養(yǎng)條件下,SPS-1 通過(guò)調(diào)控RAW264.7 細(xì)胞極化顯著抑制Lewis 細(xì)胞的侵襲和遷移,并降低HIF-1α和VEGF的分泌及NCadherin 和Vimentin 的表達(dá),同時(shí)顯著上調(diào)ECadherin 的表達(dá),從而起到抑制Lewis 細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SPS-1 亦可通過(guò)調(diào)控RAW264.7細(xì)胞極化顯著促進(jìn)Lewis細(xì)胞的凋亡。
SPS-1 可促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1 型極化并通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞極化抑制Lewis細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及促進(jìn)其凋亡。