鐘琪 ，陳偉康 ，周國平 ，劉艷梅 ，劉德鴻 #，李晶 （1.贛州市人民醫(yī)院藥劑科，江西 贛州 41000；.江西省藥品檢驗(yàn)檢測研究院/國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，南昌 009；.江西省中醫(yī)藥研究院，南昌 009）

八寶驚風(fēng)散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第二十冊，由天麻（制）、黃芩、人工牛黃等19味中藥組成。該品種具有祛風(fēng)化痰、退熱鎮(zhèn)驚之功效，可用于小兒驚風(fēng)、發(fā)燒咳嗽、嘔吐痰涎，因其臨床療效較好，被譽(yù)為“兒科圣藥”。其中，人工牛黃在方中發(fā)揮清熱解毒、退熱、化痰定驚的重要作用。但八寶驚風(fēng)散現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有顯微鑒別、黃酮類化合物化學(xué)鑒別、丁香薄層鑒別項(xiàng)，無含量測定項(xiàng)；經(jīng)查閱文獻(xiàn)，雖有一些關(guān)于方中藥味的質(zhì)量研究報(bào)道，卻均未探討人工牛黃的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。人工牛黃由牛膽粉、膽酸、豬去氧膽酸、?；撬?、膽紅素、膽固醇、微量元素等加工制成，可用于痰熱譫狂、神昏不語、小兒急驚風(fēng)等病癥的治療[1]。膽酸、豬去氧膽酸、?；悄懰釣槿斯づ｜S中的主要活性成分[2]，具有非常好的抗菌[3]、抗病毒[4]作用，尤其對β-內(nèi)酰胺酶耐藥菌株感染亦有較好的療效[5]，因此也是小兒氨酚黃那敏顆粒、小兒化毒膠囊、氨金黃敏顆粒、復(fù)方小兒退熱栓等小兒常用退熱藥品的重要組成成分。中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的小兒驚風(fēng)發(fā)熱與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的細(xì)菌、病毒感染等密切相關(guān)。基于人工牛黃在抗菌、抗炎、抗病毒及退熱方面所起的重要作用，以及八寶驚風(fēng)散現(xiàn)有質(zhì)量控制方法中對人工牛黃質(zhì)量控制的缺失，同時(shí)考慮到人工牛黃價(jià)格較高，市場上摻偽現(xiàn)象常見等諸多因素，對八寶驚風(fēng)散中人工牛黃的3個(gè)活性膽汁酸類成分開展質(zhì)量評價(jià)工作具有重要意義。

本研究擬采用超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法，建立八寶驚風(fēng)散中膽酸、豬去氧膽酸和牛磺膽酸鈉的含量測定方法，并對3個(gè)廠家的9批樣品進(jìn)行差異分析，旨在為提高八寶驚風(fēng)散中人工牛黃的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)及臨床療效提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括1290型超高效液相色譜儀（美國Agilent公司）、API型4000三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（美國AB Sciex公司）、ML204T型萬分之一天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]、BT 25 S型十萬分之一天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]等。

1.2 主要藥品與試劑

9批八寶驚風(fēng)散均為市售品，分別來自屬地為廣東、江西的A、B、C 3個(gè)廠家，樣品編號分別為A1～A3、B1～B3、C1～C3；制備陰性樣品所用飲片均購自江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司。膽酸對照品（批號100078-201415，純度98.9%）、豬去氧膽酸對照品（批號100087-201411，純度99.7%）、?；悄懰徕c對照品（批號110815-201911，純度87.3%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜級，購自美國Sigma-Aldrich公司；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與質(zhì)譜條件

以Phenomenex Luna?C18（150 mm×2 mm，3 μm）為色譜柱；以乙腈為流動(dòng)相A、水為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫（0～4 min，5%A→40%A；4～7 min，40%A→70%A；7～10 min，70%A；10～10.1 min，70%A→5%A；10.1～14 min，5%A）；流速：0.5 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。

采用電噴霧離子源，噴霧氣壓力為60 psi，干燥氣壓力為50 psi，氣簾氣壓力為25 psi；離子源溫度為550 ℃；噴霧電壓為-4 500 V；負(fù)離子單四極桿模式；膽酸、豬去氧膽酸和?；悄懰徕c的m/z分別為407.2、392.2、514.2。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液

取膽酸、豬去氧膽酸和?；悄懰徕c對照品各適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇分別制成質(zhì)量濃度為109.68、107.68、94.81 μg/mL的對照品儲(chǔ)備液。分別精密量取各對照品儲(chǔ)備液0.2 mL，置同一100 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容，即得質(zhì)量濃度分別為219.36、215.36、189.62 ng/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液

取八寶驚風(fēng)散0.1 g，精密稱定，置具塞棕色錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率500 W，頻率40 kHz）處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，加甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5 mL，置100 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，用0.22 μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液

按八寶驚風(fēng)散的處方及工藝制備缺人工牛黃和膽南星的陰性樣品（因膽南星為天南星用膽汁炮制而成，其中含少量的膽汁酸類成分），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備成陰性樣品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn)

分別取陰性樣品溶液、混合對照品溶液和供試品溶液（編號A1），按“2.1”項(xiàng)下檢測條件進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，陰性樣品溶液對檢測無干擾，色譜見圖1。

2.3.2 線性關(guān)系考察及檢測限、定量限測定

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下各對照品儲(chǔ)備液0.025、0.025、0.025、0.2、0.2、0.25 mL，分別置500、100、50、200、100、50 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成膽酸質(zhì)量濃度分別為5.48、27.42、58.84、109.68、219.36、548.40 ng/mL，豬去氧膽酸質(zhì)量濃度分別為5.38、26.92、53.84、107.68、215.36、538.40 ng/mL，?；悄懰徕c質(zhì)量濃度分別為4.74、23.70、47.40、94.81、189.62、474.05 ng/mL的混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下檢測條件進(jìn)樣測定，以各成分質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，用Analyst工作站擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密吸取混合對照品溶液進(jìn)行梯度稀釋，分別以信噪比為3∶1和10∶1時(shí)對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為各成分的檢測限和定量限，結(jié)果見表1。

表1 待測成分的線性關(guān)系考察結(jié)果和檢測限、定量限結(jié)果

2.3.3 精密度試驗(yàn)

取供試品溶液（編號A1），按“2.1”項(xiàng)下檢測條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，膽酸、豬去氧膽酸和?；悄懰徕c峰面積的RSD分別為2.1%、1.9%、2.2%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液（編號A1），按“2.1”項(xiàng)下檢測條件，在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)分別進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，膽酸、豬去氧膽酸和?；悄懰徕c峰面積的RSD分別為2.9%、3.1%、3.5%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取八寶驚風(fēng)散（編號A1）6份，每份0.1 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下檢測條件進(jìn)樣分析，按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果顯示，膽酸、豬去氧膽酸和牛磺膽酸鈉的平均含量分別為1.483、1.768、1.503 mg/g，RSD分別為2.5%、3.7%、3.2%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取八寶驚風(fēng)散（編號A1）6份，每份0.05 g，分別精密加入含膽酸、豬去氧膽酸和牛磺膽酸鈉對照品的甲醇溶液（膽酸1 535.52 ng/mL、豬去氧膽酸1 722.82 ng/mL、?；悄懰徕c1 516.92 ng/mL）50 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下自“稱定質(zhì)量”起，同法制備成供試品溶液；再按“2.1”項(xiàng)下檢測條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，并計(jì)算回收率及RSD。結(jié)果顯示，膽酸、豬去氧膽酸和?；悄懰徕c的平均回收率分別為103.3%、103.3%、101.6%，RSD分別為3.3%、3.4%、4.2%（n＝6），表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.4 樣品含量測定

取不同批次八寶驚風(fēng)散，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下檢測條件進(jìn)樣分析，按外標(biāo)法計(jì)算各批次樣品中膽酸、豬去氧膽酸和?；悄懰徕c的含量，結(jié)果見表2。

2.5 樣品數(shù)據(jù)分析

對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性及探索性分析，結(jié)果顯示，3個(gè)廠家樣品之間膽酸、豬去氧膽酸和?；悄懰徕c含量存在一定差異，推測是由于投料的人工牛黃質(zhì)量差異或者生產(chǎn)工藝不同導(dǎo)致的。A廠家樣品3個(gè)成分的平均含量均高于其他2個(gè)廠家樣品，且批間差異最??；C廠家樣品3個(gè)成分的平均含量均低于其他2個(gè)廠家樣品，且批間差異較大。這表明A廠家樣品中人工牛黃的質(zhì)量和對生產(chǎn)工藝的控制能力可能優(yōu)于其他2個(gè)廠家；C廠家樣品的質(zhì)量相對較差，批間差異大，質(zhì)量控制不穩(wěn)定。應(yīng)用IBM SPSS軟件，采用組間連接系統(tǒng)聚類法，以平方歐氏距離為測度進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖2。當(dāng)歐氏距離為7.0時(shí)，9批樣品可聚為3類，A1～A3、C2為第1類，B1～B3為第2類，C1、C3為第3類，基本可以區(qū)分不同廠家的樣品；但C廠家有1批樣品與A廠家的3批樣品歸為一類，其可能原因?yàn)镃廠家的人工牛黃原料批間差異較大或生產(chǎn)工藝批間差異較大。上述結(jié)果表明，不同批次樣品3個(gè)成分的含量存在一定的差異，這可能與廠家所用原料和生產(chǎn)工藝存在差異有關(guān)。

圖2 9批八寶驚風(fēng)散聚類分析樹狀圖

以3個(gè)成分的含量為變量，對9批樣品進(jìn)行主成分分析，以主成分的特征值及貢獻(xiàn)率作為選擇主成分的依據(jù)，結(jié)果，主成分1特征值為2.589，貢獻(xiàn)率為86.285%，是唯一主成分。計(jì)算3個(gè)廠家樣品的主成分綜合得分，A、B、C 3個(gè)廠家樣品的得分分別為2.36～2.63、1.77～2.04、1.09～2.43，RSD分別為6.2%、7.2%、47.3%。以主成分綜合得分為指標(biāo)進(jìn)行聚類分析，結(jié)果（圖略）與含量聚類分析結(jié)果基本一致。

3 討論

3.1 測定方法的選擇

膽酸、豬去氧膽酸和?；悄懰徕c均為甾體類化合物，紫外吸收為末端吸收，使用常規(guī)的紫外檢測器難以取得理想效果[6]。也有學(xué)者采用蒸發(fā)光散射檢測器[7]或者衍生化方法[8]對其進(jìn)行檢測，但蒸發(fā)光散射檢測器靈敏度相對較差，在待測成分含量較低時(shí)表現(xiàn)不佳，且待測成分的峰純度無法考證，而衍生化方法的操作較繁瑣。八寶驚風(fēng)散處方藥味復(fù)雜，人工牛黃處方量小，基質(zhì)干擾嚴(yán)重，筆者前期嘗試采用普通液相色譜法進(jìn)行分析，未能成功。因此，本研究采用靈敏度和選擇性均更高的超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行測定。

3.2 色譜條件及質(zhì)譜條件的確定

本課題組前期考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液、甲醇-10 mmol/L乙酸銨溶液4個(gè)溶劑系統(tǒng)，結(jié)果表明，水相采用純水或乙酸銨溶液，有機(jī)相采用甲醇或乙腈對分離的影響均不大；考慮到乙腈柱壓更小，添加乙酸銨與否對分離及靈敏度無影響，故最終選用了乙腈-水作為流動(dòng)相。本課題組還考察了等度和梯度洗脫的區(qū)別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，梯度洗脫峰形較好，且梯度洗脫對樣品中吸附在色譜柱上的強(qiáng)保留雜質(zhì)有較好的洗脫作用，有利于延長色譜柱的壽命。因膽汁酸類成分含有羧基，易形成負(fù)離子，因此質(zhì)譜離子源采用了負(fù)離子模式電離。本課題組還比較了單四極桿模式及多反應(yīng)監(jiān)測模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膽酸、豬去氧膽酸、?；悄懰徕c的分子離子均有較大響應(yīng)，但采用多反應(yīng)監(jiān)測模式的二級碎片離子響應(yīng)較小。為了使建立的方法更加靈敏，本研究選用了單四極桿模式。

3.3 提取方法的考察

本課題組前期比較了甲醇直接提取和樣品加稀鹽酸酸化后再以氯仿提取兩種提取方法，結(jié)果表明，兩種方法均能提取出膽汁酸類成分，但酸化后再用氯仿提取的樣品測得值（編號A1樣品中膽酸、豬去氧膽酸、?；悄懰徕c含量分別為1.013、1.230、1.034 mg/g）較甲醇直接提取（見表2樣品A1數(shù)據(jù)）的含量低，且操作復(fù)雜，故本研究選擇用甲醇直接提取。

4 結(jié)語

本研究建立了超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定八寶驚風(fēng)散中膽酸、豬去氧膽酸和?；悄懰徕c含量的方法，該方法線性范圍寬，專屬性和重復(fù)性良好，能夠在15 min內(nèi)快速實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)成分的分離，并能很好地區(qū)分八寶驚風(fēng)散批間及不同廠家之間的差異。3個(gè)廠家樣品之間膽酸、豬去氧膽酸和?；悄懰徕c含量存在一定差異，這可能與廠家所用人工牛黃原料不同和生產(chǎn)工藝存在差異有關(guān)。由于本研究所用的八寶驚風(fēng)散均為市售品，無法取得相應(yīng)批次制劑生產(chǎn)投料的人工牛黃飲片，故僅能通過檢測制劑中3個(gè)膽汁酸類成分的含量間接分析制劑生產(chǎn)工藝的均一性。后續(xù)本課題組將進(jìn)一步收集相關(guān)樣品及人工牛黃飲片，以進(jìn)一步明確不同廠家3個(gè)膽汁酸類成分含量均一性不佳的原因。