韋啟球，高思，馮藝萍，裴世成，劉雪萍 （廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)系，廣西 柳州 545005）

持續(xù)的病理性心臟肥大最終可導(dǎo)致心力衰竭，而病理性心臟肥大的發(fā)生和發(fā)展被認(rèn)為是多種復(fù)雜因素綜合作用的結(jié)果[1]。目前，臨床尚缺乏有效手段來延緩或逆轉(zhuǎn)心臟肥大向心力衰竭進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，在慢性心力衰竭患者和心力衰竭動(dòng)物模型中均存在高水平的氧化應(yīng)激，且氧化應(yīng)激與不良預(yù)后密切相關(guān)[2]。氧化應(yīng)激損傷涉及多方面因素，過氧化物的堆積可直接造成細(xì)胞器損傷及多種功能紊亂，促進(jìn)心肌重構(gòu)和病理性心臟肥大的發(fā)展，并最終引發(fā)心力衰竭[3]。傳統(tǒng)天然藥物在抗腫瘤等領(lǐng)域表現(xiàn)出良好的抗氧化應(yīng)激作用，然而其在心血管相關(guān)疾病中的價(jià)值尚有待發(fā)掘；同時(shí)，在心臟肥大機(jī)制和有效治療方法研究領(lǐng)域中，揭示氧化應(yīng)激在心臟肥大發(fā)展中的作用機(jī)制、尋找有效的天然藥物等也備受學(xué)者關(guān)注。

芒果苷為雙苯吡酮類化合物，主要從芒果葉中提取而得，具有顯著的抗氧化、抗炎作用，且因具有良好的成藥性而被廣泛用于改善咳嗽、咳痰等呼吸系統(tǒng)癥狀[4—5]。研究指出，芒果苷可通過激活核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/抗氧化響應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）通路、促進(jìn)抗氧化酶表達(dá)等途徑來改善多種原因造成的氧化應(yīng)激損傷[6—7]。有研究指出，活化T細(xì)胞核因子c4（nuclear factor of activated T cells cytoplasmic 4，NFATc4）是促進(jìn)心臟肥大的重要轉(zhuǎn)錄因子，其被激活后可結(jié)合到心房鈉尿肽（atrial natriuretic factor，ANF）、B型利尿鈉肽（B-type natriuretic peptide，BNP）的啟動(dòng)子上，從而促進(jìn)肥大基因的表達(dá)[8]。同時(shí)多項(xiàng)研究證實(shí)，NFATc4在誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和促進(jìn)細(xì)胞凋亡中也具有重要作用[9]。本研究擬以大鼠H9c2細(xì)胞為對(duì)象，以過氧化氫（H2O2）為誘導(dǎo)劑[10]，通過檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白、活性氧（reactive oxygen species，ROS）和抗氧化酶活性的變化，探討芒果苷對(duì)H2O2致氧化應(yīng)激的影響，并初步考察該作用是否與NFATc4有關(guān)，以期為證實(shí)芒果苷改善氧化應(yīng)激的潛能提供依據(jù)，為心臟肥大的治療挖掘新靶點(diǎn)、提供新思路。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括3111型細(xì)胞培養(yǎng)箱、Model-450型酶標(biāo)儀、Multiskan MK3型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），Power/Pac300型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、Trans-Blot SD型轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad公司），Image Quant 800型凝膠電泳成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Cytiva公司）等。

1.2 主要藥品及試劑

芒果苷原料藥（批號(hào)20220203，純度98%）購(gòu)自南寧維康醫(yī)藥科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)8122609）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；胎牛血清、CCK-8試劑、Lipo8000轉(zhuǎn)染試劑、ROS檢測(cè)試劑盒[含2，7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）探針]、兔源B細(xì)胞淋巴瘤2（B cell lymphoma 2，Bcl-2）多克隆抗體和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗、羊抗兔IgG二抗（貨號(hào)/批號(hào)分別為C0232、C0041、C0533、S0033S、AB112、A0192、A0239）均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)分別為A001-1-2、A007-1-1、A003-1-2）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；兔源Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、剪切的胱天蛋白酶3（cleaved caspase-3）多克隆抗體（批號(hào)分別為2772S、9661S）均購(gòu)自美國(guó)CST公司；鼠源NFATc4多克隆抗體（批號(hào)sc-271597）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；鼠源微管蛋白（tubulin）單克隆抗體、兔源核纖層蛋白B1（lamin B1）多克隆抗體（批號(hào)分別為T6199、SAB2101352）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.3 細(xì)胞株

大鼠心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

取H9c2細(xì)胞，復(fù)蘇后培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，待融合至80%左右進(jìn)行傳代；將傳代后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中；待融合至80%左右時(shí)，將培養(yǎng)基替換為含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞相對(duì)存活率檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按6×103個(gè)/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞貼壁后，將其分為空白組、H2O2組和芒果苷50、100、150 μmol/L組（濃度參考相關(guān)文獻(xiàn)[11]和本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。各藥物組經(jīng)不同濃度芒果苷作用12 h后，再與H2O2組一同經(jīng)H2O2（200 μmol/L，濃度參考相關(guān)文獻(xiàn)[12]和本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置）刺激12 h；隨后，每孔加入CCK-8試劑10 μL和DMEM培養(yǎng)基90 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，使用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度（optical density，OD）值，并按下式計(jì)算各組細(xì)胞的相對(duì)存活率：相對(duì)存活率＝實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞OD值/空白組OD值×100%。

2.3 細(xì)胞上清液中SOD、CAT、MDA水平檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按5×103個(gè)/孔接種于96孔板中，設(shè)空白組、H2O2組和芒果苷50、100、150 μmol/L組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞按“2.2”項(xiàng)下方法處理。收集各組細(xì)胞上清液，于4 ℃下以3 000 r/min離心10 min，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中SOD、CAT、MDA的水平。操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行。

2.4 細(xì)胞ROS水平檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按5×103個(gè)/孔接種于96孔板中，設(shè)空白組、H2O2組和芒果苷50、100、150 μmol/L組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞按“2.2”項(xiàng)下方法處理。收集細(xì)胞，在含10 μmol/L DCFH-DA探針的無血清DMEM培養(yǎng)基中孵育20 min，用磷酸鹽緩沖液清洗3次，使用酶標(biāo)儀于激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)525 nm下檢測(cè)各孔的熒光強(qiáng)度，用以表示ROS水平（結(jié)果以空白組為標(biāo)準(zhǔn)作歸一化處理）。

2.5 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和核蛋白NFATc4表達(dá)的檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按1×104個(gè)/孔接種于6孔板中，設(shè)空白組、H2O2組和芒果苷50、100、150 μmol/L組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞按“2.2”項(xiàng)下方法處理。收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液，提取總蛋白。測(cè)定蛋白濃度后，加入5×蛋白上樣緩沖液，并在100 ℃下煮沸5 min變性。取變性后的蛋白樣品適量，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)膜、封閉；洗膜后，分別加入Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、NFATc4、tubulin、lamin B1一抗（稀釋度均為1∶1 000），于4 ℃下孵育過夜；洗膜后，加入相應(yīng)二抗（稀釋度均為1∶5 000），于室溫下孵育1 h；洗膜后，以ECL發(fā)光液顯色并使用凝膠電泳成像分析系統(tǒng)成像。采用GraphPad Prism 5.0軟件計(jì)算Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3與內(nèi)參tubulin以及核蛋白NFATc4與內(nèi)參lamin B1的灰度值比值，用以表示上述蛋白的相對(duì)表達(dá)量（結(jié)果以空白組為標(biāo)準(zhǔn)作歸一化處理）。

2.6 NFATc4對(duì)H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡相關(guān)指標(biāo)的影響檢測(cè)

本研究通過干擾NFATc4蛋白的表達(dá)并檢測(cè)H9c2細(xì)胞中氧化應(yīng)激指標(biāo)和凋亡相關(guān)蛋白的變化來評(píng)價(jià)NFATc4蛋白對(duì)上述指標(biāo)的影響。NFATc4干擾序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)，上、下游序列分別為5'-GGAGUCUGAACUUAAUGAATT-3'、5'-UUCAUUAAGUUCAGACUCCTT-3'。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，設(shè)空白組、H2O2組、siNFATc4組、H2O2+siNFATc4組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。參照轉(zhuǎn)染試劑使用說明書，將Lipo8000轉(zhuǎn)染試劑4 μL、干擾序列100 pmol和無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)基125 μL混合，加入至siNFATc4組、H2O2+siNFATc4組細(xì)胞中，再用含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基補(bǔ)足至2 mL；其余組不加入干擾序列，處理方法同前。各組細(xì)胞培養(yǎng)36 h后，H2O2組和H2O2+siNFATc4組細(xì)胞用H2O2（200 μmol/L）刺激12 h。隨后，收集空白組和siNFATc4組細(xì)胞，按“2.5”項(xiàng)下方法檢測(cè)其核蛋白NFATc4的表達(dá)情況，以評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效果；收集各組上清液和細(xì)胞，分別按“2.3”～“2.5”項(xiàng)下方法檢測(cè)SOD、CAT、MDA、ROS水平和Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)情況，以評(píng)價(jià)干擾NFATc4蛋白表達(dá)對(duì)上述指標(biāo)的影響。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 芒果苷對(duì)H9c2細(xì)胞相對(duì)存活率的影響

與空白組比較，H2O2組細(xì)胞的相對(duì)存活率顯著降低（P＜0.05）；與H2O2組比較，芒果苷100、150 μmol/L組細(xì)胞的相對(duì)存活率均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 芒果苷對(duì)H9c2細(xì)胞相對(duì)存活率和氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響（±s）

表1 芒果苷對(duì)H9c2細(xì)胞相對(duì)存活率和氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響（±s）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與空白組比較，P＜0.01；c：與H2O2組比較，P＜0.05。

組別空白組H2O2組芒果苷50 μmol/L組芒果苷100 μmol/L組芒果苷150 μmol/L組相對(duì)存活率（n＝3）/%100.00±0.03 50.12±0.53a 53.17±1.13 79.08±1.03c 94.67±0.87c SOD（n＝4）/（U/mg）30.21±1.33 14.07±0.87b 17.21±1.02 20.05±1.14c 23.07±1.29c CAT（n＝4）/（U/mg）33.04±2.15 12.10±1.38b 15.03±1.92 21.17±2.05c 25.78±3.01c MDA（n＝4）/（nmol/mg）8.51±1.20 24.32±4.39b 20.08±2.15 18.54±1.97c 14.07±2.01c ROS（n＝4）1.00±0.03 4.55±0.40b 4.14±0.22 3.03±0.22c 1.97±0.17 c

3.2 芒果苷對(duì)H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

與空白組比較，H2O2組細(xì)胞的SOD、CAT水平均顯著降低，MDA、ROS水平均顯著升高（P＜0.01）。與H2O2組比較，芒果苷100、150 μmol/L組細(xì)胞的SOD、CAT水平均顯著升高，MDA、ROS水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

3.3 芒果苷對(duì)H9c2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和核蛋白NFATc4表達(dá)的影響

與空白組比較，H2O2組細(xì)胞中Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，Bax、cleaved caspase-3和核蛋白NFATc4的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05）。與H2O2組比較，芒果苷100、150 μmol/L組細(xì)胞中Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，Bax、cleaved caspase-3和核蛋白NFATc4的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖1、表2。

圖1 芒果苷對(duì)H9c2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和核蛋白NFATc4表達(dá)影響的電泳圖

表2 芒果苷對(duì)H9c2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和核蛋白NFATc4表達(dá)的影響（±s，n＝3）

表2 芒果苷對(duì)H9c2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和核蛋白NFATc4表達(dá)的影響（±s，n＝3）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與H2O2組比較，P＜0.05。

組別空白組H2O2組芒果苷50 μmol/L組芒果苷100 μmol/L組芒果苷150 μmol/L組NFATc4/lamin B1 1.00±0.03 2.67±0.17a 2.41±0.32 1.55±0.14b 1.27±0.19b Bcl-2/tubulin 1.00±0.03 0.31±0.05a 0.42±0.11 0.75±0.14b 0.87±0.09b Bax/tubulin 1.00±0.04 2.73±0.18a 2.36±0.32 1.37±0.13b 1.18±0.11b cleaved caspase-3/tubulin 1.00±0.02 2.59±0.19a 2.28±0.15 1.84±0.17b 1.37±0.12b

3.4 NFATc4對(duì)H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡相關(guān)指標(biāo)的影響

3.4.1 細(xì)胞核蛋白NFATc4表達(dá)的變化

干擾核蛋白NFATc4的表達(dá)后，細(xì)胞核內(nèi)該蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01）。結(jié)果見圖2。

圖2 干擾NFATc4后細(xì)胞核蛋白NFATc4表達(dá)水平變化

3.4.2 細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化

與空白組比較，H2O2組細(xì)胞SOD、CAT水平均顯著降低，MDA、ROS水平均顯著升高（P＜0.05），而siNFATc4組細(xì)胞的上述指標(biāo)均并無明顯變化（P＞0.05）；與H2O2組比較，H2O2+siNFATc4組細(xì)胞SOD、CAT水平均顯著升高，MDA、ROS水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

表3 干擾核蛋白NFATc4表達(dá)對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響（±s，n＝3）

表3 干擾核蛋白NFATc4表達(dá)對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響（±s，n＝3）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與H2O2組比較，P＜0.05。

組別空白組H2O2組siNFATc4組H2O2+siNFATc4組ROS 1.00±0.03 4.54±0.27a 1.00±0.06 2.03±0.22b SOD/（U/mg）28.56±1.17 13.24±0.71a 27.39±1.23 20.05±1.14b CAT/（U/mg）35.18±2.37 13.29±1.16a 33.26±2.89 25.97±2.32b MDA/（nmol/mg）9.16±1.17 23.45±3.48a 22.52±2.19 16.63±1.11b

3.4.3 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化

與空白組比較，H2O2組細(xì)胞Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，Bax、cleaved caspase-3的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05），siNFATc4組細(xì)胞的上述指標(biāo)均并無明顯變化（P＞0.05）；與H2O2組比較，H2O2+siNFATc4組細(xì)胞Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，Bax、cleaved caspase-3的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖3、表4。

表4 干擾核蛋白NFATc4表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）

表4 干擾核蛋白NFATc4表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與H2O2組比較，P＜0.05。

組別空白組H2O2組siNFATc4組H2O2+siNFATc4組cleaved caspase-3/tubulin 1.00±0.04 2.65±0.29a 1.08±0.11 1.75±0.18b Bcl-2/tubulin 1.00±0.03 0.47±0.07a 0.98±0.08 0.77±1.14b Bax/tubulin 1.00±0.05 2.87±0.37a 0.96±0.12 1.35±0.17b

4 討論

氧化應(yīng)激在包括缺血/再灌注損傷、心臟肥大和心力衰竭等在內(nèi)的心腦血管疾病中起重要作用，過氧化物的水平是衡量氧化應(yīng)激嚴(yán)重程度的重要因素，清除過氧化物對(duì)改善心腦血管疾病具有重要意義[13]。ROS、MDA等過氧化物是氧化應(yīng)激導(dǎo)致心肌損傷的重要介質(zhì)；相反，抗氧化酶SOD、CAT則可通過清除過氧化物、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)等方式來緩解氧化應(yīng)激、減少心肌損傷，是部分藥物改善心腦血管疾病的重要途徑[14]。H2O2是氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要產(chǎn)物，常被用作體外氧化應(yīng)激損傷的誘導(dǎo)劑，可激活線粒體凋亡途徑而使存活細(xì)胞明顯減少[10]。本研究結(jié)果顯示，在H2O2的刺激下，H9c2細(xì)胞的MDA、ROS水平均顯著升高，SOD、CAT水平則顯著下降；100、150 μmol/L的芒果苷能顯著增強(qiáng)細(xì)胞中SOD、CAT活性，有效抑制ROS的生成并降低MDA水平；同時(shí)，100、150 μmol/L的芒果苷還可使H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞的相對(duì)存活率顯著升高，提示芒果苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激有一定的抑制作用，這與已有研究結(jié)果基本一致[15]。

心力衰竭是多種心臟疾病的終末階段，心肌細(xì)胞丟失在促進(jìn)心力衰竭發(fā)展中起重要作用，而氧化應(yīng)激導(dǎo)致的凋亡是造成心肌細(xì)胞丟失的重要原因[16]。研究指出，凋亡相關(guān)蛋白參與了不同途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程：Bcl-2能與Bax和其他凋亡蛋白結(jié)合，Bcl-2表達(dá)減少和Bax表達(dá)增加是線粒體穩(wěn)態(tài)失衡的主要標(biāo)志，可反映出細(xì)胞凋亡水平的明顯升高[17]；通常情況下，Bcl-2/Bax比例的下降可導(dǎo)致caspase-3活化，活化的caspase-3（即cleaved caspase-3）進(jìn)入細(xì)胞核后可激活核酸內(nèi)切酶，導(dǎo)致DNA斷裂，最終促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生[18—19]。為此，本研究檢測(cè)了芒果苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，在H2O2刺激下，細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)顯著下調(diào)，而促凋亡蛋白Bax的表達(dá)則顯著上調(diào)，cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)亦顯著升高；經(jīng)100、150 μmol/L的芒果苷干預(yù)后，上述蛋白的表達(dá)均被逆轉(zhuǎn)，表明細(xì)胞凋亡被芒果苷抑制。這提示芒果苷抗H2O2致細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用可能是通過提高抗凋亡蛋白水平、降低促凋亡蛋白水平，從而抑制細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的。

NFATc4是重要的轉(zhuǎn)錄因子，在被鈣調(diào)磷酸酶激活后轉(zhuǎn)位入核，參與促進(jìn)肥大基因、炎癥相關(guān)因子表達(dá)并促進(jìn)氧化應(yīng)激、線粒體生成等多種生理病理過程[20]。研究指出，除調(diào)節(jié)肥大基因表達(dá)等經(jīng)典功能外，NFATc4還可通過多種途徑參與凋亡過程，包括提高腫瘤壞死因子α水平、促進(jìn)凋亡蛋白表達(dá)等[21]。本研究結(jié)果顯示，在H2O2作用下，核蛋白NFATc4的表達(dá)顯著上調(diào)并伴有過氧化物ROS、MDA水平的升高，抗氧化酶SOD、CAT水平的下降和促凋亡蛋白Bax表達(dá)的增加；經(jīng)100、150 μmol/L的芒果苷干預(yù)后，細(xì)胞中上述指標(biāo)的分泌/表達(dá)均被逆轉(zhuǎn)。

RNA干擾是改變蛋白表達(dá)的重要方式，本研究通過轉(zhuǎn)染干擾序列干擾NFATc4的表達(dá)，結(jié)果顯示，核蛋白NFATc4的表達(dá)明顯下調(diào)，提示轉(zhuǎn)染成功；經(jīng)H2O2刺激后，H2O2+siNFATc4組細(xì)胞的ROS、MDA水平和Bax、cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)均顯著降低/下調(diào)，SOD、CAT水平和Bcl-2蛋白的表達(dá)均顯著升高/上調(diào)，提示NFATc4蛋白的核內(nèi)水平與H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。結(jié)合前文結(jié)果，芒果苷能顯著抑制NFATc4蛋白入核，這一作用可能是該成分改善H2O2致細(xì)胞氧化應(yīng)激水平和減少凋亡的基礎(chǔ)，但上述結(jié)論尚需進(jìn)一步研究予以驗(yàn)證。

綜上所述，芒果苷能夠減輕H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激，減少細(xì)胞凋亡，抑制NFATc4蛋白入核，進(jìn)而緩解心肌細(xì)胞損傷；降低NFATc4蛋白的核內(nèi)水平與減少H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡有關(guān)。芒果苷對(duì)心肌細(xì)胞具有良好的保護(hù)作用，在改善心臟疾病領(lǐng)域可能具有進(jìn)一步開發(fā)的潛力。