張錦宏 李 亮 鄧勛偉 朱文標(biāo) 王秋明 張裕諾 張 茹

廣東省梅州市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)三科 514031

乳腺癌屬于女性群體比較常見的一類惡性腫瘤,主要癥狀為乳頭和乳暈位置異常、乳腺腫塊以及腋窩內(nèi)淋巴結(jié)腫大等。等到癌細(xì)胞脫落之后,能經(jīng)淋巴液和血液等分布至全身,導(dǎo)致疾病轉(zhuǎn)移,對患者的生命安全產(chǎn)生嚴(yán)重影響。乳腺癌結(jié)合不同分子亞型能劃分成Luminal A 型、Luminal B 型、Her-2過表達(dá)型和Basal-like型幾種,不同亞型的治療方式和預(yù)后存在差異[1]。乳腺癌易感基因1/2(BRCA1/2)屬于兩類最主要的疾病易感基因,其中BRCA1處在染色體17q21中,包含編碼外顯子22個以及非編碼外顯子2個,是1 863個氨基酸構(gòu)成;BRCA2處在染色體13q12中,包含外顯子27個,是3 418個氨基酸構(gòu)成[2]。當(dāng)前已經(jīng)檢出BRCA1/2致病基因突變涉及3 000余種,分布在整個編碼區(qū)內(nèi),同時一定程度促進(jìn)截短蛋白產(chǎn)生,造成BRCA1/2蛋白質(zhì)有關(guān)功能缺失,從而使得攜帶BRCA1/2突變基因者患乳腺癌概率較正常人群升高[3]。在梅州地區(qū),乳腺癌發(fā)病率逐年上升,為研究梅州地區(qū)乳腺癌發(fā)病風(fēng)險因素,本文現(xiàn)對本院經(jīng)病理檢查確診的初治乳腺癌患者300例開展研究,分析BRCA1/2基因突變和梅州地區(qū)女性乳腺癌亞型的關(guān)系,旨在為乳腺癌的精準(zhǔn)分層治療帶來新方案,給進(jìn)一步研究和開發(fā)治療藥物提供參考依據(jù),具體內(nèi)容如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2019年12月—2021年12月本院經(jīng)病理檢查確診的初治乳腺癌患者300例,結(jié)合病理組織學(xué)、免疫組化染色(IHC)以及熒光原位雜交技術(shù)(FISH)開展準(zhǔn)確分型,包含Luminal A型90例、Luminal B型72例、Her-2過表達(dá)型70例和Basal-like型68例。Luminal A 型組年齡40～70歲,平均年齡(56.32±4.68)歲;腫瘤直徑0.8～4.0cm,平均直徑(2.20±0.45)cm。Luminal B型組年齡38～72歲,平均年齡(55.85±4.24)歲;腫瘤直徑0.6～4.2cm,平均直徑(2.25±0.38)cm;Her-2過表達(dá)型組年齡40～75歲,平均年齡(56.10±4.18)歲;腫瘤直徑0.6～4.0cm,平均直徑(2.32±0.35)cm;Basal-like型組年齡41～78歲,平均年齡(56.28±4.34)歲;腫瘤直徑0.8～4.5cm,平均直徑(2.30±0.42)cm。各組一般資料相比無顯著差異(P>0.05),可對比分析。本研究得到院內(nèi)倫理委員會通過,同時取得患者知情同意。

1.2 選擇標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):(1)均結(jié)合病理學(xué)檢查確診是乳腺癌;(2)有準(zhǔn)確的乳腺癌分型;(3)依從性良好,可配合完成檢測。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)肝、腎、心等主要臟器有器質(zhì)性病變者;(2)血液系統(tǒng)有疾病者;(3)存在認(rèn)知障礙、心理疾病或者精神病者;(4)存在其他惡性腫瘤者;(5)拒絕或者中途退出研究者。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集。所有患者均收集外周血液2ml以上放入到EDTA抗凝管中,采集結(jié)束后,將采血試管輕輕顛倒4次,后及時放置采血管到4℃冰箱中保存待測,在2d內(nèi)送往醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,再集中送到北京博奧醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所檢測。

1.3.2 BRCA1/2基因突變檢測。對BRCA1/2基因全編碼區(qū)及編碼區(qū)上下游20bp內(nèi)含子區(qū)進(jìn)行高通量測序,檢測受檢者兩基因的突變情況。(1)DNA提取:嚴(yán)格依據(jù)DNA提取試劑盒操作說明對受檢者DNA開展提取處理,經(jīng)紫外分光光度計對DNA濃度和純度展開測定,放在-20℃冰箱中保存。(2)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增:參考文獻(xiàn)[4],進(jìn)行BRCA1有關(guān)第2號、第10號、第18號以及第20號外顯子,BRCA2第10號、第11號外顯子有關(guān)DNA序列引物設(shè)計,對于BRCA1/2基因全編碼區(qū)及編碼區(qū)上下游20bp內(nèi)含子區(qū)開展PCR擴(kuò)增處理。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下:總反應(yīng)體系是30μl,包含0.6μg的DNA樣品,0.6μl 10mmol/L的dNTP Mix;3μl的10×Pfu緩沖液;2.5U/μl的Pfu聚合酶;上游和下游引物(10μmol/L)分別0.6μl,最終的濃度是0.33μmol/L,采取ddH2O2降反應(yīng)體系補(bǔ)充到30μl。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件如下:在95℃環(huán)境下開展5min預(yù)變性處理,在95℃環(huán)境下進(jìn)行30s變性處理,在57℃環(huán)境下進(jìn)行30s退火,在72℃環(huán)境下進(jìn)行60s延伸。結(jié)束40個循環(huán)后在72℃環(huán)境下進(jìn)行5min延伸,放在4℃環(huán)境下進(jìn)行保存,開展電泳鑒定。(3)測序和數(shù)據(jù)分析:選擇ABI 3730自動測序儀器開展測序處理。選擇DANAMAN6.0軟件開展序列比較,選擇Chromas Pro 2.33開展圖譜比較,具體的核酸編碼依據(jù)NCBI序列BRCA1、BRCA2開展比較,突變位點(diǎn)結(jié)合NCBI dbSNP和BIC、HGMD、Clinvar以及Universal Mutation database開展比較,明確是否屬于新型突變。(4)結(jié)果判斷:結(jié)合美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會有關(guān)遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)和指南[5]評估突變結(jié)果,將突變致病性劃分成致病、可能致病、意義不明、可能良性以及良性幾種,其中致病、可能致病歸納到突變的范圍內(nèi),余下歸納到非突變的范圍內(nèi)。

1.4 觀察指標(biāo) 觀察和比較不同乳腺癌亞型患者的BRCA1/2基因突變率?；蛲蛔兟?致病、可能致病數(shù)/總數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 不同乳腺癌亞型患者的BRCA1基因檢測結(jié)果 不同乳腺癌亞型組BRCA1基因突變率相比差異顯著(χ2=10.354,P=0.001),Basal-like型組的BRCA1基因突變率高于其他分型組(P<0.05),Luminal B型、Her-2過表達(dá)型組的BRCA1基因突變率高于Luminal A型組(P<0.05),Luminal B型、Her-2過表達(dá)型組相比無顯著差異(P>0.05),見表1。

表1 不同乳腺癌亞型患者的BRCA1基因檢測結(jié)果[n(%)]

2.2 不同乳腺癌亞型患者的BRCA2基因檢測結(jié)果 不同乳腺癌亞型組BRCA2基因突變率相比差異顯著(χ2=9.325,P=0.001),Basal-like型組的BRCA2基因突變率高于其他分型組(P<0.05),Luminal B型、Her-2過表達(dá)型組的BRCA2基因突變率高于Luminal A型組(P<0.05),Luminal B型、Her-2過表達(dá)型組相比無顯著差異(P>0.05),見表2。

3 討論

當(dāng)前,乳腺癌患病因素暫未完全確定,雌激素長期影響、環(huán)境因素和家族遺傳性等均和疾病出現(xiàn)存在緊密聯(lián)系[6]。伴隨人們工作和生活節(jié)奏加快,再加上生活方式轉(zhuǎn)變和生活環(huán)境惡化等因素影響,乳腺癌患病率也在不斷升高,且發(fā)病人群呈現(xiàn)年輕化趨勢[5]。乳腺癌主要包含散發(fā)性、遺傳性兩種類型,其中后者和高顯性疾病有關(guān)易感基因缺陷存在關(guān)聯(lián),于乳腺癌中占比5%～10%[7]。BRCA1、BRCA2均屬于抑癌基因,參加細(xì)胞周期的調(diào)控過程、DNA損傷修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞凋亡等活動,屬于保持基因組穩(wěn)定性的主要部分,當(dāng)產(chǎn)生基因變異或者缺失之后,染色體的穩(wěn)定性會受到影響,同時導(dǎo)致惡變[8]。若BRCA1/2基因結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化,其具備的腫瘤發(fā)生抑制功能會相應(yīng)降低[9]。擁有BRCA1/2基因突變有關(guān)家族傾向者的乳腺癌風(fēng)險更高,多出現(xiàn)于較年輕的階段,患者雙側(cè)乳房均能發(fā)病,同時存在卵巢癌[10]。

當(dāng)前國內(nèi)已有較多大型醫(yī)院進(jìn)行BRCA基因檢測,但有關(guān)BRCA1/2基因突變和乳腺癌亞型之間的關(guān)系鮮有報道。當(dāng)前暫無BRCA1/2基因檢測標(biāo)準(zhǔn)指南,無論如何,若家族成員內(nèi)存在有害BRCA基因突變情況,或自身乳腺癌或者卵巢癌風(fēng)險升高,就需要考慮潛在性風(fēng)險并可能需開展BRCA1/2基因測試[11]。梅州地區(qū)暫無有關(guān)研究報道。本次研究發(fā)現(xiàn):梅州地區(qū)乳腺癌患者中Basal-like型組的BRCA1、BRCA2基因突變率高于其他分型組(P<0.05),Luminal B型、Her-2過表達(dá)型組的BRCA1、BRCA2基因突變率高于Luminal A型組(P<0.05),這提示BRCA1、BRCA2基因突變在Basal-like型的乳腺癌患者中最為多見,其次是Her-2過表達(dá)型以及Luminal B型,而Luminal A的BRCA1、BRCA2基因突變較為少見。因此,臨床對于Basal-like型、Her-2過表達(dá)型以及Luminal B型的乳腺癌患者需要加強(qiáng)BRCA1/2基因突變檢測,合理選取敏感度較高的化療藥物等開展治療,使患者獲得理想預(yù)后。伴隨生活水平提升以及抗腫瘤意識不斷增強(qiáng),人們對于腫瘤治療要求相應(yīng)升高,結(jié)合本地區(qū)不同分型的乳腺癌患者BRCA1/2基因突變檢測結(jié)果開展精準(zhǔn)醫(yī)療,將藥物基因組學(xué)、藥物遺傳學(xué)有關(guān)研究當(dāng)作基礎(chǔ),結(jié)合患者遺傳背景采取最為理想的個性化治療方案,以最大限度提升其治療效果[12]。

總而言之,梅州地區(qū)Luminal B型、Her-2過表達(dá)型以及Basal-like型乳腺癌患者的BRCA1/2基因突變率較高,尤其是Basal-like型乳腺癌的BRCA1/2基因突變率最高,而Luminal A型乳腺癌的BRCA1/2基因突變率不高,提示BRCA1/2能當(dāng)作本地區(qū)女性乳腺癌治療的重要靶點(diǎn)。