王 瑩 黃鄭雋 翁少煌

1 福建省立醫(yī)院,福建省福州市 350000; 2 福建醫(yī)科大學藥學院

碳量子點(CDs)是利用碳納米管、碳纖維等大尺寸材料或葡萄糖、檸檬酸等小分子物質(zhì)為碳源合成的一種粒徑在10nm之間的新型碳基納米材料[1]。近年來,因碳量子點獨特的物理結(jié)構(gòu)性質(zhì),在生物醫(yī)學領域引起了較為廣泛的關注[2-3]。由于其優(yōu)異的物理化學性質(zhì),如可調(diào)的光致發(fā)光、相對較高的生物相容性、較低的細胞毒性以及優(yōu)異的化學惰性,碳量子點在分析檢測、活體成像、診療劑應用等諸多醫(yī)用領域逐漸展示應用價值[4-5]。同時,碳量子點逐漸廣泛的生物體系應用也引起人們對碳量子點生物安全性的注意。

部分研究發(fā)現(xiàn),具有促細胞生長活性的碳量子點可影響環(huán)境動態(tài)平衡[6],而且一些高濃度的特定來源碳量子點具有誘導細胞DNA損傷等生物毒性[7-8]。隨著碳量子點的廣泛應用,由于碳量子點的良好水溶性和環(huán)境循環(huán),不可避免地發(fā)生部分碳量子點通過生物富集進入生物體內(nèi),從而引發(fā)機體損傷的風險。因此,不僅需要開展體外細胞安全性評價,更需要進行體內(nèi)安全性評價的綜合工作。目前已有的關于碳量子點的安全性評價存在暴露途徑較單一、評價內(nèi)容不全面、不系統(tǒng)等問題。全面系統(tǒng)地評估碳量子點的生物體內(nèi)安全性、深入理解材料與生物系統(tǒng)之間的相互作用是決定碳量子點能否實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化的前提和基礎。因此,本實驗采取兩種不同的給藥途徑開展碳量子點的體內(nèi)安全性評估,為N-CDs的廣泛、深入應用提供初步的免疫安全性評價。希望能夠通過系統(tǒng)地分析碳量子點對免疫系統(tǒng)相關重要指標的影響,認識對免疫系統(tǒng)的可能毒理影響,對于進一步開展其在生物醫(yī)學領域的應用有著重要的研究意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與動物 無水檸檬酸、多乙烯多胺購買自阿拉丁試劑有限公司;谷胱甘肽購買自Sigma-Aldrich 公司;丙酮購買自國藥集團化學有限公司;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、干擾素(IFN-γ)和白細胞介素-1(IL-1)的檢測試劑盒購買自天津安諾瑞康生物技術有限公司。體重為180～200g的SPF級健康SD大鼠64只,雌雄各半,由福建醫(yī)科大學動物實驗中心提供并飼養(yǎng)。動物許可證號:SCXK(閩)2012-0001。

1.2 碳量子點混懸液的制備 氮摻雜碳量子點(N-CDs)的制備方法如下:將含有2.0g檸檬酸(Citric acid,CA)和0.6g谷胱甘肽(Glutathione,GSH)的混合物置于油浴鍋中,加熱至140℃并保持此溫度直至混合物完全熔化,此時混合物的熔融液體顏色為棕褐色。然后將10ml多乙烯多胺加入熔融混合物中,同時升溫至200℃并繼續(xù)反應1h。將所制備的混合熔融物冷卻至室溫,加入丙酮溶解產(chǎn)物。6 000r/min離心10min以獲得沉淀物,并將沉淀物溶解在超純水中。最后,用分子量為2 000kDa的透析袋透析純化72h。

以生理鹽水作分散溶劑,將20mg/ml的N-CDs混懸液稀釋成不同濃度,配置低(2.5mg/ml)、中(5.0mg/ml)、高(10.0mg/ml)三個劑量組,備用。

1.3 大鼠給藥 大鼠適應性喂養(yǎng)1周后,按體重隨機分為8組,即仿口服組(空白對照組、N-CDs低、中、高劑量組),尾靜脈注射法組(空白對照組、N-CDs低、中、高劑量組),每組8只。

大鼠喂飼普通飼料,自由攝食和飲水,每周稱重,按體重調(diào)整給藥量。仿口服組中,以灌胃方式給藥,給藥量為10ml/kg,即低劑量組(25mg/kg),中劑量組(50mg/kg)、高劑量組(100mg/kg);尾靜脈注射組中以尾靜脈注射方式給藥,低劑量組(5mg/kg)、中劑量組(10mg/kg)、高劑量組(20mg/kg)?？瞻讓φ战M按體重分別給予相應劑量的生理鹽水。每日染毒1次,連續(xù)染毒8周。

1.4 動物樣品采集 末次給藥24h后,對大鼠進行頸部采血2ml,將血液用低溫高速離心機以5 000r/min離心10min,取血清,置于-80℃冰箱中冷凍保存,備用。取脾、胸腺臟器稱重,記錄,并稱取脾臟約0.3g、胸腺約0.2g,放入研磨機中以60Hz的頻率研磨45～60s,制備勻漿,以4 000g離心力離心5min,取上清,放入-80℃冰箱中,待測。

1.5 整體免疫相關標志物檢測 根據(jù)試劑盒說明,用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)對大鼠外周血清中的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)和白細胞介素-1(IL-1),與胸腺、脾組織中的谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)進行檢測。TNF-α、IFN-γ和IL-1用于考察碳量子點對大鼠外周血細胞因子的影響;GSH、MDA、SOD的含量變化用于考察碳量子點對于胸腺和脾臟的氧化損傷作用。

2 結(jié)果

2.1 N-CDs灌胃對大鼠免疫安全性評價

2.1.1 N-CDs灌胃對大鼠體重的影響。由表1可見,與空白對照組相比,N-CDs不同劑量染毒組的大鼠體重無顯著性差異(P>0.05)。與適應期比較,染毒2周后大鼠體重與適應期大鼠的體重明顯增加(P<0.05);而染毒3周后大鼠體重進一步增加,體重與適應期大鼠的體重有顯著性差異(P<0.01)。

表1 N-CDs灌胃對大鼠體重的影響

2.1.2 N-CDs灌胃對大鼠脾、胸腺臟器系數(shù)的影響。由表2可見,N-CDs低、中、高的灌胃劑量分組大鼠的脾、胸腺兩個主要免疫器官的臟器系數(shù)較空白對照組均未顯示出統(tǒng)計學差異。

表2 N-CDs灌胃對大鼠臟器系數(shù)的影響

2.1.3 N-CDs灌胃對大鼠脾臟氧化損傷的影響。由表3可見,相較于空白對照組,N-CDs高劑量組使大鼠脾臟的GSH濃度顯著下降(P<0.05)。在中劑量下,大鼠脾臟MDA的濃度明顯降低(P<0.05),且N-CDs高劑量組下降更為顯著(P<0.01)。N-CDs不同劑量染毒組大鼠脾臟的SOD濃度與空白對照組相比,均無顯著性差異(P>0.05)。

表3 N-CDs灌胃對大鼠脾臟氧化損傷的影響

2.1.4 N-CDs灌胃對大鼠胸腺氧化損傷的影響。由表4可見,相較于空白對照組,N-CDs各劑量染毒組雖造成GSH、SOD和MDA等指標一定程度降低,但N-CDs各劑量染毒組與空白對照組的氧化損傷指標無顯著性差異(P>0.05),均未對大鼠胸腺造成氧化損傷。

表4 N-CDs灌胃對大鼠胸腺氧化損傷的影響

2.1.5 N-CDs灌胃對大鼠外周血細胞因子的影響。由表5可見,在本研究所設的染毒周期和劑量條件下,N-CDs對大鼠的外周血清細胞因子IL-1、IFN-γ、TNF-α濃度均未造成顯著性改變(P>0.05)。

表5 N-CDs灌胃對大鼠外周血清細胞因子的影響

2.2 N-CDs尾靜脈注射對大鼠免疫安全性評價

2.2.1 N-CDs尾靜脈注射對大鼠體重的影響。由表6可見,各染毒組的大鼠體重與空白對照組比較仍未出現(xiàn)明顯差異(P>0.05),不同分組之間的體重未見顯著性差異且大鼠體重在染毒期間逐漸增長。

表6 N-CDs尾靜脈注射對大鼠體重的影響

2.2.2 N-CDs尾靜脈注射對大鼠胸腺、脾臟器系數(shù)的影響。由表7可見,相較于空白對照組,N-CDs低、中、高劑量組大鼠胸腺的臟器系數(shù)均明顯下降(P<0.01),而大鼠脾臟的臟器系數(shù)明顯增大(P<0.01和P<0.05)。

表7 N-CDs尾靜脈注射對大鼠脾、胸腺臟器系數(shù)的影響

2.2.3 N-CDs尾靜脈注射對大鼠胸腺氧化損傷的影響。由表8可見,與空白對照組相比,各劑量組胸腺的GSH和MDA含量均未出現(xiàn)明顯改變;然而,胸腺SOD活力隨N-CDs尾靜脈注劑量的增大而顯示出梯度降低,且與空白對照組均具有顯著性差異。

表8 N-CDs尾靜脈注射對大鼠胸腺氧化損傷的影響

2.2.4 N-CDs尾靜脈注射對大鼠脾臟氧化損傷的影響。由表9可見,各劑量組脾臟GSH和SOD含量相較于空白對照組均無顯著性差異;而脾臟中、高劑量組的MDA含量相比于空白對照組呈顯著性降低(P<0.01和P<0.05)。

表9 N-CDs尾靜脈注射對大鼠脾臟氧化損傷的影響

2.2.5 N-CDs尾靜脈注射對大鼠外周血細胞因子的影響。由表10可見,各劑量組的TNF-α、IFN-γ和IL-1含量較空白對照組的變化均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

表10 N-CDs尾靜脈注射對大鼠外周血細胞因子的影響

3 討論

N-CDs同其他納米材料一樣,具有獨特的量子尺寸效應及理化性質(zhì),且極易進入機體內(nèi),引起一系列生物反應。截至目前,國內(nèi)外現(xiàn)有研究主要關注于其細胞毒性方面,對免疫毒性的研究和闡述較少,且研究結(jié)果存在較大爭議:部分研究表明碳納米材料沒有明顯的毒性作用,而另外的一些研究表明碳納米材料具有明顯的細胞毒性。由于N-CDs的毒性還受環(huán)境、人為處理、暴露途徑等因素的影響,如果僅采取單個給藥途徑的實驗結(jié)論來評價N-CDs免疫毒性的話會存在評價不全面、不系統(tǒng)的問題。因此,本次實驗通過灌胃、尾靜脈注射的方式進一步、系統(tǒng)地考察N-CDs的免疫安全性。

在本次實驗中,分別用灌胃和尾靜脈注射方式對大鼠進行N-CDs染毒后,各染毒組的大鼠體重相對空白組無明顯差異,且在染毒2周后體重仍明顯增長,說明在本次實驗設置劑量下大鼠體重未顯示出N-CDs的毒性作用。

大量研究表明,通過觀察胸腺是否萎縮可用于評價細胞免疫功能的狀態(tài),脾淋巴濾泡的萎縮或脾臟重量的減輕則說明機體的體液免疫功能降低。本次實驗發(fā)現(xiàn),利用灌胃方式染毒N-CDs的大鼠各個劑量組脾、胸腺的臟器系數(shù)幾乎與空白對照組一致,說明N-CDs仿口服對大鼠的細胞免疫和體液免疫功能無明顯作用。采用尾靜脈注射方式染毒的大鼠各個劑量組脾臟和胸腺的臟器系數(shù)較空白對照組均發(fā)生了明顯改變,胸腺系數(shù)下降,脾臟系數(shù)增大。說明胸腺開始出現(xiàn)了明顯的萎縮或退行性改變,而脾臟的增生肥大可能是機體的免疫系統(tǒng)所作出相應的代償性改變。

免疫細胞的脂質(zhì)過氧化標志物MDA、GSH和SOD,參與機體的新陳代謝和免疫系統(tǒng)的調(diào)控過程,如遇到針對免疫系統(tǒng)的毒性攻擊,MDA、GSH和SOD會顯示出相應的異常改變。通過檢測MDA含量可反映染毒大鼠的脾、胸腺臟器的脂質(zhì)過氧化程度,GSH和SOD二者的含量則可作為細胞抗氧化水平的評價指標。本次實驗發(fā)現(xiàn),灌胃方式給藥的大鼠脾臟的組織勻漿中,N-CDs高劑量組的GSH濃度顯著降低,表示在N-CDs給藥濃度為10.0mg/ml時,大鼠細胞發(fā)生氧化反應,處于應激狀態(tài),對自由基的清除能力下降,然而染毒組的SOD濃度與空白對照組相比無明顯差異,N-CDs中、高劑量組的MDA濃度顯著下降,又說明機體脂質(zhì)過氧化的程度減小。在灌胃方式給藥的大鼠胸腺的組織勻漿中,N-CDs染毒組均無明顯差異,說明N-CDs未對大鼠的胸腺造成明顯的氧化性或者其他損傷。

在對大鼠行尾靜脈注射N-CDs后,胸腺的SOD值和脾臟的MDA值均出現(xiàn)了明顯下調(diào),表明胸腺所發(fā)生的萎縮或退行性改變使得機體清除自由基的能力明顯下降,說明靜脈注射N-CDs可以引起局部免疫器官發(fā)生變化。但是由于機體的免疫系統(tǒng)具有整體性,脾臟的代償性增大又使得機體脂質(zhì)過氧化的程度減小,這說明自由基攻擊機體細胞的程度可能在免疫系統(tǒng)的自我平衡中得到緩解。

通過檢測外周血清中的細胞因子含量可反映機體整體的免疫功能。在此次研究所設劑量下,以灌胃和尾靜脈注射方式染毒N-CDs,對大鼠外周血清中的細胞因子IL-1、TNF-α及IFN-γ濃度沒有造成顯著的變化,說明口服和靜脈注射N-CDs均未產(chǎn)生炎癥反應,N-CDs對大鼠整體免疫功能的調(diào)節(jié)作用均無明顯影響。

綜上所述,N-CDs通過灌胃方式給藥進入大鼠機體后,在整體水平上無明顯免疫毒性作用,無炎性作用,具有較高的免疫安全性。但灌胃給藥在濃度較高時,可導致機體的氧化和抗氧化作用調(diào)節(jié)紊亂,對免疫系統(tǒng)特別是脾臟造成一定的氧化損傷。尾靜脈注射N-CDs對大鼠免疫系統(tǒng)的整體水平上沒有明顯影響,雖然個別指標出現(xiàn)異常,但免疫系統(tǒng)似乎又表現(xiàn)出自身的免疫調(diào)節(jié)能力加以維護機體的整體免疫平衡,也證實了N-CDs的免疫安全性。同時,實驗結(jié)果也說明不同給藥途徑N-CDs可引起機體不同的局部免疫器官的變化。