張 良,毛自欣,鄧 珊,嚴(yán)美婷

(1.江西省食品發(fā)酵研究所,江西宜春 336023;2.江西省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證總院食品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院,江西南昌 330001)

青錢柳[Cylocaryapaliurus(Batal.)Iljinskaja]為雙子葉植物綱胡桃目胡桃科青錢柳屬喬木植物,又名搖錢樹(shù)、山麻柳、甜茶樹(shù)等,是現(xiàn)僅存于我國(guó)的冰川四紀(jì)幸存下來(lái)的珍稀樹(shù)種,廣泛分布于我國(guó)南方多個(gè)省份[1-3]。據(jù)《中國(guó)中藥資源志要》記載,青錢柳葉具有一定的清熱、消渴、解毒、消腫等功效[4]。在民間,青錢柳葉被炮制成茶來(lái)飲用,因其茶湯口感甘甜,故被稱為“甜茶”[5]。研究表明,青錢柳中含有多糖、黃酮類物質(zhì)、三萜類物質(zhì)等有機(jī)活性成分,以及硒、鉻、釩、鍺等無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[6-8]。鑒于青錢柳葉具有藥食兼用的功效,青錢柳葉已被國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)批準(zhǔn)為新資源食品原料,青錢柳葉茶獲得了美國(guó)食品藥品管理局、日本厚生省和德國(guó)衛(wèi)生部的認(rèn)可[9]。而作為青錢柳主要活性成分的青錢柳多糖是目前研究的熱點(diǎn),其具有降血糖、降血脂、抗癌、抗氧化等功效[10-11]。

目前,多糖分離純化的方法主要有水提醇沉法、離子交換樹(shù)脂法、凝膠過(guò)濾柱色譜法、親和色譜法等[12-14],但其存在操作復(fù)雜、耗時(shí)耗能等缺點(diǎn)。相對(duì)于傳統(tǒng)的提純方法,超濾膜分離技術(shù)具有操作條件溫和、分離選擇性高、不添加任何化學(xué)試劑、耗能低、成本低和節(jié)能環(huán)保等優(yōu)勢(shì),適用于熱敏性天然活性物質(zhì)的提純,在植物多糖的提純方向有著較好的應(yīng)用[15]。楊亞勇等[16]采用超濾和納濾膜分離技術(shù)提取了發(fā)酵液中的阿卡波糖,最終阿卡波糖的含量高于98.8%,提取率也提高了20%(可達(dá)到62.2%);楊祖金等[17]采用卷式的超濾膜來(lái)分離提純靈芝多糖,在6 kD超濾膜、超濾壓力0.6 MPa、操作溫度45～50 ℃、操作時(shí)間 45 min、提取液質(zhì)量濃度 8.8 mg/mL的條件下,超濾純化后的靈芝多糖含量為73.5%;楊寧等[18]采用10 kD的超濾膜對(duì)仙人掌多糖浸提液進(jìn)行純化濃縮,在超濾壓力0.20 MPa、超濾溫度 25 ℃、料液流量0.04～0.05 L/min、濃縮倍數(shù)5～7倍的最優(yōu)超濾條件下,多糖得率達(dá)到了0.95%。采用超濾膜分離技術(shù)濃縮青錢柳多糖在國(guó)內(nèi)還鮮有報(bào)道。該研究以江西修水縣的青錢柳葉制備的青錢柳發(fā)酵液為原料[19],以超濾膜過(guò)濾時(shí)的膜通量為響應(yīng)指標(biāo),首先用單因素試驗(yàn)及Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出對(duì)響應(yīng)值影響顯著的因素,再進(jìn)一步采用響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)青錢柳多糖超濾膜濃縮的工藝進(jìn)行了優(yōu)化,為青錢柳多糖的綜合利用提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試材與試劑青錢柳葉,產(chǎn)自江西九江市修水縣;發(fā)酵液,濃度5.0～6.4 g/mL,江西省食品發(fā)酵研究所;苯酚、濃硫酸,均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;無(wú)水葡萄糖標(biāo)品,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備超濾膜,采用復(fù)合膜,膜面積為1 m2,山東濟(jì)南博納有限公司生產(chǎn);0.2 μm 微濾膜,山東濟(jì)南博納有限公司生產(chǎn);BONA-GM-18 超濾膜設(shè)備,山東濟(jì)南博納有限公司生產(chǎn);T2600 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),青島精誠(chéng)儀器設(shè)備有限公司;HH-400 恒溫水浴鍋,上海蘭儀實(shí)業(yè)有限公司;TG-16 高速臺(tái)式離心機(jī),蘇州威爾實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;FA1204電子天平,上海精密科學(xué)儀器有限公司;YDJ-200B恒溫?fù)u床,英檢達(dá)儀器(重慶)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1樣品的制備。樣品采用劉媛潔等[19]工藝條件制備的青錢柳發(fā)酵液(多糖含量為3.34 mg/mL),在8 000 r/min條件下對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行低溫離心20 min,取上清液用0.2 μm微濾膜過(guò)濾,濾過(guò)液用于超濾條件的優(yōu)化。

1.3.2青錢柳多糖超濾濃縮工藝。將青錢柳發(fā)酵離心微濾液稀釋一定比例后裝入超濾設(shè)備。超濾開(kāi)始后截留液會(huì)回到料液罐中,透過(guò)液流到濾液罐中,調(diào)節(jié)料液流量、超濾壓力、超濾溫度、超濾時(shí)間等超濾條件濃縮青錢柳發(fā)酵液。

1.3.3青錢柳多糖濃縮工藝優(yōu)化的超濾膜選擇。在超濾壓力 100 kPa、超濾溫度 45 ℃和超濾時(shí)間 20 min的條件下,采用 200 kD 截留分子量的超濾膜對(duì)青錢柳發(fā)酵液進(jìn)行濃縮過(guò)濾,濾過(guò)液再用 100 kD 截留分子量的超濾膜進(jìn)行超濾,再依次用50和10 kD 截留分子量的超濾膜對(duì)上一級(jí)濾過(guò)液進(jìn)行超濾,測(cè)定超濾中每段截留分子量超濾膜的截留液和濾過(guò)液中青錢柳多糖含量占超濾前青錢柳多糖含量的比例。

1.3.4青錢柳多糖濃縮工藝優(yōu)化的單因素試驗(yàn)。選擇使用50 kD的超濾膜,固定超濾優(yōu)化的單因素試驗(yàn)條件為料液質(zhì)量濃度2.0 g/mL、料液流量20 mL/min、超濾壓力120 kPa、超濾溫度 40 ℃、超濾時(shí)間 20 min。

以青錢柳發(fā)酵液超濾的膜通量為評(píng)價(jià)指標(biāo),依次考察料液質(zhì)量濃度(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/mL)、料液流量(10、15、20、25、30、35、40 mL/min)、超濾壓力(40、60、80、100、120、140、160 kPa)、超濾溫度(20、25、30、35、40、45、50 ℃)和超濾時(shí)間(5、10、15、20、25、30 min)對(duì)青錢柳發(fā)酵液超濾的膜通量的影響。

1.3.5青錢柳多糖濃縮工藝優(yōu)化的響應(yīng)面試驗(yàn)。

1.3.5.1Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以膜通量為響應(yīng)值,選取料液質(zhì)量濃度(X1)、料液流量(X2)、超濾壓力(X3)、超濾溫度(X4)和超濾時(shí)間(X5) 共5個(gè)影響因素,采用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)Plackett-Burman試驗(yàn)來(lái)篩選出對(duì)膜通量影響顯著的因素。Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平

1.3.5.2Box-Behnken試驗(yàn)。以Plackett-Burman試驗(yàn)的結(jié)果來(lái)選擇對(duì)響應(yīng)值膜通量(Y)影響顯著的料液質(zhì)量濃度(A)、超濾壓力(B)和超濾時(shí)間 (C)共3個(gè)因素為自變量進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化,具體試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平

1.3.6分析檢測(cè)。青錢柳多糖含量采用苯酚-硫酸法[19]測(cè)定。

膜通量的計(jì)算如下:

式中:J為膜通量[mL/(m2·min)];V為超濾透過(guò)液的體積(mL);S為超濾膜有效膜面積(m2) ;T為超濾時(shí)間(min)。

1.4 數(shù)據(jù)處理Plackett-Burman和Box-Behnken試驗(yàn)的設(shè)計(jì)采用Design-Expert 8.0.6軟件,數(shù)據(jù)分析采用Design-Expert 8.0.6和SPSS 22軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 青錢柳多糖濃縮工藝優(yōu)化時(shí)超濾膜的選擇從不同截留分子量超濾膜的濾液中青錢柳多糖含量占比(圖1)可以看出,青錢柳發(fā)酵液中青錢柳多糖的分子量多集中在50 kD以上,用 50 kD的超濾膜濃縮青錢柳發(fā)酵液,截留的青錢柳多糖含量占比可以達(dá)到 92.98%。因此,選擇50 kD的超濾膜進(jìn)行青錢柳發(fā)酵液超濾濃縮工藝的優(yōu)化。

圖1 不同分子量截留的青錢柳多糖含量占比Fig.1 The proportion of Cyclocarya paliurus polysaccharides intercepted by different molecular weight

2.2 青錢柳多糖濃縮工藝優(yōu)化的單因素試驗(yàn)

2.2.1料液質(zhì)量濃度對(duì)膜通量的影響。由圖2可知,隨著料液質(zhì)量濃度的增加,青錢柳多糖膜過(guò)濾的膜通量呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢(shì)。當(dāng)膜通量的質(zhì)量濃度達(dá)到2.0 g/mL以上時(shí),膜通量下降速率明顯增大。分析原因可能是隨著料液質(zhì)量濃度的增加,料液中更多的大分子物質(zhì)更快速地聚集在超濾膜的表面,導(dǎo)致目標(biāo)物質(zhì)通過(guò)膜的阻力增加,膜通量降低較明顯[20]。因此,選擇最適料液質(zhì)量濃度為2.0 g/mL。

圖2 料液質(zhì)量濃度對(duì)膜通量的影響Fig.2 Effect of liquid mass concentration on membrane flux

2.2.2料液流量對(duì)膜通量的影響。由圖3可知,料液流量在10～30 mL/min時(shí)隨著料液流量的增加,青錢柳多糖膜過(guò)濾的膜通量呈上升趨勢(shì);當(dāng)料液流量為30 mL/min時(shí),膜通量達(dá)最大值,為8.91 mL/(m2·min);當(dāng)料液流量高于30 mL/min時(shí),膜通量開(kāi)始降低。分析原因可能是提高料液流量不能降低超濾膜的污染,反而在增加料液流量的同時(shí),也增加了膜表面壓力的損失,導(dǎo)致有效壓力減少,膜通量也隨之減少[21]。因此,選擇最適料液流量為30 mL/min。

圖3 料液流量對(duì)膜通量的影響Fig.3 Effect of solid-liquid flow rate on membrane flux

2.2.3超濾壓力對(duì)膜通量的影響。由圖4可知,膜通量在40～120 kPa時(shí),隨著膜通量的增加,青錢柳多糖膜過(guò)濾的膜通量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì);當(dāng)超濾壓力為120 kPa時(shí),膜通量達(dá)最大值,為7.26 mL/(m2·min)。超濾壓力>120 kPa,膜通量逐漸下降。分析原因可能是大分子物質(zhì)在超濾膜的表面積聚,形成凝膠層的厚度和密度均相應(yīng)增加,導(dǎo)致超濾效率降低,膜通量降低[22]。因此選擇最適超濾壓力為120 kPa。

圖4 超濾壓力對(duì)膜通量的影響Fig.4 Effect of ultrafiltration pressure on membrane flux

2.2.4超濾溫度對(duì)膜通量的影響。由圖5可知,隨著超濾溫度的增加,膜通量也呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢(shì)。當(dāng)超濾溫度為40 ℃時(shí),膜通量為7.27 mL/(m2·min)。當(dāng)超濾溫度超過(guò)40 ℃后,膜通量增加的速率在減少。分析原因可能是超濾膜在較高溫度時(shí)會(huì)發(fā)生膨脹導(dǎo)致膜孔徑變小,同時(shí)大分子物質(zhì)吸附也在增加,形成的凝膠層堵塞超濾膜孔,導(dǎo)致超濾速率降低,膜通量相應(yīng)也會(huì)減小[23]。因此,選擇最適的超濾溫度為40 ℃。

圖5 超濾溫度對(duì)膜通量的影響Fig.5 Effect of ultrafiltration temperature on membrane flux

2.2.5超濾時(shí)間對(duì)膜通量的影響。由圖6可知,隨著超濾時(shí)間的增加,膜通量呈逐漸降低的趨勢(shì);當(dāng)超濾時(shí)間為20 min時(shí),膜通量為7.27 mL/(m2·min);當(dāng)超濾時(shí)間超過(guò)20 min時(shí),膜通量下降速率變小。分析原因可能是發(fā)生了料液濃度差極化現(xiàn)象,膜表面的大分子物質(zhì)積聚形成凝膠層,膜的傳質(zhì)阻力增加,導(dǎo)致超濾膜的膜通量降低[24]。因此,選擇最適的超濾時(shí)間為20 min。

圖6 超濾時(shí)間對(duì)膜通量的影響Fig.6 Effect of ultrafiltration time on membrane flux

2.3 青錢柳多糖濃縮工藝優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1Plackett-Burman試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,選取料液質(zhì)量濃度(X1)、料液流量(X2)、超濾壓力(X3)、超濾溫度(X4)和超濾時(shí)間(X5) 共5個(gè)因素進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn),試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3,運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表3中以膜通量(Y)為響應(yīng)指標(biāo)的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析,結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.3.2Box-Behnken試驗(yàn)。在Plackett-Burman試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,固定料液流量為3.0 mL/min,超濾溫度為40 ℃。以青錢柳多糖膜過(guò)濾濃縮工藝的膜通量(Y)為響應(yīng)值,以料液質(zhì)量濃度(A)、超濾壓力(B)和超濾時(shí)間(C)共3個(gè)因素進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)。青錢柳多糖膜過(guò)濾濃縮工藝優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表5,模型的方差分析及結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表6 回歸模型方差分析

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表5的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,獲得膜通量(Y)對(duì)應(yīng)青錢柳多糖膜過(guò)濾濃縮工藝條件中料液質(zhì)量濃度(A)、超濾壓力(B)和超濾時(shí)間(C)的回歸模型二次多項(xiàng)方程為Y=-111.129 0+54.269 0A+1.073 4B+0.756 4C-0.085 3AB+0.043 0AC+0.006 9BC-11.761 0A2-0.004 4B2-0.034 6C2。

各因素交互作用對(duì)青錢柳多糖膜過(guò)濾濃縮工藝膜通量影響的響應(yīng)面見(jiàn)圖7。響應(yīng)曲面的坡度越陡峭對(duì)以膜通量為響應(yīng)值的影響越大[29];響應(yīng)曲面的投影形成的等高線,其越接近橢圓形,料液質(zhì)量濃度(A)、超濾壓力(B)和超濾時(shí)間(C)的交互作用程度則越顯著[30]。由圖7可知,AB和BC的響應(yīng)曲面坡度相對(duì)較陡峭,等高線圖形更接近橢圓形,說(shuō)明AB和BC的交互作用對(duì)青錢柳多糖膜過(guò)濾濃縮工藝膜通量的影響顯著(P<0.05),且存在最大值;AC交互作用對(duì)青錢柳多糖膜過(guò)濾濃縮工藝膜通量的影響不顯著(P>0.05),這與方差分析結(jié)果一致。

圖7 各因素交互作用對(duì)膜通量影響的響應(yīng)面Fig.7 Response surface of effects of interaction between each factor on membrane flux

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)對(duì)回歸模型方程進(jìn)行分析與求解,獲得青錢柳多糖膜過(guò)濾濃縮的最佳工藝條件為料液質(zhì)量濃度1.91 g/mL、超濾壓力123.3 kPa、超濾時(shí)間24.53 min;在此最佳條件下,膜通量的理論值為16.02 mL/(m2·min)。考慮試驗(yàn)的實(shí)際操作性,將最佳工藝條件修正為料液質(zhì)量濃度1.90 g/mL、超濾壓力123.0 kPa、超濾時(shí)間24.00 min。在修正后優(yōu)化條件下,膜通量的實(shí)際值為16.01 mL/(m2·min),與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.06%,說(shuō)明該模型擬合度較好,具有一定的實(shí)際應(yīng)用性。

3 結(jié)論

該研究以膜通量為響應(yīng)指標(biāo),采用單因素試驗(yàn)和Plackett-Burman試驗(yàn)確定了對(duì)響應(yīng)值影響顯著的因素,并結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了青錢柳多糖超濾膜過(guò)濾的工藝條件。最終獲得最佳工藝條件為料液質(zhì)量濃度1.90 g/mL、料液流量3.0 mL/min、超濾壓力123.0 kPa、超濾溫度40 ℃、超濾時(shí)間24.00 min,此時(shí),膜通量為16.01 mL/(m2·min)。該研究為青錢柳多糖系列產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)與生產(chǎn)提供了工藝參考和理論依據(jù),具有一定的實(shí)際應(yīng)用意義。