李婷婷,劉希元,滕 巍,馬 燕,梁 爽,李彥軍*

(1.吉林省蔬菜花卉科學(xué)研究院,吉林長春 130033;2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,吉林長春 130118)

開放式組織培養(yǎng)是指舍棄超凈工作臺與高溫高壓滅菌鍋等設(shè)備的使用,改變傳統(tǒng)消毒滅菌方式,在自然、開放的環(huán)境中進行的植物組織培養(yǎng)[1]。目前已有藍莓[2]、香蕉[3]、魔芋[4]、梅花[5]、紅豆杉[6]等植物開展了開放式組織培養(yǎng)的研究,開放式組織培養(yǎng)應(yīng)用的抑菌劑有抗生素[7-9]、消毒劑[10]、食品添加劑[11-12]、植物提取物[13]等。除添加抑菌劑外,陳澤斌等[2]使用消毒劑對培養(yǎng)瓶浸泡消毒來降低污染率,但并未明確介紹浸泡消毒濃度。

開放式組織培養(yǎng)脫離嚴格的無菌環(huán)境,降低了植物組織培養(yǎng)對設(shè)備的要求,簡化了技術(shù)操作,節(jié)約了能源成本[14],促進了組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用與推廣。

在馬鈴薯開放式組織培養(yǎng)中,使用次氯酸鈉溶液浸泡消毒容器、在培養(yǎng)基中添加抑菌劑的方法代替高溫高壓蒸汽滅菌,不使用高壓滅菌鍋與超凈工作臺,改變了傳統(tǒng)組織培養(yǎng)的消毒方式,但次氯酸鈉浸泡組培容器消毒濃度沒有一定的標(biāo)準參考;培養(yǎng)基中蔗糖的主要作用是為脫毒苗提供碳源,但培養(yǎng)基中蔗糖濃度影響組織培養(yǎng)的污染率[15];培養(yǎng)基中瓊脂的主要作用是支撐固定脫毒苗[16],但瓊脂濃度過低固定效果差,過高則會增加接種操作難度,瓊脂濃度也影響培養(yǎng)基小環(huán)境進而影響到脫毒苗污染率,不經(jīng)過高溫高壓濕熱滅菌能夠減少培養(yǎng)基中成分的損失[17],消毒滅菌方式改變后,綜合考慮各因素之間的相互作用,需要對次氯酸鈉浸泡組培容器消毒濃度、培養(yǎng)基中蔗糖濃度、瓊脂濃度、益培隆濃度進行進一步優(yōu)化試驗。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑長勢基本一致的夏波蒂馬鈴薯脫毒苗,由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院提供。MS培養(yǎng)基、蔗糖、瓊脂、次氯酸鈉、抑菌劑益培隆(A 10 mL/瓶,B 356 mg/瓶)、鹽酸、氫氧化鈉。

1.2 儀器與設(shè)備分析天平、游標(biāo)卡尺、接種用剪子、接種用槍鑷、酒精燈、不銹鋼器具桶、便攜式葉綠素儀、高壓蒸汽滅菌鍋。

1.3 方法

1.3.1培養(yǎng)基配制。使用次氯酸鈉浸泡培養(yǎng)瓶與瓶蓋30 min進行消毒,瀝干水分備用,提前紫外照射實驗室30 min,關(guān)閉紫外燈后使用75%乙醇噴霧消毒滅菌,MS培養(yǎng)基添加蔗糖、瓊脂、抑菌劑益培隆,煮沸1 min后分裝于提前準備好的培養(yǎng)瓶中,分裝后紫外照射15 min不必進行高溫高壓滅菌。抑菌劑益培隆的配制方法:將益培隆B粉末均勻溶解于A溶液中,純凈水定容至100 mL。

1.3.2接種。紫外照射接種室30 min后使用75%乙醇噴霧消毒滅菌,接種前使用75%乙醇棉擦拭接種臺消毒,接種過程中剪子鑷子使用酒精燈灼燒消毒,備用的剪子鑷子浸泡于75%乙醇不銹鋼壺中,不使用超凈工作臺。剪取帶有一個腋芽的脫毒苗莖段接種于培養(yǎng)基上。

1.3.3測量指標(biāo)與方法。培養(yǎng)28 d后觀察白化數(shù)、污染數(shù)、有效生長數(shù),根據(jù)傳統(tǒng)馬鈴薯脫毒苗生長指標(biāo)設(shè)計脫毒苗有效生長植株標(biāo)準,達到有效生長植株標(biāo)準及以上且未發(fā)生污染的脫毒苗記為有效生長數(shù)。測量植株的株高、莖粗、干重、鮮重、葉片葉綠素含量,計數(shù)葉片數(shù)、莖節(jié)數(shù),稱重法計算葉面積,統(tǒng)計白化率、污染率、有效生長率。

白化率=白化數(shù)/總接種數(shù)

污染率=污染瓶數(shù)/總接種瓶數(shù)

有效生長率=有效生長數(shù)/總接種數(shù)

單因素試驗使用DPS處理分析,響應(yīng)面優(yōu)化試驗采用 Design-Expert進行設(shè)計與結(jié)果分析。

有效生長植株標(biāo)準:株高8.70 cm,莖粗0.85 mm,葉片數(shù)7.00個,莖節(jié)數(shù)6.00個,鮮重156.00 mg,葉面積7.00 cm2。

1.3.4單因素及響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計。選擇次氯酸鈉浸泡組培容器消毒濃度、培養(yǎng)基中抑菌劑益培隆添加濃度、蔗糖濃度、瓊脂濃度設(shè)計單因素試驗,每個因素設(shè)計5個水平,3次重復(fù)。固定MS+0.6 mL/L益培隆+10 g/L蔗糖+ 6 g/L瓊脂,pH 5.8,次氯酸鈉浸泡消毒濃度設(shè)計為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%;固定次氯酸鈉浸泡消毒濃度1%、MS+10 g/L蔗糖+ 6 g/L瓊脂,pH 5.8,抑菌劑益培隆濃度設(shè)計為0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL/L;固定次氯酸鈉浸泡消毒濃度1%、MS+0.6 mL/L益培隆+ 6 g/L瓊脂,pH 5.8,蔗糖濃度設(shè)計為0、2.5、5、7.5、10.0 g/L;固定次氯酸鈉浸泡消毒濃度1%、MS+0.6 mL/L益培隆+10 g/L蔗糖,pH 5.8,瓊脂濃度設(shè)計為2、4、6、8、10 g/L。每個處理接種20瓶,每瓶5個莖段,培養(yǎng)28 d后統(tǒng)計各處理有效生長率。

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上使用Design-Expert,以有效生長率作為響應(yīng)指標(biāo),以益培隆濃度(A)、次氯酸鈉浸泡消毒濃度(B)、蔗糖濃度(C)、瓊脂濃度(D)為自變量,設(shè)計4因素5水平優(yōu)化試驗,響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計自變量因素見表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1不同次氯酸鈉消毒濃度對脫毒苗污染率與白化率的影響。由圖1可知,次氯酸鈉浸泡消毒濃度在0～2.0%時,脫毒苗的污染率隨著消毒濃度提高而逐漸下降,在消毒濃度提高至1.5%時,脫毒苗污染率降至10%,在消毒濃度提高至2.0%時,脫毒苗污染率下降為0。

圖1 不同次氯酸鈉濃度對污染率的影響Fig.1 Influence of different hypochlorous acid concentrations on contamination rate

但在次氯酸鈉浸泡消毒濃度為1.5%與2.0%時,脫毒苗在接種后3 d內(nèi)均出現(xiàn)葉片白化現(xiàn)象,白化率分別為13.3%與86.7%,但在葉片白化5～10 d生長點開始萌發(fā)并正常生長。次氯酸鈉以氧化作用與氯化作用達到消毒抑菌的目的,可能因此出現(xiàn)殘留導(dǎo)致葉片白化,生長點的正常萌發(fā)證明2%及以下的次氯酸鈉濃度不致于殺死植株。

2.1.2不同益培隆濃度對組培苗污染率的影響。由圖2可知,抑菌劑益培隆濃度0～0.8 mL/L時,脫毒苗的污染率隨著培養(yǎng)基中添加濃度的提高而降低,在不添加抑菌劑益培隆時污染率最高達60.00%,益培隆濃度為0.4與0.6 mL/L時,污染率降低至10.00%與3.01%,在益培隆處理濃度為0.8 mL/L時脫毒苗污染率最低,達到無污染。

圖2 不同益培隆濃度對污染率的影響Fig.2 Influence of different ipelon concentrations on the pollution rate

2.1.3不同蔗糖濃度對組培苗污染率的影響。由圖3可知,在蔗糖濃度為0～10.0 g/L時,脫毒苗的污染率隨著培養(yǎng)基蔗糖濃度的增加而上升,在培養(yǎng)基蔗糖濃度為10.0 g/L時,污染率最高可達20%。

圖3 不同蔗糖濃度對污染率的影響Fig.3 Effects of different sucrose concentrations on the contamination rate

2.1.4不同瓊脂濃度對組培苗污染率的影響。由圖4可知,在瓊脂濃度為2～4 g/L時,脫毒苗的污染率隨著瓊脂濃度提高逐漸升高,培養(yǎng)基中瓊脂濃度為4 g/L時污染率最高達20%,可能原因為此時培養(yǎng)基呈現(xiàn)“半固態(tài)”,增加了污染率。培養(yǎng)基中瓊脂濃度為2、8與10 g/L時污染率均為0。但在接種過程中發(fā)現(xiàn),10 g/L瓊脂濃度下培養(yǎng)基硬度大,增加了操作難度與成本。

圖4 不同瓊脂濃度對污染率的影響Fig.4 Effects of different agar concentrations on the contamination rate

2.2 開放式組織培養(yǎng)優(yōu)化分析以益培隆濃度(A)、次氯酸鈉浸泡消毒濃度(B)、蔗糖濃度(C)、瓊脂濃度(D)為自變量,以有效生長率作為響應(yīng)指標(biāo),使用Design-Expert設(shè)計4因素5水平Box-Behnken響應(yīng)面試驗,得到有效生長率(R1)的設(shè)計及結(jié)果(表2)。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果

對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合得到有效生長率(R1)對益培隆濃度(A)、次氯酸鈉浸泡消毒濃度(B)、蔗糖濃度(C)、瓊脂濃度(D)的二次多項回歸模型:R1=0.53+1.22A+0.48B+0.10C+0.12D-0.34AB-6.25×10-3AC+0.07AD-0.01BC+0.41CD-1.24A2-0.19B2-5.92×10-3C2-0.016D2。

響應(yīng)面回歸模型方差結(jié)果見表3,該模型回歸方程(P=0.008 4<0.01)極顯著,失擬項(P=0.142 5>0.05)不顯著,表明二次多項模型擬合度較好,模型有意義,響應(yīng)面試驗可以真實充分反映結(jié)果。回歸模型決定系數(shù)R2=0.934 1,表明試驗精確度高,能夠解釋93%的變化。對比4個因素的F,得到各因素對有效生長率的影響從大到小為B(次氯酸鈉)、C(蔗糖)、A(益培隆)、D(瓊脂)。

表3 響應(yīng)面設(shè)計各因素間交互作用與有效生長率方差分析

三維響應(yīng)曲面圖能夠直觀地反映各因素交互作用對有效生長率的影響。由圖5可知,響應(yīng)面曲面越陡,表示因素組合對有效生長率影響越顯著。通過 Design-Expert 對數(shù)據(jù)模型進行擬合分析得到開放式組織培養(yǎng)最佳因素組合:次氯酸鈉浸泡組培容器消毒濃度1.1%,培養(yǎng)基中益培隆濃度0.49 mL/L,蔗糖濃度7.5 g/L,瓊脂濃度6.61 g/L,在此組合下脫毒苗有效生長率為82.57%,采用預(yù)測組合進行驗證試驗,有效生長率為82.50%,與理論值吻合良好,證明預(yù)測組合結(jié)果可靠,預(yù)測組合脫毒苗污染率為0,有一定的實際意義。綜合考慮到實際操作等影響的因素,對優(yōu)化組合結(jié)果進行修正,采用次氯酸鈉浸泡容器消毒濃度1%、培養(yǎng)基中益培隆濃度0.5 mL/L、蔗糖濃度7.5 g/L、瓊脂濃度6.6 g/L,進行驗證試驗,得到脫毒苗有效生長率為85%,接近預(yù)測值,進一步說明修正響應(yīng)面優(yōu)化組合結(jié)果的可靠性;且驗證修正組合下脫毒苗無污染,有一定的實際意義。

圖5 各因素交互作用響應(yīng)曲面圖Fig.5 Response surface diagram of the interaction of various factors

3 結(jié)論與討論

在開放式組織培養(yǎng)中,培養(yǎng)基中添加抑菌劑的研究較多,而對組培容器進行浸泡消毒的研究較少。次氯酸鈉在日常生活中多作為表面消毒劑使用。康俊等[18]使用200倍“84消毒液(次氯酸鈉)”對組培容器使用浸泡消毒污染率減少42%,該研究中培養(yǎng)基中添加抑菌劑,使用1%次氯酸鈉浸泡消毒效果更好。羅燕羽等[19]研究表明益培隆不適合在香蕉開放式組培中使用,該研究中益培隆可應(yīng)用在馬鈴薯開放式組織培養(yǎng)中,說明開放式植物組織培養(yǎng)中抑菌劑的添加因植物種類不同而存在差異,在實際應(yīng)用中要充分考慮抑菌劑對植物生長的影響。蔗糖在組織培養(yǎng)中為植物提供碳源,低糖濃度能夠減少污染,但不同植物種類所需糖濃度不同[3,20],該研究中,開放式組織培養(yǎng)改變生長環(huán)境后,蔗糖濃度7.5 g/L條件下馬鈴薯植株生長狀況良好。瓊脂濃度決定了培養(yǎng)基形態(tài)[21-22],培養(yǎng)狀態(tài)的不同對植株生長以及菌類生長均有一定影響,在開放式組織培養(yǎng)中對瓊脂的研究較少,該研究采用6.6 g/L瓊脂可以作為馬鈴薯開放式組織培養(yǎng)瓊脂濃度參考。

該試驗通過Design-Expert軟件利用Box-Behnken分析法對馬鈴薯開放式組織培養(yǎng)條件進行優(yōu)化設(shè)計,選取有效生長率為指標(biāo)得到開放式組織培養(yǎng)最優(yōu)組合:次氯酸鈉浸泡容器消毒濃度1%,培養(yǎng)基中添加抑菌劑益培隆濃度0.5 mL/L、蔗糖濃度7.5 g/L、瓊脂濃度6.6 g/L,各因素對有效生長率的影響為次氯酸鈉>蔗糖>益培隆>瓊脂。