宗釗輝,陳幀祿,賀廣生,王 軍,曾 濤,陳澤鵬,趙偉才*

(1.廣東省煙草科學(xué)研究所,廣東韶關(guān)512000;2.廣東煙草韶關(guān)市有限公司,廣東韶關(guān) 512000;3.中國(guó)煙草總公司廣東省公司,廣東廣州 510000)

作物在種植過(guò)程中,生長(zhǎng)發(fā)育受生態(tài)環(huán)境、種植水平與品種等因素影響,其中品種對(duì)作物產(chǎn)量與質(zhì)量尤為重要[1-2]。優(yōu)良品種(系)的研究?jī)r(jià)值不僅在于提質(zhì)、增產(chǎn)與高抗,更是作為重要種質(zhì)資源與品種選育的重要材料,研究其攜帶的優(yōu)良基因以及與其他品種的基因差異,包括優(yōu)良基因在染色體的位點(diǎn)、蛋白質(zhì)組學(xué)功能與SNP分析[3-4]。

煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物,是煙草行業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要保障,優(yōu)良烤煙品種是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)煙葉的前提。煙草基因組計(jì)劃重大專(zhuān)項(xiàng)啟動(dòng)以來(lái),我國(guó)煙草分子育種技術(shù)取得了快速發(fā)展,在煙草育種分子標(biāo)記輔助選擇、種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、遺傳圖譜構(gòu)建、標(biāo)記-性狀關(guān)聯(lián)分析和基因芯片等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[5-8]。明確育種材料的遺傳背景及其遺傳關(guān)系,能減少育種材料選擇與親本選配的盲目性,提高育種的選育效率,對(duì)于常規(guī)育種具有重大的意義[9-11]。遺傳背景分析包括遺傳多樣性、群體結(jié)構(gòu)等,對(duì)于煙草種質(zhì)資源的遺傳多樣性與群體結(jié)構(gòu)研究已有多篇報(bào)道,蔣勛等[12]通過(guò)對(duì)春雷一號(hào)等30分高煙堿烤煙種質(zhì)資源進(jìn)行再鑒定,篩選出春雷一號(hào)、畢金一號(hào)、8100、I-35、廣東黃(1)、遼煙十四號(hào)和 NC729共7 個(gè)低糖、高煙堿煙草品種;向小華等[13]利用92分雪茄煙種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳分析,將雪茄煙種質(zhì)分為4類(lèi),構(gòu)建了92份雪茄煙種質(zhì)資源DNA 指紋圖譜代碼;陳芳等[14]利用SSR標(biāo)記把80份種質(zhì)資源分為兩大類(lèi)群,構(gòu)建了不同煙草種質(zhì)資源的數(shù)字指紋圖譜;方敦煌等[15]利用SSR標(biāo)記把60份香料煙種質(zhì)資源分為3個(gè)亞群;劉國(guó)祥等[16]利用SSR標(biāo)記將33份曬煙種質(zhì)資源分為2個(gè)亞群。以上研究都是基于第二代分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行的煙草種質(zhì)遺傳資源分析,但我國(guó)的煙草品種遺傳狹窄,開(kāi)發(fā)出的SSR 標(biāo)記多態(tài)性水平低,導(dǎo)致SSR 標(biāo)記在煙草中的研究和應(yīng)用存在一定局限性。

全基因組重測(cè)序(whole genome resequencing,WGR)是通過(guò)對(duì)已知基因組序列物種不同個(gè)體的基因組進(jìn)行測(cè)序,對(duì)不同種質(zhì)資源進(jìn)行差異性分析的高通量測(cè)序技術(shù),前人利用從測(cè)序技術(shù)對(duì)馬鈴薯[17]、金針菇[18]、大麥[19]、水稻[20]等作物的種質(zhì)遺傳多樣性進(jìn)行分析。鑒于此,筆者基于重測(cè)序技術(shù)對(duì)韶關(guān)5個(gè)烤煙品種(系)進(jìn)行全基因組重測(cè)序,分析其遺傳多樣性及群體結(jié)構(gòu),為烤煙親本選配、優(yōu)良育種材料利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料供試的5個(gè)品種(系)來(lái)自廣東省煙草南雄科學(xué)研究所,詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 不同烤煙品種信息

1.2 樣品取樣與SNP標(biāo)記檢測(cè)試驗(yàn)材料種植于廣東省煙草南雄科學(xué)研究所內(nèi)的原種圃?xún)?nèi),打頂后選取長(zhǎng)勢(shì)良好、無(wú)病害發(fā)生的煙株腋芽。樣品送至華大農(nóng)業(yè)研究院進(jìn)行高通量測(cè)序,根據(jù)識(shí)別標(biāo)簽序列得到每個(gè)個(gè)體的測(cè)序reads,先使用Trimmomatic(0.38)對(duì)測(cè)序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾處理,主要是去除接頭污染和低質(zhì)量reads,得到高質(zhì)量的cleandata數(shù)據(jù)用于后續(xù)的比對(duì)分析。

以Nitab-v4.5_genome_Chr_Edwards2017.fasta.gz為參考基序列,使用短序列比對(duì)軟件BWA(Version:0.7.16a)的 “mem”算法將 clean reads 比對(duì)到參考基因組上(比對(duì)參數(shù)為-t 2 -k 32 -M -R),使用samtools(v1.7)將sam格式的比對(duì)結(jié)果轉(zhuǎn)換為bam格式,再用gcta(v 4.1.1.0)軟件的SortSam工具對(duì)比對(duì)文件進(jìn)行排序得到的sort.bam文件,使用MarkDuplicates工具標(biāo)記重復(fù),利用HaplotypeCaller模塊3.2的比對(duì)結(jié)果進(jìn)行變異檢測(cè),僅選擇mapQ值大于20且為properly paired比對(duì)的reads用于后續(xù)的變異檢測(cè)分析(過(guò)濾參數(shù)為-ERC GVCF --minimum-mapping-quality 20)。

1.3 群體結(jié)構(gòu)分析以系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、主成分分析和Structure分析,研究樣本間的親緣關(guān)系和進(jìn)化關(guān)系。

1.3.1系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。采用IqTree軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),使用GTR+CAT模型進(jìn)行最大似然親緣關(guān)系分析(https://itol.embl.de/)。

1.3.2主成分分析。PCA 僅針對(duì)個(gè)體數(shù)n=XX 的常染色體數(shù)據(jù),忽略高于2個(gè)等位基因位點(diǎn)以及錯(cuò)配數(shù)據(jù),其分析方法如下在個(gè)體i,k位置的SNP用dik表示,若個(gè)體i與參考等位基因是純合,則dik=0;若是雜合,則dik=1;若個(gè)體i與非參考等位基因是純合,則dik=2。利用公式計(jì)算獲得標(biāo)準(zhǔn)基因型的n×S的矩陣:

式中:E(dk)是dk的平均值;個(gè)體樣本協(xié)方差n×n矩陣通過(guò)X=MMT/S計(jì)算測(cè)出。最后利用功能特征函數(shù)R分解X特征向量。采用GCTA(v1.93)軟件進(jìn)行PCA 分析,利用過(guò)濾好的SNP數(shù)據(jù)構(gòu)建所有樣本間的親緣矩陣;再使用構(gòu)建好的親緣矩陣計(jì)算前3個(gè)特征值和特征向量;最后,使用Python腳本進(jìn)行圖形展示。

1.3.3群體間遺傳系數(shù)(Fst)分析。Fst指數(shù)由F統(tǒng)計(jì)量演變而來(lái),反應(yīng)群體等位基因雜合性水平,用于衡量種群分化程度。計(jì)算公式:

式中:πBetween代表群體間的兩兩個(gè)體差異的均值;πWithin代表群體內(nèi)兩兩個(gè)體差異的均值。

使用vcftools軟件進(jìn)行群體Fst分析,參數(shù)為(--fst-window-size 500000-fst-window-step 50000)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同烤煙品種(系)重測(cè)序質(zhì)量評(píng)估樣本重測(cè)序數(shù)據(jù)詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表2。樣本測(cè)序的堿基序列在5.060×109～5.880×109;每個(gè)樣本重測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組比對(duì)R_q20值在98.70%～98.80%,平均值98.74%;R_q30值在95.70%～96.18%,平均值95.90%;R_gc含量在39.78%～45.24%,平均值42.42%。以Nitab-v4.5_genome_Chr_Edwards2017.fasta.gz為參考基因組序列,共有24條染色體,比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表3,每個(gè)樣本與參考基因組的比對(duì)率最高93.64%,最低91.97%,平均92.88%;測(cè)序深度最高27.96X,最低23.37X,平均測(cè)序深度為25.10X,平均覆蓋度為92.77%。以上數(shù)據(jù)表明,送樣樣本與參考基因組的相似度達(dá)到重測(cè)序標(biāo)準(zhǔn),滿(mǎn)足該群體的遺傳多樣性分析與群體結(jié)構(gòu)分析。

表2 樣本測(cè)序數(shù)據(jù)過(guò)濾情況

表3 BWA比對(duì)統(tǒng)計(jì)

2.2 不同烤煙品種(系)間SNP檢測(cè)、統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用GATK(v4.1.1.0)軟件對(duì)群體進(jìn)行SNP變異進(jìn)行檢測(cè),被檢測(cè)到的SNP再用GATK進(jìn)行過(guò)濾,具體參數(shù)如下:SNP過(guò)濾參數(shù):"QD <5.0 || QUAL<50.0 || MQ <20.0。然后對(duì)SNP進(jìn)行“無(wú)缺失”過(guò)濾,最終被明確定位在染色體水平上的SNP位點(diǎn)為26728180 SNPs,這些SNP位點(diǎn)將被用于5個(gè)烤煙種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析。

從各染色體的SNP位點(diǎn)分布情況來(lái)看(圖1),不同染色體上均有SNP位點(diǎn)分布,染色體間分布差異較大。17號(hào)染色體上SNP位點(diǎn)數(shù)量最多為2 346 665個(gè),占總數(shù)的8.78%,其次是22號(hào)、6號(hào)、1號(hào)染色體,SNP位點(diǎn)數(shù)量分別為1 613 506、1 503 797、1 388 858個(gè),占比分別為6.04%、5.63%、5.20%;9號(hào)與21號(hào)染色體SNP位點(diǎn)數(shù)量分別為702 575、740 812個(gè),占比分別為2.63%、2.77%,其余染色體位點(diǎn)數(shù)量在8.0×106～1.22×107,占比在3.00%～4.70%。從各染色體SNP位點(diǎn)密度來(lái)看(圖2),SNP密度在7.4～11.1個(gè)/kb,1號(hào)、3號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、10號(hào)、11號(hào)、17號(hào)、20號(hào)染色體SNP密度較大,在10個(gè)/kb以上,其余染色體SNP密度均在10.0個(gè)/kb以下。

圖1 染色體SNP位點(diǎn)分布 Fig.1 Chromosome SNP locus distribution

圖2 不同染色體SNP位點(diǎn)密度 Fig.2 Chromosome SNP locus density

2.3 不同烤煙品種(系)SNP雜合度不同烤煙品種(系)SNP雜合度統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可以看出,不同烤煙品種(系)SNP位點(diǎn)共有26 728 180個(gè),雜合SNP位點(diǎn)在10 527 807～10 764 786個(gè),平均為12 601 261個(gè),雜合度在0.393 9～0.548 2,平均為0.471 5。其中HY1雜合SNP位點(diǎn)最少,為10 527 807個(gè),雜合度為0.393 9,與YY98接近;NX212雜合SNP位點(diǎn)最多,為14 651 863個(gè),雜合度為0.548 2,高于其他4個(gè)品種(系);K326與NX002雜合度接近,分別為0.506 4、0.506 1。

表4 不同烤煙品種(系)SNP雜合度統(tǒng)計(jì)

2.4 不同烤煙品種(系)多態(tài)性分析群體多態(tài)性指的是同一群體中2種或2種以上變異類(lèi)型并存的現(xiàn)象。Fst居于0～1,分化指數(shù)越大,表明2個(gè)群體之間的差異就越大,Fst值為0表示2個(gè)群體是隨機(jī)交配的,基因型完全相似。如果Fst值為1則表示2個(gè)群體完全隔離。以親緣關(guān)系較近的K326、HY1和YY98同NX002比較(圖5),Fst分析結(jié)果可以看出,NX002和K326、HY1、YY98在24條染色體上分化程度較小(大部分位于區(qū)間-0.1～0.1),但不同染色體其分化程度存在差異,其中Chr1、Chr2、Chr5 、Chr6、Chr7、Chr9、Chr10、Chr11、Chr13、Chr15、Chr16、Chr17、Chr18、Chr19、Chr20、Chr21、Chr23、Chr24染色體分化程度較小,較大的區(qū)間位于Chr3、Chr4、Chr8、Chr12、Chr14和Chr22上,其中Chr3染色體分化程度最大。

2.5 不同烤煙品種(系)聚類(lèi)分析利用分型數(shù)據(jù)分析獲得了5個(gè)不同烤煙品種(系)的遺傳距離,其范圍在0.201～0.275,平均遺傳距離為0.235?；诤诵腟NP 的遺傳距離構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3),結(jié)果顯示5個(gè)煙草種質(zhì)資源可以分為3組:K326、NX002烤煙品種(系)聚為一組,這與NX002是K326變異系來(lái)源有關(guān);NX212單獨(dú)聚為一組,HY1與YY98烤煙品種(系)聚為一組。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)反映了種間親緣關(guān)系遠(yuǎn)近,K326與NX00親緣關(guān)系近,HY1與YY98親緣關(guān)系近。

圖3 不同烤煙品種(系)Fst分析 Fig.3 Fst analysis of different flue-cured tobacco varieties(lines)

圖4 不同育種材料系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of different breeding materials

2.6 不同烤煙品種(系)主成分分析基于主成分1與主成分2數(shù)據(jù)繪制5個(gè)不同烤煙品種(系)的主成分分析(PCA)圖(圖5),根據(jù)不同烤煙品種(系)個(gè)體基因組 SNP 差異程度,按照二維圖形中的位置和互相間距離可區(qū)分為3 類(lèi),即NX212分為一類(lèi),K326與NX002分為一類(lèi),HY1與YY98分為一類(lèi),與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分類(lèi)結(jié)果一致。其中K326與NX002品種(系)位置較近,幾乎重疊在一起,親緣關(guān)系最近;HY1與YY98品種位置葉比較臨近,親緣關(guān)系也較近;NX212與其余4個(gè)品種(系)相聚較遠(yuǎn),說(shuō)明NX212與其余品種(系)沒(méi)有明顯親緣關(guān)系。

圖5 不同烤煙品種(系)主成分分析(PCA)Fig.5 Principal component analysis of different flue-cured tobacco varieties(lines)

3 討論

3.1 不同烤煙品種(系)遺傳多樣性分析常規(guī)育種中,用作親本的2個(gè)材料應(yīng)具備優(yōu)良綜合性狀互補(bǔ),遺傳背景差距較大,雜交后代性狀分離明顯,才有可能選育出具備親本優(yōu)良性狀的新品種,因此開(kāi)展對(duì)常用育種材料的遺傳背景分析,對(duì)雜交育種中親本材料的選擇具有重要指導(dǎo)意義[21-22]。煙草種質(zhì)資源豐富,到2017 年底我國(guó)已保存煙屬種質(zhì)資源5 767份,但作為育種材料利用較多的僅有27 份種質(zhì),同時(shí)不斷雜交使新的類(lèi)型不斷增加,材料血緣更加復(fù)雜,通過(guò)表型分析難以準(zhǔn)確判斷不同親本材料遺傳來(lái)源,這給烤煙育種的工作者增加了很多不必要的工作量[23-24]。該研究通過(guò)重測(cè)序技術(shù)對(duì)5個(gè)烤煙品種(系)進(jìn)行遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析,平均測(cè)序深度高達(dá)25.10 X,R_q30>95%,基因組平均覆蓋度為92.88%,說(shuō)明測(cè)序質(zhì)量過(guò)關(guān),重測(cè)序可以從分子水平上明確不同材料間的遺傳關(guān)系與群體結(jié)構(gòu)。

該研究測(cè)序最終獲得26728180 SNPs,不同染色體上均有SNP位點(diǎn)分布,染色體間分布差異較大,17號(hào)染色體上SNP位點(diǎn)數(shù)量最多,SNP密度在7.4～11.1個(gè)/kb。SNP雜合度是衡量群體的遺傳多樣性的重要指標(biāo),當(dāng)雜合度大于0.500 0 時(shí),群體具有比較豐富的遺傳多樣性,供試的5個(gè)烤煙品種(系)的平均雜合度為0.471 5,表明5個(gè)烤煙品種(系)遺傳多樣性較低,但K326、NX002、NX212群體的雜合度大于0.500 0,具備較高的遺傳多樣性。Fst分析認(rèn)為,NX002和K326、HY1、YY98在24條染色體上分化程度較小(區(qū)間-0.1～0.1),分化程度較大的區(qū)間位于Chr3、Chr4、Chr8、Chr12、Chr14和Chr22上,下一步可以對(duì)分化程度較大的染色體片段基因進(jìn)行分析,結(jié)合不同烤煙品種(系)表型性狀,篩選出與相關(guān)性狀有關(guān)的候選基因。

3.2 不同烤煙品種(系)群體結(jié)構(gòu)分析系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)是生物信息學(xué)中描述不同生物之間相關(guān)關(guān)系的方法,研究通過(guò)IqTree軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),分析了5個(gè)烤煙品種(系)的遺傳距離。研究發(fā)現(xiàn)5個(gè)烤煙品種(系)可以分為3類(lèi),其中NX212獨(dú)立分類(lèi)。K326與NX002聚為一類(lèi),NX002是南雄煙科所自主選育的品系,其來(lái)源于K326大田變異,親緣關(guān)系較近;HY1與YY98聚為一類(lèi),HY1母本為G28、父本是K326變異系(拗尾煙),YY98母本為Coker206、父本為K326,這可能是由于2個(gè)品系父本均為K326系,HY1母本G28是Oxford-1-181與Corker139雜交至第4代,又與NC95雜交選育而成,與YY98母本Coker206遺傳背景同樣比較接近。PCA分析顯示,分類(lèi)結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果一致,但K326、NX002間遺傳距離較YY98、HY1更近。群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明,K326、NX002與YY98、HY1間親緣關(guān)系接近,在親本選擇中應(yīng)避免同時(shí)使用NX002、K326或YY98、HY1作為父母本。

4 結(jié)論

該研究依靠基因組重測(cè)序技術(shù),對(duì)5 個(gè)烤煙品種(系)進(jìn)行遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析,發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有的5個(gè)烤煙品種(系)遺傳多樣性較低,其中K326與NX002,以及粵煙98與粵煙1號(hào)間親緣關(guān)系接近,同時(shí)還觀(guān)察到分化程度較大的區(qū)間位于Chr3、Chr4、Chr8、Chr12、Chr14和Chr22上,后續(xù)工作擬在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上,通過(guò)繪制全基因組選擇信號(hào)分析圖,設(shè)置不同閾值線(xiàn),并進(jìn)行GO 富集基因功能注釋,篩選烤煙產(chǎn)質(zhì)量與抗性相關(guān)基因。