洪鑄　夏倩　聶昌　王龍　杜春艷

【摘要】? 蛋白免疫印跡技術（western blotting，WB）是檢測蛋白質經濟、有效的方法，已廣泛應用于分子相關的領域，但其影響因素多、操作復雜，常出現(xiàn)異常結果。本研究使用傳統(tǒng)蛋白免疫印跡技術法檢測（Sprague-Damley，SD）大鼠肝臟、脾臟組織某些蛋白質的表達，分析探討常見異常結果及處理方法，為實驗室和其他實驗者提供參考。

【關鍵詞】? 蛋白免疫印跡技術；? 抗體；? SDS-PAGE

中圖分類號：R-331? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：1672-1721（2023）28-0089-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.28.030

蛋白免疫印跡技術（WB）是檢測組織、細胞中蛋白質表達并使之可視化的有效方法，最早在1979年由H.Towbin等[1]提出，后于1981年首次被W.N.Burnette等[2]稱為Western blotting并沿用至今。WB法目前已作為分子生物學的常規(guī)實驗方法，被廣泛使用、刊登及討論，其基本思路是將煮沸失活的蛋白樣品置于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulface polyacry lamide gel electrophoresis，SDS-PAGE gel）中進行電泳以分離不同分子量的蛋白質，之后按照蛋白分子量標記物（如彩虹marker）將目的區(qū)域的凝膠和內參凝膠切下，并將其上的蛋白通過電流轉移至較為穩(wěn)定的載體膜上，再用目標抗體和內參抗體孵育，次日用對應的含有標記物的第二抗體孵育，用標記物的底物進行反應后曝光，最后使用目標蛋白和內參蛋白的陰影比值作為相對表達量得出結果。其理論檢測下限可達1～5 ng，較其他檢測方法而言，經濟性較好，但操作流程較為復雜，實驗持續(xù)時間長，影響因素較多。本研究針對遇到的8類常見異常結果及處理方法分析討論，為其他實驗者提供參考。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 材料? ? 組織樣本來源：雄性SD大鼠，清潔級，取脾臟、肝臟。主要實驗試劑與儀器：3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）第一抗體、GATA第一抗體由abcam生物技術有限公司生產。FKLF第一抗體、p-JNK第一抗體、ACTIN第一抗體、HRP第二抗體由北京博奧森生物技術有限公司生產。丙烯酰胺、RIPA裂解液、彩虹maker、BCA蛋白定量試劑盒由索萊寶生物科技有限公司生產。ECL曝光液由常州天地人和生物生產。ChemiDoc化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)由BIO-RAD公司生產。

1.2? ? 方法? ? 蛋白上樣液制作：使用RIPA蛋白裂解液裂解組織，按BCA蛋白定量法計算并制作蛋白樣品，上樣緩沖液中蛋白終質量濃度均定為40 mg/10 mL。SDS-PAGE電泳：配制SDS-PAGE凝膠及上層膠，取10 μL蛋白樣品、彩虹marker上樣，使用80 V電壓電泳至彩虹marker分離出彩色條帶后調節(jié)電壓為120 V電泳直至蛋白樣品觸底。濕法轉膜、封閉：將凝膠取出以300 mA電泳條件轉移至聚偏二氟乙烯（polyving lidene fluoride，PVDF）膜；孵育第一抗體、第二抗體后使用ECL工作液曝光取像[2]。

2? ? 異常結果分析及處理建議

2.1? ? 背景色過深? ? 如圖1所示，過深的背景色與封閉異常相關，可適當延長封閉時間以競爭洗脫膜上的雜蛋白，但封閉時間過長，亦可使得目標蛋白信號減弱。封閉液及用于洗滌的TBST緩沖液如果有不明沉淀物或絮狀渾濁，應及時更換，封閉液中使用的脫脂奶粉需要保持干燥，而且封閉時間過長且未洗凈亦可能導致此結果。目前主流圖像分析軟件可降低背景顯色，但可能會影響目的條帶的分析。

2.2? ? 曝光后顯示無條帶? ? 如圖2所示，曝光出現(xiàn)空白可能原因有：轉膜失敗，轉膜時間或電流不適宜，蛋白質尚未進入或已穿出PVDF膜，需更換轉膜條件；第一抗體、第二抗體濃度過低或失效，無法顯色，需逐一嘗試提高抗體濃度或更換抗體；樣本本身表達目標蛋白過低，可嘗試依據內參蛋白適當提高樣本蛋白濃度；ECL曝光液失效，尤其在多張樣片同時曝光時，曝光液使用后見光時間長易失效且反復使用使其效應減弱，需更換曝光液；操作人員因經驗不足，未從寬裁剪凝膠，將目的條帶意外切去，或切去部分導致無法分析。

2.3? ? 出現(xiàn)較多條帶? ? 如圖3所示，無論是選擇多克隆抗體還是單克隆抗體，亦或樣本是組織或是細胞株，均有可能出現(xiàn)多條帶。目前處理方法爭議較大，可按抗體說明書選擇接近目標分子量的條帶，或綜合分析處理所出現(xiàn)的所有條帶。

2.4? ? 帶墨點的無規(guī)律條帶? ? 如圖4所示，在實驗中多次更換其他實驗條件但反復出現(xiàn)不能解釋的墨點狀堆積而條帶不明顯，可能是抗體失效所致，需要更換抗體。此外，封閉液中的奶粉未完全溶解也可能導致異常墨點。

2.5? ? 未選擇合適濃度的膠導致異常陰影出現(xiàn)? ? 如圖5所示，由于蛋白質分子量不同，需選擇適宜濃度的膠分離不同分子量的目的蛋白，蛋白分子量越大，則需要選擇濃度越低的膠；濃度過低的膠可能無法準確顯示膠下方的分子量。

2.6? ? 結果中出現(xiàn)未明原因的白色無抗體覆蓋區(qū)域? ? 如圖6所示，可能原因是轉膜過程中PVDF膜與膠之間出現(xiàn)氣泡，導致蛋白轉丟，或在使用TBST清洗時直接澆在膜上沖洗掉抗體。

2.7? ? 無法曝光或者過亮曝光? ? 如圖7所示，主要由于第一抗體、第二抗體濃度過高超出儀器檢測范圍，導致儀器無法曝光或者過亮曝光顯示出條帶處為空白而無法分析。需適當降低抗體濃度，并降低曝光時間。

2.8? ? 膠過度電泳導致膠體扭曲? ? 需要在電泳時觀察膠體，避免過度電泳后變形，但輕微的變形一般不影響條帶的分析。制膠是否均勻以及膠液是否充分混勻、充分凝固等也直接影響電泳后條帶的形狀，上下層膠合適的高度、包括上層膠梳齒處的均勻度及加樣量等亦有影響，如圖8所示。

3? ? 討論

WB技術發(fā)明至今已超40年，被廣泛用于分子生物學、農業(yè)、醫(yī)藥等領域的研究。該技術作為一種將組織或細胞中的蛋白表達可視化的方法，為分子科技的進步和人類認知疾病等諸多方面作出了貢獻。

除文中提到的技術因素引起的異常結果外，第一抗體的選擇也是該技術的核心問題。目前市售有多種國內外廠家生產抗體，質量參差不齊，廠家會在說明書中標明抗體的序列，但購買者往往無法確切驗證其質量。蛋白質在產生過程中經歷可變剪接（alternative splicing）、翻譯后修飾（post-translational modification）等改變，使得細胞或組織中的蛋白質存在多樣性，可能會具有多種亞型（isoform），而抗體往往只針對某一基因保守區(qū)產生的蛋白而設計，使用單一抗體有可能會造成漏檢。值得注意的是，使用單種抗體卻得到多個條帶結果的現(xiàn)象并不少見，由于目前主流觀點是，使用符合預期分子量的單一條帶對WB結果進行解釋，這很可能會忽略了可能是其他亞型成分的“雜帶”，最終可能會導致錯誤的結果解釋，并導致WB結果與免疫組化染色實驗結果的沖突[3]。有研究表明，某些癌細胞株中可能僅有不到1/10的基因只表達1種野生型蛋白，其余以其他多種亞型存在，這些亞型的分子大小與預期相差較大；在某些情況下，WB中僅有1/4～1/3的野生型蛋白按預期在SDS凝膠中遷移，而這些亞型則很可能是引起多個條帶存在的關鍵因素[4-5]。因此，抗體的選擇及其信息對于WB結果的解釋十分重要。實驗中所遇到的“雜帶”也可能有重大意義，但受目前技術限制，無法確切得知蛋白具體表達的亞型情況，也難以得知“雜帶”究竟是蛋白異構體的亞型引起或技術固有因素導致的蛋白遷移率異常。由于WB技術往往使用管家基因產生的蛋白作為內參，尚需要明確所選內參蛋白的表達是否會在某些特定情況下（如腫瘤、炎癥等）受到影響。有學者認為需要使用多種抗體共同驗證且對多個條帶進行科學解釋，并選擇不同的內參共同進行參考[6]。這些技術因素、生物因素均可導致意外結果的出現(xiàn)。

隨著如微流控蛋白印跡雜交[7]、液相質譜等[8]新技術的不斷涌現(xiàn)，人們對蛋白質組學的認知將會不斷更新，從而不斷對WB技術進行改進并加深對其認識。在傳統(tǒng)的WB中，至少需要2 d時間才能得到1輪結果，其操作步驟復雜，需要配制的試劑繁多，影響因素多，實驗中一旦遇到問題，需要逐一排查。本研究對實驗室傳統(tǒng)WB法所遇到的異常結果及處理方法進行了總結，希望對其他實驗者有所幫助。

參考文獻

[1] TOWBIN H，STAEHELIN T，GORDON J.Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets：procedure and some applications[J].Proc Natl Acad Sci?USA，1979，76（9）：4350-4354.

[2] BURNETTE W N."Western Blotting"：Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A[J].Anal Biochem，1981，112（2）：195-203.

[3] LIU X，WANG Y，YANG W，et al.Protein multiplicity can lead to misconduct in western blotting and misinterpretation of immunohistochemical staining results，creating much conflict-ing data[J].Prog Histochem Cytochem，2016，51（3/4）：51-58.

[4] YAN R，ZHANG J，ZELLMER L，et al.Probably less than one-tenth of the genes produce only the wild type protein without at least one additional protein isoform in some human cancer cell lines[J].Oncotarget，2017，8（47）：82714-82727.

[5] QU J，ZHANG J，ZELLMER L，et al.About three-fourths of mouse proteins unexpectedly appear at a low position of SDS-PAGE，often as additional isoforms，questioning whether all protein isoforms have been eliminated in gene-knockout cells or organisms[J].Protein Sci，2020，29（4）：978-990.

[6] GORR T A，VOGEL J.Western blotting revisited：critical perusal of underappreciated technical issues[J].Proteom Clin Appl，2015，9（3/4）：396-405.

[7] 辛曉磊，慕軒，王欣，等.微流控蛋白印跡雜交與傳統(tǒng)Western blot對目的蛋白的檢測效果比較[J].基礎醫(yī)學與臨床，2017，37（10）：1378-1383.

[8] 易可可，謝潔，龔曉云，等.液相色譜-串聯(lián)質譜應用研究進展[J].計量科學與技術，2021（2）：7-15.

（收稿日期：2023-07-11）