趙曉超, 李林林, 張貝貝, 譚再鈺, 周亞彬, 吳 創(chuàng), 禹 言,張靜亞, 瞿 歡, 普 倩, 黃友誼, 潘 勇*

(1.湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司,湖北 武漢 430040; 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 湖北 武漢 430070; 3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝林學(xué)學(xué)院, 湖北 武漢 430070)

0 引言

【研究意義】煙葉發(fā)酵是從農(nóng)產(chǎn)品原料到雪茄產(chǎn)品的重要環(huán)節(jié),是提高煙葉質(zhì)量、改善雪茄香吃味的重要步驟[1]。人工接種發(fā)酵為雪茄煙葉的工業(yè)化生產(chǎn)提供了更高效和更高品質(zhì)的解決方案。因此,加快菌種資源的挖掘和探究對雪茄煙葉品質(zhì)影響,對促進產(chǎn)業(yè)高速發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】在微生物發(fā)酵作用下,煙葉內(nèi)部無特征香味大分子化合物轉(zhuǎn)化分解為各種小分子或揮發(fā)性物質(zhì),形成煙葉特定品質(zhì)風(fēng)味,中性致香成分含量是客觀評價煙葉品質(zhì)的重要標(biāo)準(zhǔn)[2-3]。經(jīng)過煙葉發(fā)酵,煙葉的香氣、吃味和外觀得到明顯改善,燃燒性提高,霉變率顯著降低[4]。選育優(yōu)良菌種發(fā)酵煙葉提升煙葉質(zhì)量,已成為當(dāng)前的研究熱點[5-7];而當(dāng)前國內(nèi)對煙葉優(yōu)良菌株的選育正處于起步階段,尚未建立起適合發(fā)酵生產(chǎn)雪茄煙葉的微生物技術(shù)體系[8]?！狙芯壳腥朦c】通常進口雪茄煙支品質(zhì)優(yōu)于國產(chǎn)雪茄是其優(yōu)勢菌發(fā)揮了重要作用,前期從進口雪茄煙支中分離到1株優(yōu)勢菌地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)FZ1,是常用于食物發(fā)酵的有益菌,呈現(xiàn)辛香、蜂蜜香、醋酸香和醬香等特征性香氣[9],在煙葉發(fā)酵中的相關(guān)研究較少,為此,將其用于雪茄煙葉發(fā)酵,分析其對雪茄煙葉中性致香成分的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過人工接種發(fā)酵獲得更高品質(zhì)的煙葉,明晰FZ1對煙葉中性致香成分的影響,為人工接菌發(fā)酵雪茄煙葉提供菌種資源和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 地衣芽孢桿菌 地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)FZ1是由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物工程實驗室分離自多米尼加進口富恩特OPUS X(父與子)雪茄煙中的1株優(yōu)勢菌。

1.1.2 雪茄 發(fā)酵的雪茄煙葉由湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供,雪茄煙葉品種為Criollo 98,葉位是上二棚。

1.1.3 試劑 乙酸苯乙酯(98%)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;C7-C40正構(gòu)烷烴混標(biāo)為色譜純(BR),購于上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基 牛肉浸膏蛋白胨培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏5.0,蛋白胨10.0,NaCl 5.0,pH 7.0～7.2,固體培養(yǎng)基再加瓊脂粉20.0。

1.2 優(yōu)勢菌株FZ1發(fā)酵雪茄煙葉

1.2.1 菌種制備 FZ1菌株接種至牛肉膏液體培養(yǎng)基,于37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。然后以4 000 r/min離心5 min,收集菌體。菌體用無菌水清洗2次,無菌水重懸得菌液,進行計數(shù),配制成一定菌濃度的菌液,作為接種備用。

1.2.2 發(fā)酵雪茄煙葉 挑取完整片狀雪茄煙葉原料,每份約40 g。將FZ1菌株菌液直接均勻噴灑至雪茄煙葉表面,至接種量為108CFU/g煙葉,再用無菌水將雪茄煙葉含水率調(diào)至為40%,以僅添加無菌水至含水率40%的煙葉作對照(CK),每組設(shè)置3個重復(fù)。將接種后的煙葉裝于無菌袋中,密封,于37 ℃恒溫發(fā)酵15 d,取出發(fā)酵煙葉進行分析。

1.2.3 雪茄煙葉含水率的測定 雪茄煙葉含水率參考標(biāo)準(zhǔn)YC/T 31—1996烘箱法測定[10]。

1.3 發(fā)酵雪茄煙葉的感官評價

由6名專家評委對發(fā)酵后的雪茄煙葉進行感官評價,評價指標(biāo)包括煙葉香氣、刺激性、色澤,各指標(biāo)按檔次分別賦予不同分值,滿分依次為15分、15分和10分(表1)。

表1 雪茄煙葉感官質(zhì)量各單項指標(biāo)記分

1.4 雪茄煙葉中性致香成分測定

雪茄煙葉中性致香成分使用水蒸氣蒸餾-二氯甲烷溶劑萃取法測定[11]。將發(fā)酵后的煙葉剪切,再用植物粉碎機粉碎,過40目篩,低溫保存?zhèn)溆?。? 000 mL圓底燒瓶中加入5.0 g煙葉樣品、0.5 g檸檬酸、500 mL蒸餾水和50 μL乙酸苯乙酯內(nèi)標(biāo)(2.226 μg/μL),使用恒溫電熱套進行加熱;裝置的另一端接盛有40 mL二氯甲烷的250 mL圓底燒瓶,該燒瓶置于恒溫水浴鍋中加熱,水浴溫度為60 ℃。同時蒸餾萃取2.5 h。萃取完成后,加入過量無水硫酸鈉干燥有機相,將有機相轉(zhuǎn)移到茄形瓶,然后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1 mL即得煙葉精油,轉(zhuǎn)移至2 mL棕色氣相瓶中,用于GC-MS分析。

色譜柱:TG-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。載氣He,流速1.0 mL/min;進樣口溫度250 ℃,傳輸線溫度280 ℃。離子源溫度177 ℃。升溫程序:初始溫度60 ℃,保留2 min;然后以2 ℃/min的升溫速度升至230 ℃,保留15 min。分流比10︰1,進樣量為2 μL,電離能70 eV,電離方式EI。質(zhì)量數(shù)為35～500 amu,溶劑延遲6 min。

揮發(fā)物由美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所(NIST)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫和保留指數(shù)(RI,由正構(gòu)烷烴C7-C40測定)表征。揮發(fā)物相對含量計算公式:

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有鑒定的中性致香成分利用SIMCA(version 14.1, Umetries, Sweden)進行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘分析(OPLS-DA),利用變量投影重要度(Variable Importance in Projection, VIP)>1和獨立t檢驗中P<0.05篩選顯著變化的物質(zhì)作為差異代謝物。差異中性致香成分含量采用Z-score歸一化處理并作熱圖。關(guān)鍵中性致香成分采用相對香氣活力值(Relative Odor Activity Value, ROAV)進行比較,閾值查詢采用文獻[12]提供的空氣介質(zhì)覺察閾值,優(yōu)先使用最新年份的閾值數(shù)據(jù)。一般認(rèn)為,ROAV>1的組分為關(guān)鍵香氣成分,0.1

2 結(jié)果與分析

2.1 地衣芽孢桿菌FZ1發(fā)酵雪茄煙葉感官評價

如表2所示,FZ1發(fā)酵后得分明顯高于CK,CK煙葉香氣整體特征表現(xiàn)有明顯的刺激性,香氣較弱,FZ1發(fā)酵后雪茄煙葉刺激性明顯降低,香氣飽滿甜度增加,色澤略低于CK,最終感官得分較CK高2.0分,說明FZ1發(fā)酵后雪茄煙葉的整體感官品質(zhì)有所提升。

表2 雪茄煙葉感官質(zhì)量評分

2.2 地衣芽孢桿菌FZ1發(fā)酵雪茄煙葉中性致香成分組成

由表3可見,從FZ1菌株發(fā)酵樣及CK樣中分別檢測出中性致香成分35種和39種,將各中性致香成分相對含量進行Z-score歸一化處理并作熱圖(圖1),按官能團可分為烯烴類、醛類、醇類、酮類、酯類和酚類6大類中性致香成分(圖2)。CK煙葉中性致香成分總量為1 118.28 μg/g,有烯烴類8種(26.18%)、酮類14種(26.02%)、酯類3種(17.19%)、醇類8種(20.59%)、醛類4種(6.21%)、酚類2種(3.81%);FZ1發(fā)酵煙葉中性致香成分總量為1 328.99 μg/g,有烯烴類6種(28.59%)、酮類14種(28.70%)、醇類9種(24.70%)、酯類2種(13.02%)、酚類1種(4.06%)、醛類3種(0.92%)。與CK相比,接種FZ1發(fā)酵后酮類、醇類、烯烴類、酚類的致香成分含量分別增加2.68%、4.11%、2.42%和0.26%,葉綠素降解產(chǎn)物新植二烯含量也增加27.74%;新植二烯可充當(dāng)其他致香物質(zhì)的載體,減輕煙氣對咽喉的直接刺激性[14]。香葉基丙酮、金合歡基丙酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、2,6,6-三甲基-2-環(huán)己烯-1,4-二酮、異佛爾酮和巨豆三烯酮B等6種類胡蘿卜素降解產(chǎn)物在FZ1發(fā)酵后,含量分別提高267.20%、13.31%、173.87%、292.77%、224.10%和61.05%;香葉基丙酮具有濃郁果香味,可增加煙氣香氣;金合歡基丙酮具有清甜、堅果香;少量二氫獼猴桃內(nèi)酯能減少刺激性、增加清新感;2,6,6-三甲基-2-環(huán)己烯-1,4-二酮具有干香,能使煙氣和順并減少刺激性;巨豆三烯酮能增加煙葉中的干香和甜潤感[15-17];表明FZ1發(fā)酵可以有效轉(zhuǎn)化和降解煙葉中的類胡蘿卜素,這對雪茄煙葉香氣風(fēng)格的形成具有重要影響[18]。FZ1發(fā)酵后,煙葉中西柏烷類降解物茄酮含量增加32.46%,而茄酮具有類似胡蘿卜的香味以及甘草、茶樣芳香,在增香提質(zhì)、醇和煙氣等方面有十分顯著的作用[19]。FZ1發(fā)酵后植物醇含量提高39.12%,為中性致香成分中含量最高的成分,具有很弱的花香和香脂香氣,常作為定香劑用于煙用香精[20]。FZ1發(fā)酵后雪茄煙葉中共新增3種致香成分,分別為具有青草香、柑桔樣的香氣的6-甲基-5-庚烯-2-酮、具有花香的(S)-氧化芳樟醇和有較弱花香和木香香調(diào)的香葉基芳樟醇,這些致香成分可賦予雪茄煙葉干香、花香和清甜感,明顯提高其嗅香。此外,FZ1發(fā)酵后雪茄煙葉中共有7種致香成分未被檢測出,分別為4-(2,2,6-三甲基環(huán)己基)-2-丁酮、里那醇、苯乙醛、2,6二甲基壬烷、正十五烷、鄰苯二甲酸二丁酯和2,4-二叔丁基-6-硝基苯酚。

圖1 雪茄煙葉中性致香成分熱圖

圖2 雪茄煙葉中性致香成分種類含量

表3 雪茄煙葉中性致香成分含量

2.3 地衣芽孢桿菌FZ1發(fā)酵雪茄煙葉差異中性致香成分

從PCA散點圖(圖3A)可看出,FZ1和CK之間存在顯著差異(P<0.05),但組內(nèi)差異不顯著(P>0.05)。對于相關(guān)性較小的變量根據(jù)OPLS-DA模型進行分析(圖3B),結(jié)合獨立樣本t檢驗,以VIP>1.0和P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異性致香成分,進一步展示組間差異(表4)。

圖3 雪茄煙葉中性致香成分主成分分析圖和正交偏最小二乘法判別分析圖

結(jié)合OPLS-DA分析結(jié)果共篩選15種差異中性致香成分,包括5種酮類(2,6,6-三甲基-2-環(huán)己烯-1,4-二酮、2,6,6-三甲基-1,4-環(huán)己二酮、茄酮、香葉基丙酮、金合歡基丙酮),醇類有香葉基芳香醇和植物醇,醛類有苯乙醛,酚類有2,4-二叔丁基苯酚和2,4-二叔丁基-6-硝基苯酚,烯烴類有新植二烯、正十五烷和正二十七烷,酯類有鄰苯二甲酸二丁酯和(R)-二氫獼猴桃內(nèi)酯。將差異中性致香成分進行相對含量Z-score歸一化處理并作熱圖(圖4);FZ1發(fā)酵雪茄煙葉后顯著增加的差異中性致香成分共有11種,分別為新植二烯、植物醇、2,6,6-三甲基-2-環(huán)己烯-1,4-二酮、2,6,6-三甲基-1, 4-環(huán)己二酮、茄酮、金合歡基丙酮、香葉基丙酮、2,4-二叔丁基苯酚、正二十七烷、香葉基芳樟醇和(R)-二氫獼猴桃內(nèi)酯(P<0.05);顯著下降的差異中性致香成分有正十五烷、苯乙醛、2,4-二叔丁基-6-硝基苯酚和鄰苯二甲酸二丁酯(P<0.05)。

2.4 地衣芽孢桿菌FZ1發(fā)酵雪茄煙葉關(guān)鍵中性致香成分

由圖5可見,在15種差異致香成分中,有10種與雪茄煙葉的香氣得分呈正相關(guān),其中,新植二烯、茄酮、金合歡基丙酮、植物醇、香葉基丙酮和2,4-二叔丁基苯酚與煙葉的整體香氣呈顯著或極顯著正相關(guān)關(guān)系,這與前人的研究結(jié)果一致[21-23];共有4種成分與香氣呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,其中,苯乙醛與煙葉的整體香氣呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系,這與王鵬澤等[24]的研究結(jié)果相似,苯乙醛具有濃郁的花香,但對煙草干香和焦甜香有較大負(fù)面影響。有5種成分與雪茄煙葉刺激性呈正相關(guān)關(guān)系,其中,苯乙醛和2,4-二叔丁基-6-硝基苯酚呈顯著相關(guān);有10種成分與雪茄煙葉刺激性負(fù)正相關(guān)關(guān)系,其中,新植二烯呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系,茄酮呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。盡管有4種成分與雪茄煙葉色澤呈正相關(guān)關(guān)系,11種成分呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,但均不顯著(P>0.05)。綜合可知,新植二烯、2,4-二叔丁基苯酚、金合歡基丙酮、茄酮、植物醇和香葉基丙酮可被認(rèn)為是FZ1發(fā)酵雪茄煙葉后的關(guān)鍵差異中性致香成分。

注：*和**分別表示差異達顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)水平。

2.5 地衣芽孢桿菌FZ1發(fā)酵雪茄煙葉中性致香成分的香氣貢獻

從表5可知,未接菌發(fā)酵雪茄煙葉共有12種主要致香成分(ROAV>1),其中,有9種ROAV>10的關(guān)鍵賦香成分,包括具有干草香的2,6,6-三甲基-2-環(huán)己烯-1,4-二酮(100.00),有青甜香、玫瑰香的香葉基丙酮(44.53),有干果香的巨豆三烯酮A(42.16)和巨豆三烯酮B(30.11),有風(fēng)信子香、果香的苯乙醛(38.38),有花香、清香的反-橙花叔醇(22.51)和植物醇(15.91),具有清涼感的異佛爾酮(15.69)和(R)-二氫獼猴桃內(nèi)酯(13.40);另有3種具有重要修飾作用的中性致香成分茄酮、β-大馬酮、(E)-氧化芳樟醇。FZ1發(fā)酵雪茄煙葉后共有11種主要致香成分(ROAV>1),其中,有8種ROAV>10的關(guān)鍵賦香成分,包括表征干香特征的巨豆三烯酮A(80.44)和巨豆三烯酮B(64.87)、表征花果香的香葉基丙酮(47.78)和植物醇(18.37);茄酮(1.16)由修飾香氣變?yōu)橹饕銡獬煞?此外新增2種修飾香氣成分,分別為具有檸檬草香的6-甲基-5-庚烯-2-酮(0.64)和具有木香、花香的(S)-氧化芳樟醇(0.17),可被認(rèn)為是FZ1發(fā)酵雪茄煙葉的特征致香物質(zhì);與刺激性呈顯著正相關(guān)關(guān)系的苯乙醛和鄰苯二甲酸二丁酯的ROAV降低。綜上,FZ1發(fā)酵后巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮B、香葉基丙酮、茄酮和植物醇對香氣貢獻增大,可被認(rèn)為在FZ1提高雪茄煙葉香氣品質(zhì)中發(fā)揮了重要作用。

3 討論

雪茄中性致香成分含量是其香吃味形成的關(guān)鍵因素,研究雪茄煙葉中各組分及香氣物質(zhì)含量對判斷煙葉品質(zhì)有重要參考作用。利用微生物發(fā)酵可將煙葉中的大分子化合物轉(zhuǎn)化生成醇類、醛類、酸類、酯類和酮類等香味成分,對于提升煙葉吸食品質(zhì)具有重要價值和意義。芽孢桿菌屬(Bacillus)是煙葉發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌屬[22,25-26],瞿嬌嬌等[6]利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵煙葉,其醇、酸和酯類含量分別增加28.15%、102.66%和22.29%,香氣提高,刺激性減少。毛多斌等[22]用枯草芽孢桿菌發(fā)酵低等次煙葉,醛類、酮類、醇類和呋喃類香味成分含量分別增加6.5%、8.5%、8.2%和10.7%。研究將分離自進口雪茄煙支的地衣芽孢桿菌FZ1用于發(fā)酵雪茄煙葉,中性致香成分總量增加,其中,酮類、醇類、烯烴類、酚類等中性致香成分含量分別增加2.68%、4.11%、2.42%和0.26%;此外相比未接菌的雪茄煙葉新增加6-甲基-5-庚烯-2-酮、(S)-氧化芳樟醇和香葉基芳樟醇3種致香成分,分別為具有青草香、柑桔樣的香氣和有較弱的花香和木香,讓FZ1發(fā)酵雪茄煙葉后香氣更飽滿、豐富。微生物發(fā)酵煙葉后香氣的增加與其產(chǎn)生的纖維素酶、淀粉酶、果膠酶和蛋白酶等對煙葉中大分子化合物的分解和轉(zhuǎn)化有關(guān),繼而促進了致香成分的產(chǎn)生和積累[27-28]。李寧等[29]將蠟狀芽孢桿菌添加到雪茄煙葉表面進行人工發(fā)酵后,蛋白酶活性增高,雪茄煙葉感官品質(zhì)改善明顯。李志豪等[30]將通過接種產(chǎn)木聚糖酶的蠟狀芽孢桿菌可以降低煙葉纖維素,提升香氣等感官品質(zhì)。顏克亮等[31]從進口煙葉分離出的產(chǎn)解淀粉芽孢桿菌能產(chǎn)多種復(fù)合酶,所制成的生物制劑可使煙葉糖氮比、糖堿比更趨于協(xié)調(diào),同時香氣品質(zhì)得到一定的提升。研究結(jié)果表明,經(jīng)地衣芽孢桿菌FZ1發(fā)酵后類胡蘿卜素、類西柏烷類和葉綠素等大分子化合物的降解產(chǎn)物含量均有較大提升,可能是菌體分泌出可降解這些大分子的酶類,與蒿洪欣等[32]的研究結(jié)果一致,發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌可降解類胡蘿卜素并產(chǎn)生明顯香味。接種地衣芽孢桿菌FZ1發(fā)酵雪茄煙葉后香氣品質(zhì)明顯改善,刺激性減少,但香氣形成的具體機制還有待深入研究。

4 結(jié)論

通過人工接種分離自進口雪茄煙支中的地衣芽孢桿菌FZ1菌株發(fā)酵雪茄煙葉,煙葉香氣更加豐富飽滿,刺激性降低。香氣總量明顯提高,增加成分以烯烴類、酮類和醇類為主,包括香葉基丙酮、金合歡基丙酮、2,6,6-三甲基-2-環(huán)己烯-1,4-二酮、異佛爾酮、巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮B、6-甲基-5-庚烯二酮、β-大馬酮、茄酮和新植二烯等。其中,新植二烯、金合歡基丙酮、茄酮、香葉基丙酮、2,4-二叔丁基苯酚和植物醇是FZ1發(fā)酵雪茄煙葉的關(guān)鍵差異致香成分。