孫 暢, 宋鵬煒, 李翹楚, 王紅艷

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙臺研究院, 山東 煙臺 264670)

0 引言

【研究意義】裂褶菌(Schizophyllumcommune)又稱白參、樹花和雞毛菌等,隸屬于真菌門擔(dān)子菌綱傘菌目裂褶菌科裂褶菌屬(Schizophyllum),是一種珍貴的藥食兩用菌[1-2]。裂褶菌為木腐菌,自然狀態(tài)下一般于春秋季生于闊葉樹及針葉樹的枯枝及腐木上,廣泛分布于世界各地,在我國主要分布于河北、黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古及云南等20余個省(區(qū)、市)。裂褶菌子實(shí)體不僅味道鮮美,且富含蛋白質(zhì)、免疫性多糖、多種人體必需氨基酸和微量元素[3-6],具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥及抗疲勞等多種功效,尤其是裂褶菌多糖因具有藥用和保健價(jià)值而成為研究熱點(diǎn)[7-10]。裂褶菌已經(jīng)實(shí)現(xiàn)人工栽培,但仍存在生產(chǎn)周期長、生物轉(zhuǎn)化率低、栽培規(guī)模小、產(chǎn)量及品質(zhì)不穩(wěn)定等問題,導(dǎo)致其活性產(chǎn)物的開發(fā)利用受到限制。因此,提高裂褶菌菌絲體產(chǎn)量對于其活性產(chǎn)物的開發(fā)利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】液體發(fā)酵技術(shù)是獲得裂褶菌菌絲體和發(fā)酵產(chǎn)物的重要手段,此方式具有生產(chǎn)周期短、不受季節(jié)和地域的限制、成本低等優(yōu)勢,因此探索裂褶菌液體發(fā)酵條件可為規(guī)?；木z體生產(chǎn)及活性產(chǎn)物的開發(fā)利用提供技術(shù)支持。目前,國內(nèi)對裂褶菌液體發(fā)酵的研究已有少量報(bào)道[11-15],冀頤之等[13]研究確定裂褶菌產(chǎn)糖的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為葡萄糖45 g/L、酵母膏3 g/L、 KH2PO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L,在此條件下裂褶菌菌絲體最大得率為20.75 g/L;邴雪等[14]研究表明,當(dāng)培養(yǎng)基碳源為玉米淀粉,氮源為酵母浸粉,pH 4時,發(fā)酵液中裂褶菌素的產(chǎn)量最高,達(dá)2.13 mg/mL。【研究切入點(diǎn)】已有研究均以胞外多糖產(chǎn)量為指標(biāo)對培養(yǎng)基成分或培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,而有關(guān)培養(yǎng)基配方對菌絲體產(chǎn)量影響的研究鮮見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用搖瓶培養(yǎng)和正交試驗(yàn)方法,以菌絲體產(chǎn)量為篩選指標(biāo),對1株野生裂褶菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)基重要碳源、氮源及生長因子進(jìn)行優(yōu)化,探索液體發(fā)酵條件對該裂褶菌菌絲體生長的影響,以期為菌絲體的批量生產(chǎn)及其胞內(nèi)活性產(chǎn)物開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 裂褶菌菌株 為野生菌株,由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺研究院分離保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

1) 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g及水1 000 mL,pH自然。

2) 種子培養(yǎng)基。土豆浸粉 8 g、蛋白胨 2 g、葡萄糖 20 g、牛肉膏 2 g、酵母膏 2 g、MgSO4·7H2O 1 g及KH2PO42 g及水1 000 mL,pH 6.0。

3) 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)。葡萄糖 20 g、酵母膏 6 g、VB10.001 g、MgSO4·7H2O 1 g及KH2PO42 g,水1 000 mL,pH 6.0。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 CR21GⅢ冷凍離心機(jī),Hitachi Koki公司;電子天平,賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;超凈工作臺,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;高壓蒸汽滅菌器,上海申安醫(yī)療器械廠;電熱鼓風(fēng)干燥箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;SFY-10L發(fā)酵罐,鎮(zhèn)江市江大科技有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 種子液的制備 將裂褶菌菌種接種到PDA平板上,25 ℃培養(yǎng)3～5 d。用直徑1 cm的打孔器,打取4個菌絲塊,接種到裝液量為150 mL/250 mL的種子培養(yǎng)基中,于25 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)5 d。按5%接種量接種于新的種子培養(yǎng)基中,于25 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)5 d即得到新鮮的種子液。

1.2.2 最適碳源、氮源及生長因子的篩選 取種子液以5%的接種量接種于碳源、氮源和生長因子篩選培養(yǎng)基中,于25 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)7 d,以菌絲體干質(zhì)量為考察指標(biāo)篩選最適碳源、氮源及生長因子。菌絲體產(chǎn)量測定:將發(fā)酵液6 000 r/min離心10 min,取沉淀,用蒸餾水洗滌3次,放置50 ℃烘箱中烘干至恒重,然后稱重即得。

1) 碳源。設(shè)4個處理,在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基其他原料不變的情況下,改變培養(yǎng)基中的碳源(葡萄糖)分別為淀粉、蔗糖、麥芽糖及乳糖,質(zhì)量濃度20 g/L;以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為對照(CK),下同。

2) 氮源。設(shè)4個處理,在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基其他原料不變的情況下,改變氮源(土豆浸粉)分別為蛋白胨、牛肉膏、酵母膏及大豆蛋白胨,質(zhì)量濃度6 g/L。

3) 生長因子。設(shè)4個處理,參照文獻(xiàn)[16]的方法,在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基其他原料不變的情況下,改變生長因子(VB1)分別為油酸、L-谷氨酸、α-萘乙酸及3-吲哚丁酸,質(zhì)量濃度1 mg/L。

1.2.3 單因素試驗(yàn) 在確定最佳碳源、氮源及生長因子基礎(chǔ)上,以菌絲干質(zhì)量為考察指標(biāo)分別對其最適濃度進(jìn)行篩選。

1) 碳源。設(shè)5個處理(Z1～Z5),分別為10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L和50 g/L。

2) 氮源。設(shè)5個處理(B1～B5),分別為4 g/L、6 g/L、8 g/L、10 g/L和12 g/L。

3) 生長因子。設(shè)5個處理(L1～L6),分別為0.5 mg/L、1 mg/L、1.5 mg/L、2 mg/L、2.5 mg/L和3.0 mg/L。250 mL培養(yǎng)瓶的裝液量為150 mL,于25 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)5 d,分別測定其菌絲體的干質(zhì)量。

1.2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化裂褶菌菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)基 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以蔗糖〔A(g/L)〕、牛肉膏〔B(g/L)〕和L-谷氨酸〔C(mg/L)〕為試驗(yàn)主要因素,通過L9(34)正交試驗(yàn)(表1)優(yōu)化高產(chǎn)菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)基配方。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化裂褶菌菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)基的因子與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源、氮源與生長因子處理菌絲體的產(chǎn)量

由圖1可知,不同碳源、氮源與生長因子對裂褶菌菌絲體產(chǎn)量的影響存在差異。

2.1.1 碳源 不同碳源處理裂褶菌菌絲體產(chǎn)量為6.76～12.22 g/L,依次為蔗糖>麥芽糖>葡萄糖>淀粉>乳糖,各因素間存在較大差異。其中,乳糖顯著低于其余碳源,淀粉顯著低于其余碳源;葡萄糖和麥芽糖作為碳源時菌絲體產(chǎn)量無顯著差異;以蔗糖為碳源時菌絲體產(chǎn)量顯著高于其余碳源,故蔗糖為最佳碳源。

2.1.2 氮源 不同氮源處理菌絲體產(chǎn)量為11.52～13.43 g/L,依次為牛肉膏>蛋白胨>酵母膏>大豆蛋白胨>土豆浸粉。其中,土豆浸粉顯著低于其余氮源,蛋白胨、酵母膏和大豆蛋白胨三者之間無顯著差異;牛肉膏顯著高于其余氮源,故牛肉膏為最佳氮源。

注：圖柱上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.1.3 生長因子 不同生長因子處理菌絲體產(chǎn)量為11.79～12.52 g/L,依次為L-谷氨酸>3-吲哚丁酸>α-萘乙酸>VB1>油酸。其中,VB1、α-萘乙酸和油酸間無顯著差異,但均顯著低于其余生長因子;3-吲哚丁酸顯著低于L-谷氨酸;L-谷氨酸顯著高于其余生長因子,故L-谷氨酸為最佳生長因子。

2.2 不同因素處理菌絲體的產(chǎn)量

由圖2可知,裂褶菌菌絲體產(chǎn)量均隨不同因素濃度增加呈先增后降趨勢。

圖2 不同因素處理裂褶菌菌絲體的產(chǎn)量

2.2.1 蔗糖 不同濃度蔗糖處理裂褶菌菌絲體產(chǎn)量為9.70～19.56 g/L,依次為Z4>Z5>Z3>Z2>Z1。Z4菌絲體產(chǎn)量最高;蔗糖濃度繼續(xù)增加,菌絲體產(chǎn)量反而減少。說明,適當(dāng)增加蔗糖濃度有助于菌絲體生長,而蔗糖濃度過高則會抑制菌絲體生長。因此,確定蔗糖濃度30 g/L、40 g/L和50 g/L為高產(chǎn)菌絲體正交試驗(yàn)中碳源的3個水平。

2.2.2 牛肉膏 不同濃度牛肉膏處理裂褶菌菌絲體產(chǎn)量為10.63～14.53 g/L,依次為B3>B4>B2>B5>B1。牛肉膏濃度小于8 g/L時菌絲體產(chǎn)量隨牛肉膏濃度增加而增加;B3(牛肉膏濃度為8 g/L時)菌絲體產(chǎn)量達(dá)最大;牛肉膏濃度超過8 g/L菌絲體產(chǎn)量隨牛肉膏濃度增加而降低。因此,確定牛肉膏濃度6 g/L、8 g/L、10 g/L為高產(chǎn)菌絲體正交試驗(yàn)中氮源的3個水平。

2.2.3 L-谷氨酸 不同濃度L-谷氨酸處理裂褶菌菌絲體產(chǎn)量為9.27～9.78 g/L,依次為L5>L4>L3>L2>L1>L6。當(dāng)L-谷氨酸濃度為0.5～1.5 mg/L時,菌絲體產(chǎn)量隨L-谷氨酸濃度增加而緩慢增加;當(dāng)L-谷氨酸濃度超過1.5 mg/L時,菌絲體產(chǎn)量呈明顯增加;當(dāng)L-谷氨酸濃度為2.5 mg/L時,菌絲體產(chǎn)量達(dá)最大;之后濃度繼續(xù)增加,則菌絲體產(chǎn)量呈下降趨勢。因此,確定1.5 mg/L、2 mg/L、2.5 mg/L為高產(chǎn)菌絲體正交試驗(yàn)中生長因子的3個水平。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化裂褶菌菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)基組合

L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果(表2～4)表明,各處理菌絲體產(chǎn)量為10.05～20.86 g/L,依次為T8>T9>T7>T5>T6>T4>T3>T2>T1,T8(A3B2C1)菌絲體產(chǎn)量最高,T9其次。從K值看出,最優(yōu)培養(yǎng)基組合為A3B2C2,即蔗糖50 g/L、牛肉膏8 g/L、L-谷氨酸2 mg/L。進(jìn)一步對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析和F檢驗(yàn)表明,因素A和因素B對裂褶菌菌絲體產(chǎn)量的影響差異顯著,而因素C對菌絲體產(chǎn)量的影響差異不顯著,校正模型整體具有顯著性。

表2 裂褶菌菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 L9(34)正交試驗(yàn)的均值、極差與最優(yōu)組合

表4 正交試驗(yàn)方差分析

由于根據(jù)K值分析得到的最優(yōu)組合A3B2C2不在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中,對于其實(shí)際生產(chǎn)效果進(jìn)行驗(yàn)證(3次重復(fù))試驗(yàn),結(jié)果表明,利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基,種子液以5%的接種量,250 mL培養(yǎng)瓶裝液量為150 mL,于25 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)7 d,菌絲體產(chǎn)量達(dá)21.51 g/L,是基礎(chǔ)培養(yǎng)基上菌絲體產(chǎn)量(10.55 g/L)的2.03倍,較正交試驗(yàn)最佳處理T8提高3.1%。

3 討論

目前,裂褶菌液體發(fā)酵研究以提高胞外多糖得率為主,提高菌絲體產(chǎn)量以及菌絲體營養(yǎng)方面的研究相對較少。馬布平等[17-18]對裂褶菌培養(yǎng)基進(jìn)行了篩選,但尚未就裂褶菌菌絲生長需要的營養(yǎng)條件進(jìn)行探究。邴雪等[14]研究表明,裂褶菌最佳碳源和氮源分別為玉米淀粉和酵母浸粉;周瑩等[19]研究認(rèn)為,可溶性淀粉和黃豆粉分別為最佳碳、氮源。孫金旭等[20]研究顯示,裂褶菌菌絲體最適的生長因子為油酸。本研究結(jié)果顯示,裂褶菌最適的碳源、氮源和生長因子分別是蔗糖、牛肉膏和L-谷氨酸。不同研究得出的結(jié)論并不一致,其原因可能是研究者選取的裂褶菌菌種不同,或試驗(yàn)時所選取的營養(yǎng)物質(zhì)種類不同導(dǎo)致。

裂褶菌菌絲體含有豐富的多糖等活性物質(zhì),其胞內(nèi)多糖分子量大于胞外多糖[21-22],且具有胞外多糖沒有的生物活性[23]。研究結(jié)果表明,最優(yōu)培養(yǎng)基組合為蔗糖50 g/L+牛肉膏8 g/L+L-谷氨酸2 mg/L+MgSO4·7H2O 1 g/L+KH2PO42 g/L,pH 6.0,利用此培養(yǎng)基,種子液以5%的接種量,250 mL培養(yǎng)瓶裝液量為150 mL,于25 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)7 d,菌絲體產(chǎn)量達(dá)21.51 g/L,是基礎(chǔ)培養(yǎng)基產(chǎn)菌絲體(10.55 g/L)的2.03倍,較正交試驗(yàn)最佳組合A3B2C1提高3.1%。研究結(jié)果為裂褶菌胞內(nèi)活性產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)和開發(fā)利用提供了一定技術(shù)支持,但研究僅對高產(chǎn)菌絲體培養(yǎng)基的主要成分進(jìn)行了優(yōu)化,今后還需從其他培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件及代謝產(chǎn)物的積累等方面開展進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

采用搖瓶培養(yǎng)、單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)方法探究1株野生裂褶菌高產(chǎn)菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方,對發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源、氮源及生長因子進(jìn)行優(yōu)化,篩選出最佳發(fā)酵培養(yǎng)基(蔗糖50 g/L+牛肉膏8 g/L+L-谷氨酸2 mg/L+MgSO4·7H2O 1 g/L+KH2PO42 g/L,pH 6.0),其裂褶菌菌絲體產(chǎn)量達(dá)21.51 g/L,是基礎(chǔ)培養(yǎng)基上菌絲體產(chǎn)量的2.03倍。