周 俊 郭長青 王慶甫

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京 100029；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院筋傷科，北京 100029

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種以膝關(guān)節(jié)疼痛、畸形、僵硬和功能障礙為主要癥狀的下肢骨退行性病變，是導(dǎo)致下肢殘疾的十大常見疾病之一[1-5]。TLRs/NF-κB 通路介導(dǎo)的滑膜炎癥是KOA 的主要病理變化[6-9]。然而KOA 滑膜炎癥的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。外泌體是由細(xì)胞分泌的脂質(zhì)雙層膜小囊泡，可通過其富含的各類miRNA 對于Toll 樣受體2（Toll-like receptor，TLR2）的抑制作用，調(diào)控TLRs/NF-κB 信號通路，參與炎癥反應(yīng)過程[10-13]。本研究擬通過動物實驗，觀察滑膜組織兩種主要組成細(xì)胞的炎性外泌體對于家兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織的影響，探討在KOA 滑膜炎癥過程中兩種滑膜細(xì)胞來源外泌體對于TLRs/NF-κB通路的調(diào)控作用。

1 對象與方法

1.1 實驗動物

健康成年家兔20 只，體重2.0～2.5 kg，購自北京金牧陽實驗動物養(yǎng)殖有限公司，許可證號：SCXK（京）2015-0005。所有家兔均飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)動物實驗中心。清潔級飼養(yǎng)，實驗室平均室溫（22±1）℃，空氣濕度40%～50%。本實驗通過中國中醫(yī)科學(xué)院動物護(hù)理和使用委員會批準(zhǔn)（20193003）。按照《實驗動物護(hù)理和使用指南》福利倫理嚴(yán)格執(zhí)行。

1.2 主要試劑

人成纖維樣滑膜細(xì)胞系及巨噬樣滑膜細(xì)胞系（上海ATCC 細(xì)胞庫，批號：BFN680323）；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（invitrogen，批號：C111965500BT）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（Sigma 公司，批號：L2880）；外泌體提取收集試劑盒（北京恩澤康泰生物科技有限公司，批號：211-9053）；兔基質(zhì)金屬蛋白酶-13（matrix metallo proteinase，MMP-13）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin，IL-1β）、IL-6、酶聯(lián)免疫吸附試驗法試劑盒（abcam，批號：abc187235）；TLR-2、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、髓樣分化因子-88（myeloid differentiation factor-88，MyD88）、TNF 受體相關(guān)因子2（TNF receptor-associated factor 2，traf2）單克隆抗體（abcam，批號：abc434852）；二甲苯、石蠟（北京北化公司，批號：14052930）；蘇木精-伊紅染色試劑（Sigma 公司，批號：Y00030）。

1.3 實驗方法

1.3.1 滑膜細(xì)胞炎性外泌體提取 將兩種滑膜細(xì)胞復(fù)蘇后常規(guī)培養(yǎng)。取3～4 代細(xì)胞，加入5 μl LPS/PBS 溶液（1 μg/ml）干預(yù)24 h 后收集兩種細(xì)胞的上清液，利用試劑盒提取上清液中外泌體，將外泌體與生理鹽水制備成混懸液（濃度為1×107/ml）并置于-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 家兔分組及干預(yù) 用隨機(jī)數(shù)字表法將20 只家兔分為正常組、鹽水組、A 組、B 組、A+B 組。正常組不予處理，A 組于右膝關(guān)節(jié)腔注射A 細(xì)胞外泌體混懸液、B 組注射B 細(xì)胞外泌體混懸液、A+B 組注射兩種外泌體混合混懸液（兩種混懸液按1∶1 混合），鹽水組僅注射生理鹽水。3 次/周，每次0.5 ml，連續(xù)注射2 周。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.1 行為學(xué) 干預(yù)后2 周，采用改良膝骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度指數(shù)（Lequesne MG）對各組家兔局部疼痛、步態(tài)改變、關(guān)節(jié)活動范圍和關(guān)節(jié)腫脹程度的刺激反應(yīng)情況進(jìn)行評估，記錄總評分[14]。

1.4.2 各組家兔血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 及MMP-13 水平 將各組家兔用10%水合氯醛（2 ml/kg）耳緣靜脈注射麻醉后，用采血針采集腹主動脈血15 ml，用半徑10cm 的超速離心機(jī)4℃、3000r/min 離心10min后，取上清液，應(yīng)用試劑盒檢測各組血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 及MMP-13 水平。

1.4.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測滑膜組織中TLR2、P65、MyD88、traf2 蛋白表達(dá) 取10 mg 滑膜組織，剪碎研磨后加入0.2 ml 的蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑混合液；4℃低溫離心機(jī)，12 000 r/min 離心15 min 后，取清液置于新EP 管中，并進(jìn)行標(biāo)記分組。用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定，取適量蛋白進(jìn)行電泳，電泳完成后進(jìn)行電轉(zhuǎn)，將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，將膜完全浸沒在3% BSA-TBST 中室溫輕搖30 min。用3%BSA-TBST 稀釋一抗，參照TLR2、P65、MyD88、traf2及內(nèi)參β-actin 等抗體說明書進(jìn)行一抗標(biāo)記，TBST 清洗4 次后，加入二抗室溫孵育1 h，最后加入ECL 試劑后顯影。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組家兔行為學(xué)Lequesne MG 指數(shù)

正常組及鹽水組干預(yù)前后Lequesne MG 分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。A、B、A+B 組干預(yù)后Lequesne MG 指數(shù)均高于干預(yù)前，且A+B 且高于A組、B 組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組家兔行為學(xué)Lequesne MG 指數(shù)比較（）

表1 各組家兔行為學(xué)Lequesne MG 指數(shù)比較（）

注 與A+B 組比較，aP＜0.05。

2.2 各組家兔血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 及MMP-13 水平比較

正常組與鹽水組家兔血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 及MMP-13 水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；A、B、A+B 組家兔血清中TNF-α、IL-1β、IL-6及MMP-13 水平高于正常組和鹽水組（P＜0.05）；A+B組家兔血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 及MMP-13 水平高于A 組和B 組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組家兔血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 及MMP-13 表達(dá)水平比較（ng/L，）

表2 各組家兔血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 及MMP-13 表達(dá)水平比較（ng/L，）

注 與正常組比較，aP＜0.05；與A 組比較，bP＜0.05；與B 組比較，cP＜0.05。TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-1β：白細(xì)胞介素-1β；IL-6：白細(xì)胞介素-6；MMP-13：基質(zhì)金屬蛋白酶-13。

2.3 各組家兔滑膜組織中TLR2、P65、MyD88、traf2 蛋白表達(dá)量比較

正常組與鹽水組TLR2、P65、MyD88、traf2 蛋白比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；A、B、A+B 組滑膜組織中TLR2、P65、MyD88、traf2 蛋白表達(dá)量均高于正常組（P＜0.05），其中A+B 組滑膜組織中TLR2、P65、MyD88、traf2 蛋白表達(dá)量高于A 組和B 組（P＜0.05），而A 組滑膜組織中TLR2、P65、MyD88、traf2 蛋白表達(dá)量高于B 組（P＜0.05）。見圖1、表3。

圖1 各組家兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織中TLRs/NF-κB 通路相關(guān)蛋白條帶圖

表3 各組家兔滑膜組織中TLRZ、P65、MyD88、traf2 蛋白表達(dá)量比較（）

表3 各組家兔滑膜組織中TLRZ、P65、MyD88、traf2 蛋白表達(dá)量比較（）

注 與正常組比較，aP＜0.05；與A 組比較，bP＜0.05；與B 組比較，cP＜0.05。TLR2：Toll 樣受體2；MyD88：髓樣分化因子-88；traf2：TNF 受體相關(guān)因子2。

3 討論

正常人體膝關(guān)節(jié)滑膜由內(nèi)膜層和內(nèi)膜下層組成，內(nèi)膜層主要由A 型巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞（macrophage-like synoviocytes，MLC）、B 型成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LC）構(gòu)成。兩者功能不同，A 細(xì)胞具有清除代謝產(chǎn)物，分泌炎癥因子的作用；B 細(xì)胞主要功能是分泌透明質(zhì)酸，調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)液平衡[15-18]。NF-κB 是在炎癥反應(yīng)中處于核心地位的核轉(zhuǎn)錄因子，其在細(xì)胞中最常見的家族成員是P65 和P50。各種因素產(chǎn)生的體內(nèi)損傷相關(guān)分子模式可以使Toll樣受體（如TLR2、TLR4）激活，激活后的TLR2 可以與銜接蛋白（如MyD88、traf2 等）結(jié)合形成復(fù)合物，并通過一系列反應(yīng)激活TLRs/NF-κB 信號通路，從而釋放各種下游炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6 和MMP-13等，引起滑膜固有免疫反應(yīng)[19-21]。外泌體可以攜帶其來源細(xì)胞的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及核酸等信息物質(zhì)，并與附近的受體細(xì)胞進(jìn)行生物信號的傳遞，影響局部微環(huán)境，調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白表達(dá)及調(diào)控相關(guān)生物學(xué)過程[22]。

在本研究中，A、B、A+B 組外泌體干預(yù)后的家兔行為學(xué)Lequensne MG 指數(shù)高于干預(yù)前（P＜0.05），并且在外泌體干預(yù)后家兔關(guān)節(jié)出現(xiàn)輕度腫脹，這說明關(guān)節(jié)內(nèi)出現(xiàn)了炎癥反應(yīng)。酶聯(lián)免疫吸附試驗法及蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果提示兩種滑膜細(xì)胞來源的炎性外泌體均可激活家兔滑膜TLRs/NF-κB 信號通路，引起滑膜炎癥反應(yīng)，并進(jìn)一步損傷軟骨，引起家兔的形態(tài)學(xué)改變。其中蛋白質(zhì)印跡法顯示A 細(xì)胞外泌體干預(yù)后的滑膜組織中相關(guān)蛋白表達(dá)量高于B 細(xì)胞，提示A細(xì)胞外泌體比B 細(xì)胞外泌體含有更多的促炎因子。外泌體主要攜帶來自母細(xì)胞的蛋白及其他物質(zhì)，在KOA 中，A 細(xì)胞在損傷相關(guān)分子模式的刺激下不僅釋放促炎因子，而且會釋放多種黏附分子，如血管細(xì)胞黏附分子-1 等[23]；B 細(xì)胞是源于骨髓中的巨噬細(xì)胞，當(dāng)局部產(chǎn)生炎癥時，不僅出現(xiàn)B 細(xì)胞增殖，而且大量循環(huán)系統(tǒng)中的巨噬細(xì)胞在血管細(xì)胞黏附分子-1 的作用下被募集到滑膜組織中[24]，產(chǎn)生局部免疫反應(yīng)，同時釋放的炎癥因子又可以進(jìn)一步促進(jìn)成纖維細(xì)胞增生和產(chǎn)生炎癥[24-25]。可見在KOA 中，A 細(xì)胞是主要的炎癥效應(yīng)細(xì)胞，兩種細(xì)胞不僅都會產(chǎn)生炎癥因子，而且可以通過各自分泌的外泌體在兩者之間形成正反饋調(diào)節(jié)，互相促進(jìn)炎癥程度導(dǎo)致KOA 的進(jìn)一步加重。

綜上，在KOA 疾病進(jìn)展過程中，兩種滑膜細(xì)胞外泌體均可以激活滑膜中TLRs/NF-κB 信號通路，加重KOA 的炎癥程度。為進(jìn)一步認(rèn)識和研究KOA 發(fā)病機(jī)制提供了新的思路和研究基礎(chǔ)。