周 俊 郭長青 王慶甫
1.北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,北京 100029;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院,北京 100029;3.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院筋傷科,北京 100029
膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)是一種以膝關(guān)節(jié)疼痛、畸形、僵硬和功能障礙為主要癥狀的下肢骨退行性病變,是導(dǎo)致下肢殘疾的十大常見疾病之一[1-5]。TLRs/NF-κB 通路介導(dǎo)的滑膜炎癥是KOA 的主要病理變化[6-9]。然而KOA 滑膜炎癥的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。外泌體是由細(xì)胞分泌的脂質(zhì)雙層膜小囊泡,可通過其富含的各類miRNA 對于Toll 樣受體2(Toll-like receptor,TLR2)的抑制作用,調(diào)控TLRs/NF-κB 信號通路,參與炎癥反應(yīng)過程[10-13]。本研究擬通過動物實驗,觀察滑膜組織兩種主要組成細(xì)胞的炎性外泌體對于家兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織的影響,探討在KOA 滑膜炎癥過程中兩種滑膜細(xì)胞來源外泌體對于TLRs/NF-κB通路的調(diào)控作用。
健康成年家兔20 只,體重2.0~2.5 kg,購自北京金牧陽實驗動物養(yǎng)殖有限公司,許可證號:SCXK(京)2015-0005。所有家兔均飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)動物實驗中心。清潔級飼養(yǎng),實驗室平均室溫(22±1)℃,空氣濕度40%~50%。本實驗通過中國中醫(yī)科學(xué)院動物護(hù)理和使用委員會批準(zhǔn)(20193003)。按照《實驗動物護(hù)理和使用指南》福利倫理嚴(yán)格執(zhí)行。
人成纖維樣滑膜細(xì)胞系及巨噬樣滑膜細(xì)胞系(上海ATCC 細(xì)胞庫,批號:BFN680323);DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(invitrogen,批號:C111965500BT);脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(Sigma 公司,批號:L2880);外泌體提取收集試劑盒(北京恩澤康泰生物科技有限公司,批號:211-9053);兔基質(zhì)金屬蛋白酶-13(matrix metallo proteinase,MMP-13)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin,IL-1β)、IL-6、酶聯(lián)免疫吸附試驗法試劑盒(abcam,批號:abc187235);TLR-2、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、髓樣分化因子-88(myeloid differentiation factor-88,MyD88)、TNF 受體相關(guān)因子2(TNF receptor-associated factor 2,traf2)單克隆抗體(abcam,批號:abc434852);二甲苯、石蠟(北京北化公司,批號:14052930);蘇木精-伊紅染色試劑(Sigma 公司,批號:Y00030)。
1.3.1 滑膜細(xì)胞炎性外泌體提取 將兩種滑膜細(xì)胞復(fù)蘇后常規(guī)培養(yǎng)。取3~4 代細(xì)胞,加入5 μl LPS/PBS 溶液(1 μg/ml)干預(yù)24 h 后收集兩種細(xì)胞的上清液,利用試劑盒提取上清液中外泌體,將外泌體與生理鹽水制備成混懸液(濃度為1×107/ml)并置于-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2 家兔分組及干預(yù) 用隨機(jī)數(shù)字表法將20 只家兔分為正常組、鹽水組、A 組、B 組、A+B 組。正常組不予處理,A 組于右膝關(guān)節(jié)腔注射A 細(xì)胞外泌體混懸液、B 組注射B 細(xì)胞外泌體混懸液、A+B 組注射兩種外泌體混合混懸液(兩種混懸液按1∶1 混合),鹽水組僅注射生理鹽水。3 次/周,每次0.5 ml,連續(xù)注射2 周。
1.4.1 行為學(xué) 干預(yù)后2 周,采用改良膝骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度指數(shù)(Lequesne MG)對各組家兔局部疼痛、步態(tài)改變、關(guān)節(jié)活動范圍和關(guān)節(jié)腫脹程度的刺激反應(yīng)情況進(jìn)行評估,記錄總評分[14]。
1.4.2 各組家兔血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 及MMP-13 水平 將各組家兔用10%水合氯醛(2 ml/kg)耳緣靜脈注射麻醉后,用采血針采集腹主動脈血15 ml,用半徑10cm 的超速離心機(jī)4℃、3000r/min 離心10min后,取上清液,應(yīng)用試劑盒檢測各組血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 及MMP-13 水平。
1.4.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測滑膜組織中TLR2、P65、MyD88、traf2 蛋白表達(dá) 取10 mg 滑膜組織,剪碎研磨后加入0.2 ml 的蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑混合液;4℃低溫離心機(jī),12 000 r/min 離心15 min 后,取清液置于新EP 管中,并進(jìn)行標(biāo)記分組。用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定,取適量蛋白進(jìn)行電泳,電泳完成后進(jìn)行電轉(zhuǎn),將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上,將膜完全浸沒在3% BSA-TBST 中室溫輕搖30 min。用3%BSA-TBST 稀釋一抗,參照TLR2、P65、MyD88、traf2及內(nèi)參β-actin 等抗體說明書進(jìn)行一抗標(biāo)記,TBST 清洗4 次后,加入二抗室溫孵育1 h,最后加入ECL 試劑后顯影。
采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗;多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
正常組及鹽水組干預(yù)前后Lequesne MG 分比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。A、B、A+B 組干預(yù)后Lequesne MG 指數(shù)均高于干預(yù)前,且A+B 且高于A組、B 組(P<0.05)。見表1。
表1 各組家兔行為學(xué)Lequesne MG 指數(shù)比較()
表1 各組家兔行為學(xué)Lequesne MG 指數(shù)比較()
注 與A+B 組比較,aP<0.05。
正常組與鹽水組家兔血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 及MMP-13 水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);A、B、A+B 組家兔血清中TNF-α、IL-1β、IL-6及MMP-13 水平高于正常組和鹽水組(P<0.05);A+B組家兔血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 及MMP-13 水平高于A 組和B 組(P<0.05)。見表2。
表2 各組家兔血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 及MMP-13 表達(dá)水平比較(ng/L,)
表2 各組家兔血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 及MMP-13 表達(dá)水平比較(ng/L,)
注 與正常組比較,aP<0.05;與A 組比較,bP<0.05;與B 組比較,cP<0.05。TNF-α:腫瘤壞死因子-α;IL-1β:白細(xì)胞介素-1β;IL-6:白細(xì)胞介素-6;MMP-13:基質(zhì)金屬蛋白酶-13。
正常組與鹽水組TLR2、P65、MyD88、traf2 蛋白比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);A、B、A+B 組滑膜組織中TLR2、P65、MyD88、traf2 蛋白表達(dá)量均高于正常組(P<0.05),其中A+B 組滑膜組織中TLR2、P65、MyD88、traf2 蛋白表達(dá)量高于A 組和B 組(P<0.05),而A 組滑膜組織中TLR2、P65、MyD88、traf2 蛋白表達(dá)量高于B 組(P<0.05)。見圖1、表3。
圖1 各組家兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織中TLRs/NF-κB 通路相關(guān)蛋白條帶圖
表3 各組家兔滑膜組織中TLRZ、P65、MyD88、traf2 蛋白表達(dá)量比較()
表3 各組家兔滑膜組織中TLRZ、P65、MyD88、traf2 蛋白表達(dá)量比較()
注 與正常組比較,aP<0.05;與A 組比較,bP<0.05;與B 組比較,cP<0.05。TLR2:Toll 樣受體2;MyD88:髓樣分化因子-88;traf2:TNF 受體相關(guān)因子2。
正常人體膝關(guān)節(jié)滑膜由內(nèi)膜層和內(nèi)膜下層組成,內(nèi)膜層主要由A 型巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(macrophage-like synoviocytes,MLC)、B 型成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes,F(xiàn)LC)構(gòu)成。兩者功能不同,A 細(xì)胞具有清除代謝產(chǎn)物,分泌炎癥因子的作用;B 細(xì)胞主要功能是分泌透明質(zhì)酸,調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)液平衡[15-18]。NF-κB 是在炎癥反應(yīng)中處于核心地位的核轉(zhuǎn)錄因子,其在細(xì)胞中最常見的家族成員是P65 和P50。各種因素產(chǎn)生的體內(nèi)損傷相關(guān)分子模式可以使Toll樣受體(如TLR2、TLR4)激活,激活后的TLR2 可以與銜接蛋白(如MyD88、traf2 等)結(jié)合形成復(fù)合物,并通過一系列反應(yīng)激活TLRs/NF-κB 信號通路,從而釋放各種下游炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6 和MMP-13等,引起滑膜固有免疫反應(yīng)[19-21]。外泌體可以攜帶其來源細(xì)胞的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及核酸等信息物質(zhì),并與附近的受體細(xì)胞進(jìn)行生物信號的傳遞,影響局部微環(huán)境,調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白表達(dá)及調(diào)控相關(guān)生物學(xué)過程[22]。
在本研究中,A、B、A+B 組外泌體干預(yù)后的家兔行為學(xué)Lequensne MG 指數(shù)高于干預(yù)前(P<0.05),并且在外泌體干預(yù)后家兔關(guān)節(jié)出現(xiàn)輕度腫脹,這說明關(guān)節(jié)內(nèi)出現(xiàn)了炎癥反應(yīng)。酶聯(lián)免疫吸附試驗法及蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果提示兩種滑膜細(xì)胞來源的炎性外泌體均可激活家兔滑膜TLRs/NF-κB 信號通路,引起滑膜炎癥反應(yīng),并進(jìn)一步損傷軟骨,引起家兔的形態(tài)學(xué)改變。其中蛋白質(zhì)印跡法顯示A 細(xì)胞外泌體干預(yù)后的滑膜組織中相關(guān)蛋白表達(dá)量高于B 細(xì)胞,提示A細(xì)胞外泌體比B 細(xì)胞外泌體含有更多的促炎因子。外泌體主要攜帶來自母細(xì)胞的蛋白及其他物質(zhì),在KOA 中,A 細(xì)胞在損傷相關(guān)分子模式的刺激下不僅釋放促炎因子,而且會釋放多種黏附分子,如血管細(xì)胞黏附分子-1 等[23];B 細(xì)胞是源于骨髓中的巨噬細(xì)胞,當(dāng)局部產(chǎn)生炎癥時,不僅出現(xiàn)B 細(xì)胞增殖,而且大量循環(huán)系統(tǒng)中的巨噬細(xì)胞在血管細(xì)胞黏附分子-1 的作用下被募集到滑膜組織中[24],產(chǎn)生局部免疫反應(yīng),同時釋放的炎癥因子又可以進(jìn)一步促進(jìn)成纖維細(xì)胞增生和產(chǎn)生炎癥[24-25]。可見在KOA 中,A 細(xì)胞是主要的炎癥效應(yīng)細(xì)胞,兩種細(xì)胞不僅都會產(chǎn)生炎癥因子,而且可以通過各自分泌的外泌體在兩者之間形成正反饋調(diào)節(jié),互相促進(jìn)炎癥程度導(dǎo)致KOA 的進(jìn)一步加重。
綜上,在KOA 疾病進(jìn)展過程中,兩種滑膜細(xì)胞外泌體均可以激活滑膜中TLRs/NF-κB 信號通路,加重KOA 的炎癥程度。為進(jìn)一步認(rèn)識和研究KOA 發(fā)病機(jī)制提供了新的思路和研究基礎(chǔ)。