李成成，黃義德

（福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117）

畢赤酵母（Pichia pastoris）因其生長快、蛋白表達效率高，且易于進行分子遺傳學(xué)操作等優(yōu)良特點，被認為是工業(yè)上最重要的外源蛋白生產(chǎn)宿主之一。畢赤酵母表達系統(tǒng)作為一種優(yōu)秀的真核表達系統(tǒng)，不僅能夠有效的對外源蛋白基因進行轉(zhuǎn)錄和翻譯，而且擁有蛋白質(zhì)折疊、糖基化和分泌的必要細胞機制，可以用來生產(chǎn)與天然蛋白在生理、生化功能上非常接近的蛋白。外源蛋白可由醇氧化酶1（alcohol oxidase 1,AOX1）基因啟動子誘導(dǎo)表達，并且其自身蛋白分泌很少，有利于外源蛋白表達后純化，外源基因是和表達載體一起整合到畢赤酵母的染色體上，因此不會隨細胞分裂而丟失，可穩(wěn)定存在。畢赤酵母的強好氧性以及發(fā)酵產(chǎn)物在高密度發(fā)酵過程中積累后，不會對自身產(chǎn)生太多的毒副作用，因此非常適合進行大規(guī)模的高密度發(fā)酵。

1 畢赤酵母表達系統(tǒng)簡介

1.1 畢赤酵母的遺傳學(xué)特性

畢赤酵母是可以甲醇為唯一的碳源和能源的甲基營養(yǎng)型酵母，其基因組中含有兩個編碼醇氧化酶(alcohol oxidase,AOX)的基因：AOX1和AOX2。在甲醇存在下，AOX1和AOX2轉(zhuǎn)錄并最終產(chǎn)生大量的醇氧化酶，但AOX1表達更高，這種表型稱為甲醇利用型（methanol utilizing plus phenotype,Mut+）（野生型）。因此，通過敲除AOX1基因，細胞在甲醇為碳源的環(huán)境中，生長速率會急劇減慢。這種表型稱為甲醇利用緩慢型（methanol utilization slow phenotype,MutS)。當(dāng)兩個基因都敲除時，菌株無法在甲醇上生長，稱為甲醇不利用型（methanol utilizing minus phenotype,Mut-）。

1.2 畢赤酵母表達系統(tǒng)的構(gòu)成

1.2.1 宿主菌

目前用于外源蛋白表達的畢赤酵母宿主菌有：Mut+甲醇利用型GS115、X-33、SMD1165、SMD1163及SMD1168等大多宿主菌；MutS甲醇利用緩慢型KM71；Mut-甲醇不利用型MC100-3。所有這些菌株，甚至是Mut-菌株，都保留了AOX1啟動子誘導(dǎo)高水平表達的能力[1]。SMD1163 (his4 pep4 prb1)、SMD1165(his4 prb1) 和 SMD1168 (his4 pep4)是蛋白酶缺陷菌株，這些菌株可使外源蛋白更穩(wěn)定，不易被降解，但這些菌株不如野生型菌株那么有活力，也不易轉(zhuǎn)化[2,3]，因此只有在采取其他減少蛋白降解的措施無法達到滿意的效果時，才建議使用蛋白酶缺陷菌株。GS115、KM71、MC100-3、SMD1168、SMD1165和SMD1163菌株是組氨酸營養(yǎng)缺陷型，可用來篩選轉(zhuǎn)化帶有組氨醇脫氫酶基因(histidinol dehydrogenase gene,his4)質(zhì)粒的陽性菌株。常見畢赤酵母菌株、基因型和表現(xiàn)型如表1所示。

表1 常見畢赤酵母菌株、基因型和表現(xiàn)型

1.2.2 載體

畢赤酵母一般采用整合型穿梭質(zhì)粒作為外源基因的表達載體。表達載體的遺傳操作在大腸桿菌中進行（如載體保存、擴增和構(gòu)建等），通過載體線性化電轉(zhuǎn)酵母感受態(tài)細胞后，載體整合進酵母染色體中，表達外源蛋白。根據(jù)外源蛋白能否分泌表達將載體分為胞內(nèi)表達載體（如pPIC3、pPSC3k、pAO815和pPICZA等）和胞外分泌型表達載體（如pPIC9、pPIC9K、pGAPZa、pHIL-S1p和YAM7SP6等）[4]。這些載體均包含三個序列元件：5′區(qū)的啟動子序列（最常見的是AOX1）和3′區(qū)的轉(zhuǎn)錄終止序列以及一個包含單個或多個克隆位點的限制酶切序列，這是插入目的基因所必需的，這對于信使RNA的加工和多腺苷酸化至關(guān)重要。這些載體還會包含一個耐藥基因，如Kan，Shble，Bsd，Amp或FLD1，它們分別對geneticin，zeocin，blasticidin，ampicillin和甲醛具有抗性[5]。同時，根據(jù)宿主菌的營養(yǎng)缺陷型載體還可攜帶如HIS4，MET2，ADE1，ARG4，URA3，URA5，GUT1基因以使轉(zhuǎn)化后的酵母重新獲得野生型的表型，利用這些基因或藥物耐藥性基因來作為選擇標(biāo)記，可便于篩選陽性轉(zhuǎn)化子[3]。此外，根據(jù)外源蛋白是否需要誘導(dǎo)表達，還可分為誘導(dǎo)型表達載體（如pPICZ、pPIC6、pPIC9K等）和組成型表達載體（如pGAPZ、pAOS1等）[6]。

2 畢赤酵母高密度發(fā)酵策略

畢赤酵母的高密度發(fā)酵是在普通發(fā)酵的基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化并調(diào)控細胞的發(fā)酵條件，使細胞在高細胞密度下產(chǎn)生更多的外源蛋白。畢赤酵母的高密度發(fā)酵一般分兩個階段進行，首先在碳源為甘油或葡萄糖的培養(yǎng)基中進行的生長階段，積累足夠的細胞密度和生物量，然后再將碳源切換至甲醇進行誘導(dǎo)表達目標(biāo)蛋白的發(fā)酵階段。這種方式可以提高外源蛋白的表達水平，并且使得畢赤酵母在較短時間內(nèi)積累高濃度的目標(biāo)蛋白。在影響畢赤酵母高密度發(fā)酵的因素中，培養(yǎng)基成分、溫度、pH值、溶氧量、泡沫、甲醇的補料流加方式和培養(yǎng)時間等因素均會在一定程度上影響到外源蛋白的產(chǎn)量。

2.1 培養(yǎng)基成分對發(fā)酵影響

在高密度發(fā)酵中，培養(yǎng)基的成分會直接影響畢赤酵母細胞的生長以及外源基因的表達，同時也會影響工程菌的遺傳穩(wěn)定性。因此，畢赤酵母高密度發(fā)酵通常會針對不同的研究目的和外源蛋白特性，在選擇或設(shè)計培養(yǎng)基時進行優(yōu)化，以達到最佳的發(fā)酵效果。通常在進行畢赤酵母高密度發(fā)酵時，由于一些分泌型外源蛋白對蛋白酶的敏感度較高，容易被降解。針對這種情況，通常在畢赤酵母高密度發(fā)酵時，會選擇添加含有蛋白胨和酵母粉的培養(yǎng)基，或者添加1%酪蛋白水解物以防止或降低外源蛋白的降解[7]。

在畢赤酵母高密度發(fā)酵過程中使用到的一些化學(xué)限定培養(yǎng)基包括有：Invitrogen公司提供的BSM培養(yǎng)基、d'Anjou和同事所提出的d'Anjou培養(yǎng)基[8]、由Stratton及其同事所制定的FM22培養(yǎng)基[9]和由Matthews及其同事為畢赤酵母設(shè)計了一種營養(yǎng)豐富的RDM培養(yǎng)基[10]。這些培養(yǎng)基經(jīng)過配制均可在補料分批培養(yǎng)中獲得高的細胞密度，但是這類培養(yǎng)基不適宜進行混合高溫滅菌處理，否則會產(chǎn)生沉淀現(xiàn)象。在高密度發(fā)酵過程中，如果加入的微量元素含量過高同樣也會導(dǎo)致沉淀生成，給發(fā)酵過程帶來困擾，因此對培養(yǎng)基進行優(yōu)化在畢赤酵母高密度發(fā)酵生產(chǎn)中是非常重要的。

此外，高水平的甲醇（濃度高于5%）對細胞活力毒性很大，可導(dǎo)致代謝中間產(chǎn)物甲醛和過氧化氫的積累，從而使得生產(chǎn)停止[11]，另一方面，低水平的甲醇會觸發(fā)外源蛋白的水解降解，導(dǎo)致生產(chǎn)力降低[12]，一些研究文章中所使用過的最佳甲醇濃度有0.5%、1%、2%、2.5%、3%等[5]。山梨醇不會誘導(dǎo)或抑制AOX啟動子，可與甲醇一起作為混合底物使用，混合底物的使用提高了生產(chǎn)率和細胞密度，并減少了誘導(dǎo)時間[13]。此外，山梨醇與甲醇的共同喂養(yǎng)減少了中間代謝物的毒性作用和氧消耗，同時也減少了特定蛋白酶的產(chǎn)生，也消除了乳酸的積累期[14]。一些研究表明甲醇/山梨糖醇共喂會增加重組蛋白的表達[15-18]，根據(jù)其他研究的結(jié)果2.5%甲醇與1%山梨糖醇[19]、2%甲醇與0.5%山梨糖醇[20]和2%甲醇與1%山梨糖醇[21]被認為對搖瓶培養(yǎng)中外源蛋白的產(chǎn)量達到最高是最佳的。表2為用于畢赤酵母生長發(fā)酵的化學(xué)限定培養(yǎng)基。

表2 用于畢赤酵母的化學(xué)限定培養(yǎng)基

2.2 溫度對發(fā)酵的影響

溫度是對畢赤酵母的生長和細胞代謝有著重要影響的因素。一般畢赤酵母所需的生長溫度為28～30 ℃，高于32 ℃可能導(dǎo)致細胞死亡。一些研究表明，畢赤酵母在較低的培養(yǎng)溫度下發(fā)酵可以改善靶蛋白產(chǎn)量，降低細胞死亡率，減少死亡后細胞內(nèi)蛋白酶向培養(yǎng)基中釋放，進而減少外源蛋白的水解[22,23]，而且在較低的培養(yǎng)溫度下，蛋白質(zhì)折疊應(yīng)力通常會降低，從而使得畢赤酵母能夠更加有效地分泌外源蛋白[24]。

2.3 pH值對發(fā)酵的影響

pH 值在畢赤酵母的發(fā)酵過程中，不僅會影響菌體的生長狀態(tài)，而且對外源蛋白的表達也會產(chǎn)生重要影響。pH值對畢赤酵母的影響主要包括以下方面：⑴影響細胞內(nèi)酶的活性，進而影響細胞的新陳代謝，從而使外源蛋白的表達也受到影響；⑵影響細胞膜的通透性，對細胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)和排出代謝產(chǎn)物時產(chǎn)生一定的影響；⑶pH值會對培養(yǎng)基中成分和細胞的代謝產(chǎn)物的離解產(chǎn)生影響，從而對細胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)造成影響；⑷pH值也可能對細胞的代謝過程產(chǎn)生影響，使細胞代謝產(chǎn)物的含量發(fā)生改變[7]。另外，在高密度發(fā)酵過程中，為了減少外源蛋白被蛋白酶降解，應(yīng)避開蛋白酶作用的最適pH值，將pH值設(shè)定在偏離外源蛋白等電點處，也會提高外源蛋白的收獲率。

2.4 溶氧量對發(fā)酵的影響

培養(yǎng)基中溶氧量（DO）對于好氧微生物的生長是非常重要的。畢赤酵母的高密度發(fā)酵需要消耗大量的氧氣，尤其是在利用甲醇時，溶氧不足會造成有害代謝產(chǎn)物在細胞中積累，產(chǎn)生有害影響。在高密度發(fā)酵中，使用發(fā)酵罐進行培養(yǎng)可以顯著提高外源蛋白的表達水平，通?？筛叱鰮u瓶發(fā)酵的10～100倍，如郭永志等人使用發(fā)酵罐生產(chǎn)重組胰島素比在搖瓶中的產(chǎn)量高了5～10倍[25]，這是因為發(fā)酵罐相對于搖瓶會有更高的DO，會更有利于細胞生長及外源蛋白的表達。為了盡可能地提高培養(yǎng)基的溶氧量，生產(chǎn)上采用將純氧和空氣按照一定的比例混合這種通氣方式來提高供氧，但是氧濃度太高（超過60%）細胞就會發(fā)生氧中毒，一般為保證足夠的供氧DO會保持在20%～30%之間。

2.5 泡沫對發(fā)酵的影響

在高密度發(fā)酵中泡沫的產(chǎn)生是因為需要強烈的攪拌和曝氣以及培養(yǎng)基中存在表面活性物質(zhì)而產(chǎn)生，它對發(fā)酵生產(chǎn)的影響包括：⑴泡沫的形成會降低培養(yǎng)物表面的氣體交換效率，因為它會在培養(yǎng)物和容器頂部空間的氣體之間會形成屏障；⑵當(dāng)氣泡破裂時會產(chǎn)生剪切力，損害細胞和（或）任何分泌的蛋白質(zhì)；⑶泡沫會將細胞和培養(yǎng)基帶到泡沫相中，從而導(dǎo)致生產(chǎn)率降低；⑷泡沫也可能導(dǎo)致生產(chǎn)中無菌性的喪失。消泡可以采取添加消泡劑、機械攪拌或超聲波的形式，最常用的方法是添加化學(xué)消泡劑，Routledge等人的研究表明添加消泡劑可以提高畢赤酵母生產(chǎn)的重組蛋白的總產(chǎn)量[26]。

2.6 甲醇的補料流加方式對發(fā)酵的影響

甲醇在畢赤酵母的發(fā)酵過程中起到兩種作用：一是作為碳源提供能量，二是作為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)外源蛋白的表達。因此，在發(fā)酵過程中甲醇的補加方式、用量和發(fā)酵時間都會影響到細胞的生長狀態(tài)以及外源蛋白的產(chǎn)量。甲醇供應(yīng)不足則會限制外源蛋白合成導(dǎo)致其表達量偏低，而如果甲醇過量則可能會對菌體造成毒性影響，進而抑制生長和表達，因此需要根據(jù)具體情況選擇適宜的甲醇補加策略、用量和誘導(dǎo)時間，以最大化外源蛋白的表達同時保證菌體的生長和健康狀態(tài)。目前，有幾種方法可以用于調(diào)節(jié)甲醇的添加過程，這包括使用在線和離線甲醇監(jiān)控儀器來控制流量、通過溶氧水平來控制甲醇的添加以及將甲醇與其他碳源混合后流加等，采用這些方法可以使甲醇的添加更加科學(xué)合理，從而提高外源蛋白的表達效率。

2.7 培養(yǎng)時間對發(fā)酵的影響

培養(yǎng)時間是在畢赤酵母表達系統(tǒng)中獲得最高蛋白表達水平的最關(guān)鍵因素之一，在畢赤酵母表達系統(tǒng)中，生產(chǎn)時間相對較長（約100 h）。培養(yǎng)時間與酵母細胞的數(shù)量和目標(biāo)蛋白的降解程度有關(guān)，有研究表明，巴斯德畢赤酵母細胞的最高生長密度是培養(yǎng)96 h，而最高蛋白表達發(fā)生在48 h[11]，這表明較長的培養(yǎng)時間很可能會導(dǎo)致所表達蛋白被水解消化，也有其他的研究表明最佳蛋白質(zhì)表達時間發(fā)生在培養(yǎng)72～96 h[20,21]。

3 展望

畢赤酵母表達系統(tǒng)是分子生物學(xué)中生產(chǎn)重組蛋白的最常用和標(biāo)準(zhǔn)工具之一，具有諸多優(yōu)點，適合于工業(yè)化大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)，但需要一定程度的工藝優(yōu)化才能實現(xiàn)目標(biāo)蛋白的最大產(chǎn)量。在畢赤酵母表達系統(tǒng)中生產(chǎn)重組蛋白的最佳條件因靶蛋白而異，需要針對不同的外源蛋白采用特定的發(fā)酵工藝條件進行優(yōu)化，與此同時，要尋找有效的方法來防止目標(biāo)蛋白的降解，這些方法包括改進表達系統(tǒng)、優(yōu)化培養(yǎng)條件、添加蛋白穩(wěn)定劑、使用特定的蛋白酶抑制劑等多種途徑。目前在影響畢赤酵母分泌效率因素方面的研究成果仍然很少，可以從提高蛋白質(zhì)分泌性能方面著手來優(yōu)化外源蛋白的表達。相信隨著新的研究成果的不斷出現(xiàn)，該系統(tǒng)也會越來越完善，其在分子生物學(xué)和工業(yè)應(yīng)用等領(lǐng)域也將發(fā)揮出更大的作用。