郭曉丹 馬振禹 王晨靜 韓天云 張飛燕

肺癌細胞惡性增殖及轉(zhuǎn)移導(dǎo)致病人術(shù)后5年生存率降低,針對肺癌發(fā)生發(fā)展機制的研究可改善肺癌病人預(yù)后[1]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)MIR205HG在宮頸癌和頭頸部鱗狀細胞癌組織中上調(diào)表達,敲減MIR205HG對宮頸癌和頭頸部鱗狀細胞癌細胞增殖及遷移具有抑制作用,并促進宮頸癌細胞凋亡[2-3]。但MIR205HG在肺癌中的表達及其可能作用機制尚未明確。starBase預(yù)測顯示MIR205HG可能是微小RNA-299-3p(microRNA-299-3p,miR-299-3p)上游的調(diào)控基因,研究表明,miR-299-3p在肺癌組織中下調(diào)表達[4]。miR-299-3p在甲狀腺癌、宮頸癌、肝癌等腫瘤中低表達,上調(diào)miR-299-3p表達可抑制細胞增殖及促進細胞凋亡[5-7]。本研究比較分析MIR205HG在肺癌細胞中的表達變化及其對細胞增殖、凋亡的影響,進一步探討MIR205HG與miR-299-3p在肺癌發(fā)生過程中的相互作用關(guān)系。

對象與方法

一、對象

二、方法

1.試劑:H1299、A549、SPC-A1、BEAS-2B購于美國ATCC。Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen;DMEM培養(yǎng)基購于Gibco;噻唑藍(MTT)購于北京鼎國昌盛生物;細胞凋亡檢測試劑盒購于上海雅吉生物;CyclinD1、Bcl-2、p21、Bax抗體購于美國Abcam;Trizol、逆轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR試劑盒購于美國Thermo Fisher;miR-299-3p mimics、miR-NC、si-MIR205HG、si-NC、anti-miR-299-3p、anti-miR-NC購于上海吉瑪制藥;引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

2.實驗分組:采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將si-MIR205HG、si-NC、miR-299-3p mimics、miR-NC、si-MIR205HG與anti-miR-299-3p、si-MIR205HG與anti-miR-NC轉(zhuǎn)染H1299細胞,記為si-MIR205HG組、si-NC組、miR-299-3p組、miR-NC組、si-MIR205HG+anti-miR-299-3p組、si-MIR205HG+anti-miR-NC組。

3.qRT-PCR:采用Trizol法提取肺癌H1299細胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。引物序列如下:MIR205HG正向5'-GACCGTTGTTAGCACGCCTT-3',反向5'-CACGTATCGGTCCGTGTTGG-3';miR-299-3p正向5'-TTCAGTGTAAACATCCTCGACTG-3',反向5'-TGGCAATGTCGTGGAGTCG-3';GAPDH正向5'-CCACAGTCCATGCCATCAC-3',反向5'-GCTTCACCACCTTCTTGATG-3';U6正向5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3',反向5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。以GAPDH和U6作為內(nèi)參,采用2-ΔΔCq方法計算MIR205HG、miR-299-3p相對表達量。

圖1 MIR205HG與miR-299-3p互補的核苷酸序列

5.MTT:H1299細胞培養(yǎng)24小時、48小時、72小時時加入MTT試劑,4小時后去除MTT,與150 μl DMSO室溫孵育5分鐘。酶標(biāo)儀檢測光密度值(OD 490 nm)。

6.流式細胞術(shù):H1299細胞消化后加入200 μl Binding Buffer重懸染色。分析細胞凋亡率。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié)果

1.MIR205HG和miR-299-3p在肺癌組織中的表達及其相關(guān)性分析:與癌旁組織比較,肺癌組織中MIR205HG表達升高,miR-299-3p表達降低(P<0.05),見表1。Pearson法,結(jié)果顯示,MIR205HG和miR-299-3p呈負相關(guān)(r=-0.778 9,P<0.000 1),見圖2。

表1 MIR205HG和miR-299-3p在肺癌組織中的表達

圖2 MIR205HG和miR-299-3p相關(guān)性分析

2.MIR205HG和miR-299-3p在肺癌細胞和正常肺上皮細胞中的表達:相對于正常肺上皮細胞BEAS-2B,肺癌細胞H1299、A549、SPC-A1中MIR205HG表達升高(P<0.05),miR-299-3p表達降低(P<0.05),其中MIR205HG在H1299細胞中的表達相對較高,因而選用H1299細胞作為后續(xù)研究對象,見表2。

表2 MIR205HG和miR-299-3p在肺癌細胞和正常肺上皮細胞中的表達(n=9)

4.干擾MIR205HG表達對肺癌H1299細胞增殖和凋亡的影響:與si-NC組相比,si-MIR205HG組肺癌H1299細胞MIR205HG表達下降,增殖能力、CyclinD1、Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05),凋亡率、p21、Bax蛋白表達升高(P<0.05),見圖3、表3。

表3 干擾MIR205HG表達對肺癌H1299細胞增殖和凋亡的影響(n=9)

A:干擾MIR205HG表達對肺癌H1299細胞增殖的影響;B:干擾MIR205HG表達對肺癌H1299細胞凋亡的影響;C:干擾MIR205HG表達對肺癌H1299細胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

5.miR-299-3p過表達后肺癌H1299細胞的增殖和凋亡情況:與miR-NC組相比,miR-299-3p組肺癌H1299細胞miR-299-3p表達增高,增殖能力、CyclinD1、Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05),細胞凋亡率、p21、Bax蛋白表達升高(P<0.05),見表4。

表4 miR-299-3p過表達后肺癌H1299細胞的增殖和凋亡情況

6.抑制miR-299-3p逆轉(zhuǎn)了干擾MIR205HG表達對肺癌H1299細胞增殖和凋亡的作用:相對于si-MIR205HG+anti-miR-NC組,si-MIR205HG+anti-miR-299-3p組肺癌H1299細胞miR-299-3p表達下降,增殖能力、CyclinD1、Bcl-2蛋白表達升高(P<0.05),凋亡率、p21、Bax蛋白表達水平降低(P<0.05),見表5。

表5 抑制miR-299-3p逆轉(zhuǎn)了干擾MIR205HG表達對肺癌H1299細胞增殖和凋亡的作用

討論

有報道顯示,LncRNA在肺癌發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[8-10]。此外,它可能為肺癌的診斷和靶向治療提供一個潛在的靶點。然而,一些LncRNA參與肺癌發(fā)生發(fā)展的機制尚未完全闡明[11]。本研究積極探索LncRNA分子及其可能的作用機制,為肺癌的診斷和治療提供新的方向。

有研究證實,MIR205HG在肺鱗癌中顯著上調(diào)[12]。我們的數(shù)據(jù)顯示,肺癌細胞中MIR205HG的表達增加,與文獻一致,提示MIR205HG表達水平升高可能促進肺癌的發(fā)生。有研究表明,MIR205HG可抑制食管腺癌的進展[13]。證明MIR205HG在不同腫瘤類型中的不同作用。本研究結(jié)果顯示,干擾MIR205HG表達使肺癌細胞增殖能力明顯降低,細胞凋亡水平顯著提高,提示干擾MIR205HG表達對肺癌細胞具有抗增殖和促凋亡的作用。CyclinD1、p21是增殖相關(guān)蛋白,CyclinD1表達水平與增殖能力成正比,p21表達水平與增殖能力成反比。Bcl-2、Bax是調(diào)控凋亡進展的蛋白,二者作用相反,Bcl-2表達水平與肺癌細胞凋亡能力成反比[14]。本研究結(jié)果顯示,干擾MIR205HG表達后,CyclinD1、Bcl-2表達降低,p21、Bax表達升高,提示干擾MIR205HG表達對肺癌細胞的抗增殖和促凋亡作用與調(diào)控相關(guān)蛋白表達相關(guān)。

本研究通過雙熒光素酶實驗和RNA pull-down實驗證實,miR-299-3p為MIR205HG的下游靶miRNA。既往研究表明,miR-299-3p在非小細胞肺癌細胞中表達水平降低,LncRNA RHPN1-AS1可通過靶向miR-299-3 /TNFSF12途徑而增強非小細胞肺癌細胞化療耐藥性[15]。本研究結(jié)果顯示miR-299-3p在肺癌細胞中的表達水平降低,與上述研究結(jié)果相似,miR-299-3p過表達導(dǎo)致肺癌細胞增殖抑制,使細胞凋亡能力增強,同時,CyclinD1、Bcl-2表達下降,p21、Bax表達增高,提示miR-299-3p通過調(diào)控蛋白表達抑制肺癌細胞增殖并誘導(dǎo)凋亡。進一步的實驗顯示,抑制miR-299-3p可逆轉(zhuǎn)干擾MIR205HG表達對肺癌細胞增殖、凋亡及CyclinD1、Bcl-2、p21、Bax蛋白表達的作用,提示MIR205HG可通過競爭性結(jié)合miR-299-3p而抑制其表達從而發(fā)揮作用。

綜上所述,MIR205HG在肺癌細胞中的表達量升高,并可促進肺癌細胞增殖及抑制其凋亡,其機制可能為MIR205HG抑制miR-299-3p的表達,miR-299-3p被證實是MIR205HG的直接靶基因,為深入探究MIR205HG在肺癌細胞中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供理論依據(jù),為揭示肺癌發(fā)病機制提供實驗依據(jù)。