楊興有, 丁安明, 余祥文, 謝 強, 夏 春, 張永輝, 徐傳濤, 王衛(wèi)鋒, 陳志華*

(1.四川省煙草公司 煙草科學研究所, 四川 成都 610000; 2.中國農(nóng)業(yè)科學院 煙草研究所, 山東 青島 266101; 3.四川省煙草公司 瀘州市公司, 四川 瀘州 646000)

0 引言

【研究意義】青枯病是煙草生產(chǎn)中常見的一種典型細菌性土傳病害,其病原菌是雷爾氏青枯菌(Ralstoniasolanacearu)[1]。青枯菌的寄主范圍比較廣泛,主要有煙草、番茄、馬鈴薯等植物,青枯病破壞性強,防治比較困難[2]。在高溫高濕環(huán)境中,青枯菌通過根部或莖部的傷口進入煙株,隨后進入木質(zhì)部,通過脂多糖識別寄主細胞,并產(chǎn)生大量的胞外多糖導(dǎo)致維管束堵塞,同時分泌胞外蛋白酶降解細胞壁,最終引起煙草維管束發(fā)生病變,導(dǎo)致植物萎蔫死亡[3]。煙草是我國主要的經(jīng)濟作物之一,其青枯病的發(fā)生嚴重威脅煙草生產(chǎn)。因此,有效預(yù)防青枯病的發(fā)生是煙草生產(chǎn)與科學研究的重要工作?！厩叭搜芯窟M展】目前,防治青枯病的方法主要有化學防治、農(nóng)業(yè)防治和生物防治3種。化學防治效果不理想,化學農(nóng)藥對土壤環(huán)境和水質(zhì)產(chǎn)生污染,且長期使用導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性[4]。農(nóng)業(yè)防治主要采用與小麥、玉米、水稻的輪作,但輪作存在年限較長的缺點[5-6]。生物防治是施用微生物菌劑控制植物病害,優(yōu)點是對人畜植物安全,無污染[7],備受歡迎?！狙芯壳腥朦c】目前篩選的煙草青枯病生防菌大多拮抗能力較弱,且大田防治效果不佳?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從煙草根際土壤中分離對煙草青枯病菌具有拮抗作用的細菌并對菌株進行分類、鑒定,通過室內(nèi)盆栽試驗驗證其生防效果以及對煙草的促生作用,為煙草青枯病防治提供新的拮抗菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣 供試土樣采自四川省瀘州市古藺縣大寨鄉(xiāng)大寨村煙田,采用五點取樣法收集健壯煙株根際土壤樣品5份并編號,放入無菌密封袋中,做好標記并放置于4 ℃環(huán)境保存。

1.1.2 煙草品種與病原菌 供試煙草品種為煙草青枯病易感品種翠碧一號(CB-1);供試煙草青枯病病原菌為Y45,由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院提供。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基均購自海博生物技術(shù)(青島)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 煙草根際土壤中細菌的分離及純化 采用梯度稀釋法并涂布于NA培養(yǎng)基上以分離土壤中的細菌。稱量1 g土壤樣品于10 mL無菌水中制備成濃度為10-1土壤懸液,振蕩培養(yǎng)30 min,然后靜置30 min。用無菌水稀釋至10-3土壤稀釋液,吸取100 μL均勻涂布于細菌培養(yǎng)基上,倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察細菌生長情況。挑取形狀、大小、顏色不同的單菌落于NB液體培養(yǎng)基中28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)后的菌液在細菌培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng),放置于28 ℃培養(yǎng)箱,待長出單菌落后經(jīng)過多次劃線培養(yǎng),得到細菌的純培養(yǎng)物,并保存菌種。

1.2.2 青枯菌拮抗菌的篩選、鑒定與拮抗活性測定 采用抑菌圈法篩選煙草青枯病菌的拮抗細菌。取200 μL青枯病菌懸液均勻涂布于NA平板上,平板中央放置直徑為5 mm的無菌濾紙片,滴加10 μL濃度為1×108cfu/mL的待測菌液,待培養(yǎng)基充分吸收后,倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,觀察抑菌效果并測量抑菌圈的直徑。設(shè)置重復(fù)3次。

將拮抗菌接種于NA培養(yǎng)基上,于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察菌落形態(tài)、大小、邊緣、表面、透明度等,并進行革蘭氏和甲基紅染色。

1.2.3 分子生物學鑒定 拮抗菌的16S rDNA序列采用PCR方法擴增[8]。PCR擴增采用細菌的通用引物,其中正向引物序列為BSF(27F)5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,反向引物序列為BSR(1942R)5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)體系:27F 1 μL,1942R 1 μL,ddH2O 21 μL,PCR Mix 25 μL,菌株DNA模板2 μL,合計50 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性15 s,55 ℃復(fù)性15 s,72 ℃延伸90 s,35個循環(huán);72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測、分離和純化PCR產(chǎn)物,并送派森諾生物科技有限責任公司測序。

1.2.4 系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建 將測序獲得的DNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST序列比對分析,下載同源序列并通過Clustal和MEGA7.0進行多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建,確定其分類地位。

1.2.5 拮抗菌對煙草青枯病的室內(nèi)防效試驗 采用盆栽試驗研究拮抗菌對煙草青枯病的影響,盆栽試驗在中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所溫室內(nèi)進行。在3個已滅菌的500 mL三角瓶中加入LB液體培養(yǎng)基,接入拮抗菌菌液并置于28℃振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(220 r/min),直到OD600=0.5～0.8。在加入拮抗菌前保持盆栽煙草幼苗(CB-1)土壤中含有充足的水分。量取50 mL菌液灌溉盆栽苗根部,對照(CK)則接入50 mL的NB培養(yǎng)基。間隔3 d后重復(fù)接種1次。之后間隔3 d接入青枯菌Y45菌液50 mL/盆(OD600=1.0),對照也接入50 mL Y45菌液[9-10]。每個處理10盆,3次重復(fù)。接種青枯菌后,蓋上保溫蓋放置在30 ℃培養(yǎng)箱中,將煙苗在高溫高濕的條件下分別培養(yǎng)7 d、14 d和21 d并依據(jù)《煙草病蟲害分級及調(diào)查方法》(GB/T 23222—2008)[11]記錄盆栽苗的發(fā)病情況。統(tǒng)計發(fā)病率、病情指數(shù)和生防效果,其計算公式如下:

病情指數(shù)=∑(各病級株數(shù)×各病情指數(shù))/(調(diào)查總株數(shù)×青枯病最高病情指數(shù))×100

生防效果=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100%

1.2.6 拮抗菌對煙草幼苗的促生試驗 采用灌溉接種的方式分析拮抗菌對煙草的促生作用[12],方法略有改動。首先將拮抗菌搖至OD600=0.5。在煙草生根期移植盆中對其進行灌根處理,每盆加入拮抗菌液20 mL,每處理10盆,3次重復(fù)。對照用NB培養(yǎng)基進行灌溉,間隔7 d澆灌1次,共澆灌3次,然后放在26 ℃條件下培養(yǎng),觀察煙草的生長狀況。3周后分別取對照組和處理組,除去土壤,清水洗凈,吸干水分,測量株高、葉片長寬、莖圍、根系長度、根系生物量等促生指標。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel對數(shù)據(jù)進行處理,采用學生t-檢驗[13]進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草根際細菌對青枯菌的拮抗活性

對采集健康煙株根際土壤中細菌進行分離、純化,共得到土壤細菌54株。利用抑菌圈法對獲得的54株細菌進行青枯菌拮抗活性測定,發(fā)現(xiàn)1株細菌對煙草青枯病菌具有抑制作用,命名為TBWR1(圖1)。該菌株產(chǎn)生的抑菌圈較為明顯且透明,直徑達21 mm以上。

注：*,**和***分別表示在P<0.05、P<0.01和P<0.001水平下顯著,下同。

2.2 拮抗菌株TBWR1的形態(tài)鑒定

菌株TBWR1在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后,鏡檢觀察菌體發(fā)現(xiàn)其呈短棒狀,菌落為黃乳白色,呈圓形,表面略有褶皺,生長無規(guī)則,革蘭氏染色陽性、甲基紅染色為陰性。

2.3 拮抗菌株TBWR1的分子鑒定

以TBWR1菌株DNA為模板進行PCR擴增發(fā)現(xiàn)單一DNA條帶,為16S rDNA序列,大小約為1.5 kb。序列基因登錄號為EF562603。通過序列比對分析,菌株TBWR1與枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis同源性最高。系統(tǒng)進化樹分析(圖2)表明,菌株TBWR1與枯草芽孢桿菌BacillussubtilisKC849252和BacillussubtilisMN062963在同一分支上且同源性達85%。因此,初步鑒定菌株TBWR1為枯草芽孢桿菌。

2.4 拮抗菌對煙草青枯病的防治效果

從圖3看出,煙株接菌后第7天,對照組開始發(fā)病,出現(xiàn)萎蔫、枯死的癥狀,而TBWR1處理組鮮有發(fā)病;接菌后第14天,對照組病情指數(shù)為40,TBWR1處理組僅為16;接菌后第21天,對照組煙株全部發(fā)病,且有超過50%煙株死亡,TBWR1處理組的病情指數(shù)為25。拮抗菌TBWR1的生防效果在第21天達71.1%。拮抗菌TBWR1對盆栽試驗中煙草青枯病具有較好的防治效果,明顯降低接種青枯菌后煙株的發(fā)病率和死亡率。

圖 2 TBWR1菌株的系統(tǒng)進化樹

圖 3 拮抗菌TBWR1對青枯病菌的生防效果

2.5 TBWR1菌株的促生作用

由圖4可見,與對照組相比,TBWR1拮抗菌株處理后的煙株整體生長勢增強、在處理后第7天、14天、21天與對照相比有顯著差異,其中,第21天對照株高平均達4.8 cm,TBWR1處理組達6.6 cm,株高顯著增加(圖4和圖5)。說明,拮抗菌能顯著促進煙草株高的生長。

對煙草葉片(自下而上數(shù)第3片葉)的長度和寬度進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),TBWR1拮抗菌株處理能顯著增加葉片長度,而對葉片寬度無顯著促生作用。同樣,TBWR1拮抗菌株處理能顯著增加煙株的莖圍(圖5)和根系鮮重(圖6)。表明,TBWR1拮抗菌對煙草地上部分和地下部分均表現(xiàn)出顯著促生作用。

圖 4 TBWR1拮抗菌對煙草生長勢的促進作用

圖 5 TBWR1拮抗菌株處理煙草葉片的發(fā)育和莖圍

圖 6 TBWR1拮抗菌對煙草根系發(fā)育的促生效果

3 討論

青枯病是由青枯雷爾氏菌引起的典型土傳病害且不易防治。由于該病菌致死率高、寄主范圍比較廣,普遍分布于世界烤煙種植區(qū),特別在熱帶和亞熱帶煙區(qū)易造成巨大經(jīng)濟損失,嚴重威脅煙草生產(chǎn)[4,14]。有研究認為,根際微生態(tài)失衡是青枯病發(fā)生的主要原因[15]。植物土壤微生物所形成的相互依存的生態(tài)系統(tǒng)遭到破壞,而根際微生態(tài)失衡對土壤微生物的環(huán)境造成進一步惡化,更不利于植物的健康生長,造成病原微生物大量繁殖,最終導(dǎo)致土傳病害暴發(fā)[16]。

植物根際土壤中有不計其數(shù)的細菌,這些細菌有的促進植物生長發(fā)育,提高植物的抗病性,維持正常的生態(tài)平衡;有的抑制植物生長[7,13,17]。土壤中存在寄主或病原菌,有可能存在拮抗的生防菌株。拮抗菌株具有和病原菌生長環(huán)境相同,因此利用拮抗菌防治青枯病是具有應(yīng)用前景的防治措施[18]。拮抗菌中研究較多的是芽孢桿菌屬,芽孢桿菌具有較強的定殖能力,這類菌株有抗逆性強、對營養(yǎng)需求較簡單,且產(chǎn)生內(nèi)孢子,也易分離篩選,對植物的病害防治有重要作用[12,19-20]。研究從煙田健壯煙株根際土壤中分離篩選對煙草青枯病菌拮抗作用相對較強的菌株TBWR1,通過系統(tǒng)發(fā)育分析該菌株屬于芽孢桿菌屬,在培養(yǎng)皿內(nèi)抑菌試驗和盆栽防效試驗中對煙草青枯病菌均表現(xiàn)出良好的抑菌效果,并進一步通過促生試驗,證明拮抗菌TBWR1能顯著促進煙草生長勢,對株高、莖圍、葉長等地上部分和根系等地下部分生長均具有顯著的促進作用。研究結(jié)果為煙草青枯病的生物防治提供了新的生防菌株。

段燕萍等[18]研究表明,枯草芽孢桿菌SH7菌株產(chǎn)生的主要抑菌活性物質(zhì)為蛋白多肽類物質(zhì),對煙草青枯病的防治效果達66%。有研究報道,番茄中解淀粉芽孢桿菌對青枯菌有較強的拮抗作用,防治效果在70%以上,能較好抑制番茄青枯病的侵害[6,21];枯草芽孢桿菌可以在番茄的根系上定殖并提高植株的株高、葉綠素含量和生物量以及果實的產(chǎn)量[22];接菌枯草芽孢桿菌YBM-4后,與對照相比,煙苗根系更豐富,莖稈更粗壯,從而有利于吸收更多的營養(yǎng)物質(zhì)使煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)得到較大提高[23]。表明,枯草芽孢桿菌屬的多個菌株在幫助植物抵御病害、促進植物生長方面具有積極作用[24]。這些與本研究結(jié)果一致,但同時研究拮抗菌的生防效果和促生效果還鮮有報道。研究用拮抗細菌TBWR1處理后,煙株的抗病性顯著增強,生防效果達71.1%,同時施加TBWR1促進了煙草的株高、葉長和莖圍的增加以及根系的生長。推測其原因可能是拮抗菌TBWR1的施加改善了土壤根部有益細菌的生長環(huán)境,與病原真菌相互競爭[25-26],而且產(chǎn)生了抑制病原細菌的生長和促進植物生長的物質(zhì),如抗菌脂肽類、核酸類、多烯類等物質(zhì)[27-28]。拮抗菌TBWR1抗病相關(guān)功能基因及抗病相關(guān)機理需要進一步研究,同時需要進行田間試驗驗證其對煙草青枯病的防治效果,為豐富拮抗菌種資源提供理論和試驗依據(jù)。

4 結(jié)論

從煙田抗病煙株根際土壤中分離純化出1株對煙草青枯病具有良好拮抗作用的枯草芽孢桿菌TBWR1。拮抗菌TBWR1對青枯病的生防效果達71.1%,并能顯著促進煙草的生長勢。說明,拮抗菌TBWR1在煙草青枯病生物防治中具有潛在利用價值。