呂亞波,何 艷

(信陽師范大學(xué) 體育學(xué)院, 河南 信陽 464000)

0 引言

2022年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎在北京時間2022年10月3日頒發(fā)給瑞典進化遺傳學(xué)家斯萬特·帕博(Svante PBO),以此表彰他對古代基因(DNA)方面取得了顯著的成就[1],這也是諾貝爾獎自建立以來首次頒獎給專門從事進化研究的生物學(xué)家。帕博團隊針對尼安德特人(Neanderthal)的基因組完成了測序工作[2],發(fā)現(xiàn)了一種全新的古人類即丹尼索瓦人(Denisovans)[3-4]。在此基礎(chǔ)上,帕博發(fā)展了一門全新的學(xué)科古基因組學(xué),通過對尼安德特人與丹尼索瓦人DNA測序,并與當(dāng)代智人基因序列進行比對,揭示了他們的基因序列呈現(xiàn)出的規(guī)律性[1,5-9]。

古基因組學(xué)技術(shù)對人類古動物、古植物等研究均具有很高的應(yīng)用價值,能夠用于探究古代動植物的物種多樣性,并試探性分析史前自然與生物環(huán)境。古基因組學(xué)是如何誕生的?帕博在古基因組學(xué)研究方面取得了哪些矚目成就?本文將圍繞這些問題簡要展開解讀。

1 古基因組學(xué)的誕生

1.1 古DNA的含義

古DNA指從古代動植物殘骸樣本中提取出的DNA分子。用于DNA分析的古代樣本包括來自骨架、木乃伊組織、非冷凍醫(yī)學(xué)保存樣本、保存的植物遺骸、冰、永凍土和全新世(大約1.17萬年前)海洋及湖泊沉積物等。

一般用于研究人類演化的古DNA具有3種類型:反映母系遺傳信息的線粒體DNA(mtDNA);反映父系遺傳信息的Y染色體DNA;反映父母雙方遺傳信息的核DNA。其中,通過分析mtDNA的變異,可以判定生物體的遺傳關(guān)系。在細(xì)胞中,往往含有數(shù)百個線粒體,每個線粒體中又包含2～10個mtDNA,而人類核DNA的數(shù)量卻只有46個。因此,從線粒體中提取基因,比從染色體中提取核基因的可能性大。這使得包括帕博團隊在內(nèi)的眾多科學(xué)家,選擇以mtDNA為研究突破口[10]。

1.2 古DNA的提取

古DNA與現(xiàn)代DNA并沒有本質(zhì)上的區(qū)別,然而古DNA的提取并不簡單。從古代人類遺骸中提取DNA容易受到自身或環(huán)境微生物DNA堿、紫外光、酶、酸等多種因素的影響,同時DNA本身容易降解[11],需要從堿基對的長鏈DNA降解短鏈DNA片段,這樣就可能混雜環(huán)境微生物或其他生物DNA,尤其是現(xiàn)代人類DNA[12-13]。另外,DNA提取液中幾乎只含有少量內(nèi)源性DNA,但含有大量來自死后在標(biāo)本上定植的微生物的DNA,真正有用的古DNA序列常常只占1%不到,因此,DNA片段的提取非常困難[14]。

20世紀(jì)80年代末,隨著聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)體外擴增技術(shù)應(yīng)用和化石DNA提取技術(shù)的逐漸成熟,促進了有關(guān)古DNA的研究進程。借助MULLIS 等[15]提出的PCR技術(shù),可以測定少數(shù)特定DNA片段的序列。帕博團隊[16]探索將PCR技術(shù)運用于古DNA的研究,構(gòu)建了適合古DNA研究的PCR技術(shù),從保存完好的7000年前人類大腦遺骸中提取出mtDNA,在美洲史前人類遺傳學(xué)方面取得了一定成就[1]。但PCR技術(shù)獲取的DNA信息極其有限,且易受到被污染的現(xiàn)代DNA優(yōu)先擴增以及在一次擴增中片段大小限制的影響,難以區(qū)分真正的古DNA和污染DNA,所以針對人類的古DNA研究方法,在該階段依舊受到極大的質(zhì)疑。

1.3 古DNA的測序

2005年,成熟高通量DNA測序技術(shù)實現(xiàn)了對標(biāo)本中提取的DNA隨機片段的大規(guī)模全基因組測序。帕博團隊[17]正是利用這種高通量DNA測序技術(shù),創(chuàng)建了古DNA提取、保存、擴增與測序等技術(shù)方法,研究猛犸象DNA、古馬DNA、胎盤類哺乳動物進化關(guān)系,得出尼安德特人的mtDNA。帕博的開創(chuàng)性研究促成了一門全新學(xué)科的誕生——古基因組學(xué)[18-20]。

帕博帶領(lǐng)團隊創(chuàng)建了古DNA提取、保存、擴增與測序等技術(shù)方法,將高通量基因組測序技術(shù)引入古人類遺傳學(xué)研究,將古人類遺骸中極微量的DNA擴增上億倍,為揭示現(xiàn)代人祖先真實的演化歷史提供了更為直接的線索和證據(jù)。隨著納米孔測序法等第3代技術(shù)的研究與運用,科學(xué)家可以對古DNA進行更深入、更廣泛的探索。但是,更古老的DNA測序研究依然是科學(xué)領(lǐng)域面對的一個極大的挑戰(zhàn),亟須對古DNA有效除雜和測序技術(shù)進一步開發(fā)創(chuàng)新。

2 尼安德特人的基因組序列

尼安德特人消失時間為3萬年前,主要生活在歐洲與西亞的大部分地區(qū)。從進化歷史上,尼安德特人與現(xiàn)代人類最為接近,具有較強的歷史研究價值,古基因組學(xué)的發(fā)展為尼安德特人的研究提供了便利。

帕博綜合分析70多個尼安德特人骨骼與牙齒樣本和克羅地亞Vindija洞穴尼安德特人骨骼,通過454 Life Sciences GS FLX、Illumina/Solexa GAII系統(tǒng)進行DNA測序,最終得到大于100萬個堿基對核DNA序列。通過比較3塊骨骼的完整mtDNA序列及常染色體DNA序列,確定這3種骨骼來自不同的個體;且根據(jù)測量結(jié)果估計,mtDNA污染程度不到1%,這表示數(shù)據(jù)中的絕大多數(shù)代表著真正的尼安德特人DNA序列。

帕博團隊[2]將尼安德特人和不同地區(qū)現(xiàn)代人全基因組進行對比,發(fā)現(xiàn)尼安德特人和非洲人群的遺傳距離比他們和非洲以外人群的遺傳距離稍遠(yuǎn)一些,但與歐洲人群和東亞人群的遺傳距離一樣,這說明尼安德特人與現(xiàn)代人類的接觸更早,甚至接觸時間可能在歐洲與亞洲人分化之前。他們又將不同地區(qū)現(xiàn)代人群、尼安德特人和黑猩猩之間的遺傳距離進行比對,結(jié)果顯示大部分的基因交流都是從尼安德特人到現(xiàn)代人的。帕博團隊[6]還推算出非洲以外人群中來自尼安德特人的基因占1%～4%,且這些基因交流發(fā)生在3.7萬～8.6萬年前。

2010年,西伯利亞南部阿爾泰山脈的一個洞穴中挖出一個尼安德特人的腳趾骨,帕博團隊[7]利用基因組學(xué)方面的技術(shù),提取出其基因組DNA,測出了阿爾泰尼安德特人的全基因組序列,發(fā)現(xiàn)來自阿爾泰山的古老現(xiàn)代人類可能和同一地區(qū)的尼安德特人有基因交流。相比于其他地方的尼安德特人,阿爾泰地區(qū)尼安德特人的第21號染色體與非洲人群的該染色體共享更多等位基因?；谶@些發(fā)現(xiàn),帕博團隊[2]認(rèn)為在約11萬年前,早期現(xiàn)代人類的一個分支,對阿爾泰地區(qū)尼安德特人有0.1%～2.1%的基因滲入。對尼安德特人全基因組的研究證明,現(xiàn)代人類和尼安德特人是存在雙向基因交流的。這也說明將古DNA的研究范圍擴大到全基因組是必要的,將會得到更全面的信息。

3 新人類類群的發(fā)現(xiàn)

2008年,帕博團隊在阿爾泰山脈丹尼索瓦(Denisova)洞穴中發(fā)現(xiàn)了一個古人類指骨。帕博團隊從30 mg手指骨粉中提取DNA,并使用攜帶項目特定條形碼的DNA適配器將其轉(zhuǎn)換為Illumina測序文庫,采用引物延伸捕獲(PEC)的靶向序列檢索方案,從整個線粒體基因組中分離mtDNA片段,在Illumina GAII平臺上對分離片段的兩端進行測序,每次讀取76個周期,并且使用了幾種不同的方法來評估所確定的mtDNA序列的可靠性。帕博團隊將丹尼索瓦洞人的mtDNA序列與54個現(xiàn)代人的mtDNA、最近從俄羅斯的一個早期現(xiàn)代人的mtDNA、6個完整的尼安德特人mtDNA、1個倭黑猩猩mtDNA和1個黑猩猩mtDNA進行了比對,發(fā)現(xiàn)尼安德特人與現(xiàn)代人的差異平均為202個核苷酸位點,而丹尼索瓦洞人個體的差異平均為385個位點(圖1)[3],黑猩猩個體的差異為1462個位點。因此,這塊古人類指骨既不屬于早期現(xiàn)代人,也不屬于尼安德特人,更不屬于倭黑猩猩和黑猩猩。系統(tǒng)發(fā)育分析同樣表明,丹尼索瓦洞人mtDNA譜系在現(xiàn)代人類和尼安德特人譜系之前就出現(xiàn)了分支(圖1)。假設(shè)人類和黑猩猩mtDNA的平均分化時間為600萬年前,那么丹尼索瓦洞人、尼安德特人和現(xiàn)代人類共享的最近共同mtDNA祖先的時間約為100萬年前。這意味著丹尼索瓦洞人mtDNA分化的時間大約是尼安德特人和現(xiàn)代人類mtDNA分化時間的2倍。這表明在丹尼索瓦洞發(fā)現(xiàn)的這塊化石所代表的古人類,屬于現(xiàn)代人和尼安德特人以外的類群,是一個新發(fā)現(xiàn)的古人類群。

圖1 成對核苷酸差異Fig. 1 Paired nucleotide differences

帕博的發(fā)現(xiàn)在接下來的工作中得到了進一步驗證。2010年,帕博團隊對在丹尼索瓦洞穴南走廊發(fā)現(xiàn)的一顆成年古人類牙齒進行研究,發(fā)現(xiàn)該顆牙齒與指骨所攜帶的線粒體基因組高度相似,但與尼安德特人和現(xiàn)代人沒有共同的派生形態(tài)學(xué)特征(圖2)[4],進一步表明丹尼索瓦洞人的進化史與尼安德特人和現(xiàn)代人截然不同。

圖2 丹尼索瓦洞穴中磨牙的咬合(a)和近中(b)視圖Fig. 2 Occlusal (a) and mesial (b) views of molars in Denisova Cave

帕博團隊[5]提出了一種DNA庫制備方法,重建一個高覆蓋率(30倍)的丹尼索瓦人基因組序列。這個基因組的質(zhì)量不僅可以直接估計丹尼索瓦洞人的雜合性,而且還可以根據(jù)樣本基因組中“缺失的進化”,對丹尼索瓦洞人和尼安德特人與現(xiàn)代人類混合的詳細(xì)測量,得到現(xiàn)代人類自與丹尼索瓦洞人分離以來頻繁出現(xiàn)的基因變化的近乎完整的目錄,進而初步確定樣本的年代。帕博團隊的方法,提供了高質(zhì)量丹尼索瓦洞人基因組的詳細(xì)分析,為丹尼索瓦洞人的雜合度極低提供了證據(jù),還闡明了人類與包括尼安德特人在內(nèi)的古代人之間的關(guān)系,并建立了人類譜系中基因變化的目錄。分析表明,它來自一個以前不為人知的與尼安德特人有關(guān)的古人類群體,被稱之為“丹尼索瓦人”。因而,至少有兩個不同的人類群體,尼安德特人和相關(guān)的丹尼索瓦人,在解剖學(xué)上的現(xiàn)代人從非洲出現(xiàn)時就已經(jīng)居住在歐亞大陸[5]。

2014年,帕博團隊對2010年在丹尼索瓦洞穴的東部走廊中發(fā)現(xiàn)的另一塊古人類近端趾指骨(圖3a)[6]進行研究。帕博團隊提取了隨機的DNA片段并進行了測序。結(jié)果顯示,樣本中大約70%的DNA片段與人類基因組一致。對與線粒體基因組相似片段的初步檢測表明,其mtDNA與尼安德特人的mtDNA密切相關(guān)。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示,趾指骨mtDNA與先前公布的6個尼安德特人mtDNA有共同的祖先,排除了現(xiàn)代人類和丹尼索瓦指骨。在尼安德特人的mtDNA中,腳趾的mtDNA與來自高加索地區(qū)瑪茲梅斯卡亞(Mezmaiskaya)洞穴的嬰兒的mtDNA關(guān)系最為密切(圖3b)[6]。這表明不同群體之間很可能發(fā)生了基因流動組合。

圖3 丹尼索瓦洞穴中的古人類趾指骨(a)和基因組數(shù)據(jù)可用樣本位置(b)Fig. 3 Ancient human finger bones in Denisova cave(a) and available sample location of genomic data(b)

2018年,帕博團隊對丹尼索瓦11號長骨碎片展開研究。通過對碎片的皮質(zhì)厚度研究,推斷其在死亡前至少有13歲(圖4)[21]。帕博團隊從標(biāo)本收集的骨粉中提取了6次DNA,從提取物中建立了10個DNA文庫,并對丹尼索瓦11號進行了平均覆蓋率為2.6倍的基因組測序,發(fā)現(xiàn)其X染色體的覆蓋范圍與常染色體相似,表明丹尼索瓦11號是雌性。

圖4 青銅時代的人類和兩個尼安德特人的最大皮質(zhì)厚度Fig. 4 Maximum cortical thickness of Bronze Age humans and two Neanderthals

為了確定丹尼索瓦11號源自哪個種族,帕博團隊比較了與尼安德特人基因組和丹尼索瓦人基因組中衍生等位基因匹配的DNA片段的比例,并使用聚類模擬,估計在阿爾泰尼安德特人和丹尼索瓦的人口統(tǒng)計學(xué)歷史相似的人群中,與尼安德特人或丹尼索瓦人基因組匹配的DNA片段的預(yù)期比例,最終得出結(jié)論:她是尼安德特人母親和丹尼索瓦人父親的后代,尼安德特人母親為她提供了mtDNA(圖5)[21]。丹尼索瓦11號是在迄今為止測序的古代標(biāo)本中,發(fā)現(xiàn)的第一代尼安德特人和丹尼索瓦人后代。

注：a) 在尼安德特人、丹尼索瓦人和現(xiàn)代人的基因樹,每個分支上的數(shù)值為來自丹尼索瓦人11號的匹配等位基因的DNA片段百分比。

進一步的研究結(jié)果表明,古人類和現(xiàn)代人類在相遇時可能經(jīng)常發(fā)生混合,但是尼安德特人居住在歐亞大陸西部,而丹尼索瓦人居住在歐亞大陸東部的未知地區(qū),他們重疊區(qū)域仍然在空間和時間上受到限制——這也可能是為什么尼安德特人和丹尼索瓦人在基因上仍然不同的原因。相比之下,大約6萬年前,現(xiàn)代人在歐亞大陸的傳播可能使他們能夠在更大的空間范圍內(nèi)與古代人反復(fù)互動。他們之間的混合可能導(dǎo)致古代人口部分地被可能更多的現(xiàn)代人口所吸收[21]。這一研究結(jié)果顯示了人類的早期演化進程,有利于促進人類進化史研究,能夠更好地了解人類進化與遷移過程。根據(jù)這一研究結(jié)果,分析現(xiàn)代人類與古人類基因組,能夠更好地了解現(xiàn)代人類形成與發(fā)展過程中受到哪些因素的影響,可以更好地探知人類的形成過程[22]。

3 古基因組學(xué)的其他成就

通過對古基因組學(xué)的研究,能夠更好地促進對人類演化進程的研究,了解人類成長過程中面對的疾病風(fēng)險因子,促進對疾病的認(rèn)知與治療,為人類自身免疫性疾病、過敏性疾病、糖尿病等疾病治療提供新靶點。這一系列研究成果的得出,為疾病治療提供了新的方向,為生物學(xué)研究提供了新的啟發(fā)與思路。

4 展望

帕博通過幾十年對古DNA領(lǐng)域的探索,實現(xiàn)了從mtDNA到全基因組的測序。他對于古人類研究的熱情、專注與奉獻為古生物學(xué)家打開了一扇了解人類進化歷程的窗戶。帕博團隊創(chuàng)造性地將高通量DNA測序技術(shù)應(yīng)用于古人類基因組測序工作上,所開創(chuàng)或優(yōu)化的古DNA研究方法使許多研究者受益,從而使越來越多的人加入了研究古基因組學(xué)的行列。

帕博團隊測定了已滅絕古人類基因組,并與當(dāng)代人類遺傳差異進行對比研究,因而能夠更好地研究人類祖先分支、演化及人類起源進程。帕博以自身的研究成果進一步激勵了科學(xué)界對進化遺傳學(xué)的重視與深入研究,進一步促進人們探究人類起源的秘密,更好地探究人類是如何進化到今天的,從而對今天的人類能夠形成進一步認(rèn)知。相信在相關(guān)測試技術(shù)的進一步發(fā)展的背景下,古基因組學(xué)會取得更好的成績。

目前,DNA測序技術(shù)的生命力已經(jīng)開始逐漸展現(xiàn)出來,基因組學(xué)技術(shù)已進入臨床領(lǐng)域并打開個體化醫(yī)療大門,將技術(shù)的實用性、適應(yīng)性、穩(wěn)定性等提升到了前所未有的高度,但基因組學(xué)相關(guān)技術(shù)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有達(dá)到人類所需的程度。不同學(xué)科的交叉融合,使得核酸測序技術(shù)的發(fā)展充滿活力,愈來愈多的學(xué)科,如物理學(xué)、化學(xué)、材料科學(xué)的基本原理被用于對堿基的識別,體現(xiàn)出其較傳統(tǒng)生物化學(xué)原理更為優(yōu)越的性能優(yōu)勢。因此,引導(dǎo)和支持不同學(xué)科的融合和交流,鼓勵源頭和原始創(chuàng)新是非常重要的,也是未來DNA測序技術(shù)乃至其他生命科學(xué)相關(guān)技術(shù)的發(fā)展方向。