朱 濤,李蕾蕾,郭劉艷,2,葉延欣,李濤濤,陳艷艷*

(1． 河南城建學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院, 河南 平頂山 467000;2. 洛陽市新安縣南李村鎮(zhèn)人民政府, 河南 新安 471800)

0 引言

石斛(Dendrobiumnobilelindl.,DNL)為蘭科石斛屬多年生附生草本植物,是蘭科和被子植物中最大的種類之一[1]。迄今為止,中國已經(jīng)記載的石斛屬植物有81種、變種2種、特有種18種。石斛屬植物是植物界中注重觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值的一種典型代表植物,被稱作“四大觀賞洋蘭”,還具有多重藥用價(jià)值[2]。

石斛的藥用價(jià)值極為廣泛,其入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,被列為上品[3],具有抗癌、防老、潤肺、明目、養(yǎng)陰生津等多重功效,可用于治療熱病傷津、口干煩渴、病后虛熱、舌光少苔、食少干嘔、目暗不明等癥[4]。石斛新鮮或干燥的莖是其主要藥用部分,更是復(fù)方中藥的重要組成成分。民間將其稱作“救命仙草”,此外還因其稀少瀕危、價(jià)值昂貴,也被稱為“植物軟黃金”[5]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)其主要化學(xué)成分研究發(fā)現(xiàn),該屬植物富含多糖、生物堿、菲類、酚類、香豆素、維生素、氨基酸、揮發(fā)油等成分,且具有較好的藥理學(xué)活性[6],尤其是富含豐富的石斛總堿(Dendrobiumnobilelindl. alkaloid,DNLA)[7]。研究表明,DNLA具有較好的抗氧化、抗炎、保肝、抗神經(jīng)變性等作用。最新報(bào)道發(fā)現(xiàn)DNLA具有較強(qiáng)的抗自由基損傷作用,對(duì)離體缺血、缺氧細(xì)胞具有降低凋亡基因表達(dá)的功能[8-9]。

近年來,受價(jià)格高和工業(yè)人工種植鏈滯后的影響,野生石斛遭到過度采摘和挖掘,使得野生石斛資源受到嚴(yán)重破壞。如今石斛已被列入中國《國家一級(jí)保護(hù)植物名錄》《瀕危野生動(dòng)植物種國際貿(mào)易公約》附錄Ⅱ及《世界自然保護(hù)聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄》,保護(hù)級(jí)別為易危。因此,迫切需要對(duì)該屬植物資源進(jìn)行保護(hù)。然而,目前研究主要集中在保護(hù)、應(yīng)用和培育方面,如薛凱等[10]對(duì)石斛屬植物進(jìn)行了介紹;饒毅等[11]對(duì)近年來石斛的藥用價(jià)值及鑒別方法進(jìn)行了總結(jié);BHOWMIK等[12]通過體外發(fā)育的假鱗莖培養(yǎng)對(duì)商業(yè)上重要的蘭科石斛屬植物進(jìn)行微繁殖;NIU等[13]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中增加水楊酸可以增加石斛幼苗中生物堿、多糖和類黃酮等生物活性成分的積累;CHEN等[14]通過轉(zhuǎn)錄組分析檢測(cè)到41個(gè)可能參與自交不親和的基因,為石斛遺傳機(jī)制的研究提供了基礎(chǔ);DESWINIYANTI等[15]對(duì)野生蘭科石斛的離體繁殖進(jìn)行了研究,為石斛屬的培育提供了科學(xué)依據(jù)。但是,石斛屬植物種類眾多,傳統(tǒng)的石斛鑒定方法多為形態(tài)學(xué)鑒定及顯微鑒定,具有一定的主觀性,給比較形態(tài)學(xué)的分類鑒定帶來了一定的困難[16]。因此,對(duì)石斛屬植物的研究逐漸傾向分子學(xué)方面。謝析穎等[17]對(duì)霍山石斛轉(zhuǎn)錄因子MYB1R1偏好性的研究表明,MYB1R1密碼子的使用方式存在明顯的偏好性,編碼方式偏好以堿基A/U結(jié)尾,偏好性程度較低,但顯示它的密碼子使用方式更偏向于雙子葉植物類群。PERWITASARI等[18]利用rbcL和ITS基因?qū)λ幱锰m科石斛屬變色石斛DNA條形碼研究;而在袁左清等[19]的研究中曾嘗試對(duì)10個(gè)石斛品種的植物rbcL基因進(jìn)行測(cè)序并分析,為石斛屬植物的系統(tǒng)發(fā)育研究提供分子研究方向的證據(jù)。但由于樣本的局限性和單基因信息的有限性,僅闡明了部分石斛之間的親緣關(guān)系,大部分石斛之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系仍不清晰。

本研究擬對(duì)已報(bào)道全葉綠體組的43種石斛之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及其葉綠體組的差異進(jìn)行研究,以期為石斛屬植物資源的開發(fā)利用、物種鑒定及保護(hù)提供分子學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

從美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)數(shù)據(jù)庫中下載已經(jīng)發(fā)布的石斛葉綠體基因序列,共43種,其對(duì)應(yīng)物種名稱,序列號(hào)詳細(xì)信息如表1。

表1 43種石斛信息和葉綠體基因序的登錄號(hào)Fig. 1 Forty-three dendrobium species information and GenBank accession numbers for species chloroplast gene sequence

1.2 數(shù)據(jù)分析

首先,利用BioEdit軟件將從GeneBank中下載的43種石斛全葉綠體序列進(jìn)行比對(duì)及人工校正,將比對(duì)好的序列存為fasta格式文件;其次,使用MEGA6.0[20]軟件計(jì)算序列堿基組成含量、變異位點(diǎn)以及遺傳距離;最后,分別采用最大似然法(Maximum Likelihood, ML)和貝葉斯法(Bayesian inference, BI)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

使用Mrbayes v3.1.2[21]構(gòu)建貝葉斯樹,使用jModelTest 2.0.1[22]軟件計(jì)算最適核苷酸的替換模型,得到最適模型為TPM3uf+I+G。貝葉斯分析以隨機(jī)種子作為起始樹進(jìn)行搜索,在默認(rèn)值(heating values)條件下,4條馬爾可夫鏈(Markov chains)同時(shí)運(yùn)行2×107代,每100代對(duì)系統(tǒng)樹進(jìn)行一次抽樣,且默認(rèn)每隔1000代計(jì)算一次分裂頻率平均標(biāo)準(zhǔn)差(Average standard deviation of split frequencies)。當(dāng)分裂頻率平均標(biāo)準(zhǔn)差≤0.01時(shí),說明2個(gè)獨(dú)立運(yùn)行的馬爾可夫鏈?zhǔn)諗康酵环€(wěn)態(tài)分布上,結(jié)果趨于一致,可終止運(yùn)算。由于運(yùn)算初期所得系統(tǒng)發(fā)育樹不可靠,需要檢驗(yàn)似然值是否趨于穩(wěn)定來確定將被舍棄的樹的數(shù)量(Burnin值),計(jì)算方式一般為(循環(huán)代數(shù)/抽樣頻率)×1/4,之后對(duì)參數(shù)進(jìn)行總結(jié)。通過分析每枝的后驗(yàn)概率(Posterior probabilities)來確定分枝的可靠性,通常情況下,認(rèn)為后驗(yàn)概率≥0.95,表明該分枝得到較可靠的數(shù)據(jù)支持。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體基因組特征及堿基組成

植物葉綠體基因組通過母系遺傳給后代,結(jié)構(gòu)簡單,分子量小,序列保守,使得其被廣泛用于物種鑒定、系統(tǒng)進(jìn)化及分子進(jìn)化研究中[23]。在本次研究所使用的石斛屬葉綠體中,葉綠體基因的大小多數(shù)在150 kb左右,包含編碼基因、tRNA和rRNA,不同石斛所包含的數(shù)量不等。利用MEGA6.0軟件對(duì)43種石斛的葉綠體基因序列進(jìn)行堿基含量的分析,結(jié)果顯示T、C、A、G堿基平均含量分別是31.8%、19.0%、30.7%、18.5%。嘧啶的平均含量略高于嘌呤含量,這表明葉綠體基因在堿基組成上具有偏向性。各種石斛的T、C、A、G堿基含量都處于平均含量,有輕微上下波動(dòng),符合葉綠體堿基組成的一般特征。堿基轉(zhuǎn)換/顛換(Ti/Tv)的比值平均約為0.74,轉(zhuǎn)換數(shù)低于顛換數(shù),如表2所示。

表2 葉綠體基因序列堿基轉(zhuǎn)換顛換情況Fig. 2 The transversion/transition ratio of chloroplast gene sequence

2.2 變異位點(diǎn)及遺傳距離分析

選取的43種石斛的葉綠體基因組序列中共檢測(cè)到變異位點(diǎn)10 618個(gè)。鐵皮石斛、黃石斛、始興石斛和鐵皮石斛中科院Ⅳ號(hào)等4種植物的遺傳距離最小,為0,說明這4種可能為同一母本起源;廣東石斛和梵凈山石斛遺傳距離為0.001,霍山石斛和梵凈山石斛遺傳距離為0.001,霍山石斛和廣東石斛遺傳距離為0.001,由此可見,這3對(duì)石斛親緣關(guān)系比較近。梳唇石斛和少花石斛的遺傳距離為0.019,梳唇石斛和針葉石斛的遺傳距離也為0.019,說明梳唇石斛與這兩個(gè)物種具有較遠(yuǎn)親緣關(guān)系。竹枝石斛和梳唇石斛的遺傳距離最大,為0.021,說明這二者具有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。從表2中也可以看出,劍葉石斛與其他石斛的遺傳距離為0.010～0.012。景洪石斛與其他石斛的遺傳距離范圍是0.011～0.013,較遠(yuǎn)。花石斛與其他石斛的遺傳距離大多為0.010～0.013,距離較遠(yuǎn),除了其與劍葉石斛的遺傳距離為0.006。梳唇石斛與其他石斛的遺傳距離在0.014～0.019之間。針葉石斛與其他石斛的遺傳距離在0.011～0.019之間。竹枝石斛與其他石斛的遺傳距離在0.013～0.021之間,最大遺傳距離就是竹枝石斛與梳唇石斛的遺傳距離。這6種石斛與其他石斛的遺傳距離相對(duì)來說比較遠(yuǎn)。所選取的石斛屬植物其他種類的遺傳距離,均在0～0.021這個(gè)范圍內(nèi)。

2.3 43種石斛的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

基于43種石斛所構(gòu)建的BI樹和ML樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)一致結(jié)果均顯示石斛屬是一個(gè)單系群(兩種樹整合一起呈現(xiàn)),且大多數(shù)分支的自展值大于80,說明分析可信度很高。如圖1所示,在本研究所涉及的43種石斛中,梳唇石斛最先分化出來,位于系統(tǒng)發(fā)育樹的基部,其次是竹枝石斛;而鐵皮石斛和中科院Ⅳ號(hào)鐵皮石斛聚為一支且支持率為100%,分化出來的最晚,在系統(tǒng)發(fā)育樹的頂部,親緣關(guān)系比較近。

圖1 利用最大似然法和貝葉斯法對(duì)43種石斛構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 The Maximum Likelihood (ML) and Bayesian inference (BI) tree constructed based on complete chloroplast gene sequence of 43 Dendrobium species

在本研究中梵凈山石斛和西疇石斛位于同一小支,且具有較高自展值,為100;霍山石斛和細(xì)莖石斛為一支,自展值為100;大苞鞘石斛和腫節(jié)石斛為一支,自展值為100,可信度較高;兜唇石斛和美花石斛為一支,自展值為100;報(bào)春石斛和紫瓣石斛為一支,自展值較高為100;羅河石斛、疏花石斛為一支,自展值為100;玫瑰石斛與束花石斛為一支,自展值為100;疊鞘石斛、流蘇石斛為一支,自展值為100;反瓣石斛和高山石斛為一支,自展值為100;球花石斛、王氏石斛為一支,自展值100,具有較高可信度;劍葉石斛與少花石斛為一支,自展值為100;景洪石斛與針葉石斛為一支,自展值較高為100,可信度高。此外,在該發(fā)育樹中,始興石斛、曲莖石斛、廣西石斛、春石斛、鉤狀石斛也自成一小支;串珠石斛、杓唇扁石斛、齒瓣石斛也自成一小支;基本確定了43種石斛的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

3 討論

目前對(duì)于石斛屬部分種分類存在比較大的爭議,且鐵皮石斛與細(xì)莖石斛、霍山石斛、廣東石斛這些石斛之間沒有明確的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,本研究明確了這幾種石斛之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。在兩種發(fā)育樹中均顯示,細(xì)莖石斛、霍山石斛、廣東石斛具有較近的親緣關(guān)系,而鐵皮石斛的分化位于發(fā)育樹頂部,與另外幾種石斛親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。有研究認(rèn)為霍山石斛與小黃花石斛親緣關(guān)系比較遠(yuǎn),但與大多數(shù)石斛親緣關(guān)系都近[26],與本研究的結(jié)果一致。王曉雙等[27]研究表明鼓槌石斛和竹枝石斛與其他石斛的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),本研究顯示了竹枝石斛自成一支,與其他石斛親緣關(guān)系遠(yuǎn),支持了這一結(jié)果,但鼓槌石斛與疊鞘石斛、流蘇石斛位于一個(gè)大的分支,親緣關(guān)系較近。寧靜等[28]認(rèn)為黃石斛、大苞鞘石斛、長蘇石斛、流蘇石斛、細(xì)莖石斛、串珠石斛、兜唇石斛和鼓槌石斛親緣關(guān)系比較近,而石斛屬中的鐵皮石斛則自稱一支。在此次的對(duì)比中,鐵皮石斛卻與許多種石斛都有比較親密的關(guān)系,而其他幾種石斛在此次研究中,也顯示了較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。本研究基本確定了所選取的43種石斛的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,為存在分類爭議的物種提供分子學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)束語

通過對(duì)已報(bào)道全葉綠體基因組的43種石斛屬植物進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,確定了43種石斛屬植物之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,解決了單個(gè)條形碼基因無法確定的種間關(guān)系問題。但是由于僅選取測(cè)得43種石斛的全葉綠體,后期將對(duì)更多的石斛進(jìn)行研究,以期為石斛屬植物的種質(zhì)資源的開發(fā)利用、物種鑒定及保護(hù)提供分子學(xué)基礎(chǔ),并為石斛屬物種間進(jìn)化機(jī)制的研究提供一定的參考依據(jù)。