張濤， 殷雪翠， 任飛飛， 董琳， 張佳， 盧高峰

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科， 鄭州 450014

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）是一種慢性疾病，全球患病率超過25%［1］，主要包括非酒精性脂肪肝（NAFL）和非酒精性脂肪肝炎（NASH）［2-3］。NAFLD的特點是脂肪堆積，可進一步發(fā)展為NASH、肝硬化或肝癌［4］。在生理條件下，肝臟是碳水化合物和脂質(zhì)代謝的中心樞紐，脂肪酸（fatty acid，F(xiàn)A）的攝取、酯化、氧化和分泌均發(fā)生在肝細胞中。相當(dāng)大比例的FA來源于飲食（肝臟FA池的15%～30%）、脂肪的從頭合成（肝臟FA池的30%）和禁食期間脂肪組織釋放的FA再循環(huán)［5］。存在于肝臟中的FA以脂滴的形式儲存在肝細胞中，脂滴是動態(tài)的細胞溶質(zhì)細胞器，具有疏水核心，包含并儲存新合成或飲食獲得的中性脂質(zhì)［1-2］。在健康肝臟中，脂滴的數(shù)量和大小受到嚴(yán)格調(diào)節(jié)，F(xiàn)A過量時形成過多的脂滴可導(dǎo)致嚴(yán)重的病理狀況［6］。NAFLD期間肝細胞中脂滴的過度積累可促進脂毒性，同時增加活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生并損傷線粒體膜和DNA［7-8］。肝細胞中氧化應(yīng)激的持續(xù)增加導(dǎo)致細胞凋亡率增加，進而激活受影響肝組織中的炎癥過程。當(dāng)肝實質(zhì)中的壞死性炎癥復(fù)發(fā)或持續(xù)存在時，將嚴(yán)重阻礙組織再生并刺激纖維化的發(fā)展［9-10］。在所有確診的NAFL病例中，多達15%可發(fā)展為NASH——一種伴有纖維化病變的炎癥狀態(tài)，并可進一步發(fā)展為肝硬化，進而肝功能衰竭和肝細胞癌的發(fā)生風(fēng)險增高，病死率顯著升高［11］。

生長分化因子11（growth differentiation factor 11，GDF11）是TGF-β亞家族成員，在哺乳動物胚胎發(fā)育過程中具有多效性。其特點是在不同組織（心臟、骨骼肌、神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟、胰腺和腸道）中的表達強度不同［12］。最近報道［13］GDF11可緩解高脂飲食引起的肥胖、高血糖、胰島素抵抗和NAFLD。另有研究［14］證實，補充GDF11不改變野生型或肥胖小鼠的肝脂質(zhì)積累，而可能誘導(dǎo)輕度肝纖維化。目前，GDF11對肝臟的應(yīng)激反應(yīng)和脂質(zhì)積累的全身影響尚存爭議。對此，本研究擬通過體外細胞實驗探析GDF11在NAFLD中的作用和發(fā)生機制，為NAFLD的分子靶向治療研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 AML-12細胞（小鼠正常肝細胞）由鄭州大學(xué)馬歇爾實驗室贈予；重組GDF11購自美國MedChemExpress公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；油紅O染色液購自北京索萊寶科技有限公司；油酸（oleic acid，OA）、棕櫚酸（palmitic acid，PA）購自美國Sigma公司；甘油三酯測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；ROS檢測試劑盒與線粒體膜電位檢測試劑盒購自中國碧云天公司；氯喹（自噬抑制劑）購自美國AbMole公司；兔抗微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3B）單克隆抗體、兔抗腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine activated protein kinase，AMPK）單克隆抗體、兔抗p-AMPK單克隆抗體均購自英國Abcam公司；兔抗p62（自噬受體蛋白）單克隆抗體購自中國Affinity公司；熒光二抗購自中國武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；Cell NavigatorTM熒光法脂滴檢測分析試劑盒購自AAT Bioquest公司。

1.2 實驗分組 AML-12細胞用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基懸浮，接種至培養(yǎng)皿中，輕輕搖晃混勻，37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。AML-12細胞分為對照組、對照＋GDF11組、模型組、GDF11組及GDF11＋氯喹組。對照組用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；對照＋GDF11組在完全培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入GDF11（100 ng/mL）；模型組使用含F(xiàn)FA（1 mmol/L，油酸∶棕櫚酸=2∶1）的完全培養(yǎng)基48 h誘導(dǎo)肝脂肪變性［15］；GDF11組同時加入FFA和GDF11（100 ng/mL）；GDF11＋氯喹組用含1 mmol/L FFA的完全培養(yǎng)基48 h誘導(dǎo)肝脂肪變性，同時加入GDF11和氯喹（20 μmol/L）。

1.3 脂滴熒光染色 取生長狀態(tài)良好的細胞接種到共聚焦培養(yǎng)皿中，按上述不同分組處理48 h后棄掉培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定10～15 min后PBS洗2～3次，加入1 mL Nile Green染色溶液，將細胞在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育10～30 min，棄去Nile Green工作液，PBS洗2遍，加入DAPI復(fù)染10 min后PBS洗2遍，加入培養(yǎng)液或者PBS，使用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.4 檢測甘油三酯含量 將細胞接種至12孔板中，按上述不同的分組處理48 h后，收集細胞到1.5 mL EP管中，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，留細胞沉淀，用PBS清洗2次，再次離心去上清，留細胞沉淀；加入0.2 mL勻漿介質(zhì)進行勻漿，水浴條件下超聲波破碎（300 W，3～5 s，間隔30 s，重復(fù)3次）；甘油三酯檢測試劑盒進行檢測。

1.5 蛋白印跡法檢測細胞自噬相關(guān)蛋白的表達 收集各組細胞，加入適量RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑于冰上裂解30 min，使用研磨儀破碎膠狀物，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，提取上清液與5×蛋白上樣緩沖液（4∶1體積比混合），沸水浴10 min，然后行蛋白電泳分離蛋白，分離后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，使用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液浸泡聚偏氟乙烯膜，室溫搖床封閉2 h；加入一抗，4 ℃封閉過夜；次日，洗膜后二抗孵育1 h，洗膜后用ECL超特敏發(fā)光液和化學(xué)發(fā)光成像儀曝光顯影。

1.6 免疫熒光檢測自噬相關(guān)蛋白（p62、LC3B）的表達 LC3B被具有蛋白內(nèi)切酶活性的Atg4在羧基端剪切，生成胞質(zhì)LC3B-Ⅰ。LC3B-Ⅰ通過Atg7和Atg3參與的泛素樣反應(yīng)，生成LC3B-Ⅱ，它可以附著到自噬體的膜上，是自噬體的結(jié)構(gòu)蛋白。自噬相關(guān)的特異性自噬底物p62升高，LC3B-Ⅱ下降，表明自噬活力受到抑制；p62下降，LC3B-Ⅱ水平升高，表明自噬功能恢復(fù)。取生長狀態(tài)良好的細胞接種到共聚焦培養(yǎng)皿中，按上述不同的分組處理48 h后棄掉培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定10～15 min后PBS洗2～3次（5 min/次），加入1 mL含0.05% Tween-20的檸檬酸鈉于95 ℃烘箱中孵育20 min，室溫冷卻，PBS洗3次，加入含3%脫脂奶粉、5%山羊血清的PBST封閉2 h，之后加入稀釋好的一抗，4 ℃孵育過夜，第二天吸出一抗，PBST洗3遍，二抗孵育2 h，PBST洗3遍，加入DAPI復(fù)染，封片后置于共聚焦顯微鏡下觀察。

1.7 細胞ROS及線粒體膜電位的檢測 JC-1是熒光親脂性羰花青染料，主要應(yīng)用于測量線粒體膜電位，在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時JC-1為單體（monnmers），產(chǎn)生綠色熒光；膜電位較高時，JC-1形成聚合物（aggregates），可以產(chǎn)生紅色熒光，紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。將共聚焦專用玻片置于24孔板中，將生長狀態(tài)良好的細胞接種于24孔板，按上述分組處理細胞48 h，棄去培養(yǎng)液，ROS檢測試劑盒與線粒體膜電位檢測試劑盒用于檢測細胞內(nèi)ROS水平，使用共聚焦顯微鏡觀察及測量熒光強度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0進行數(shù)據(jù)分析。多組間計量資料比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GDF11減少FFA誘導(dǎo)的肝細胞內(nèi)脂質(zhì)積累 采用共聚焦顯微鏡觀察：模型組細胞內(nèi)綠色脂滴明顯增加，即FFA誘導(dǎo)細胞脂肪變性；GDF11組細胞內(nèi)脂滴的積累程度較模型組減輕（圖1）。高倍鏡下，不同組別的脂滴形態(tài)存在明顯區(qū)別，模型組較GDF11組細胞內(nèi)脂滴體積明顯增大（圖2）。對照＋GDF11組細胞中甘油三酯水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），模型組細胞中甘油三酯水平與對照組相比明顯升高（P＜0.000 1），GDF11組甘油三酯含量較模型組明顯下降（P＜0.000 1）（圖3）。

圖1 FFA和GDF11處理48 h的Nile green染色及熒光定量結(jié)果（×100）Figure 1 Nile green staining and fluorescence quantitative results of FFA and GDF11 treatment for 48 h（×100）

圖2 高倍鏡下脂滴的熒光染色結(jié)果（×630）Figure 2 Fluorescence staining results of lipid droplets at high magnification （×630）

圖3 各組細胞內(nèi)甘油三酯水平比較Figure 3 Comparison of intracellular triglyceride levels in each group

2.2 GDF11可逆轉(zhuǎn)FFA誘導(dǎo)的肝細胞自噬受限 模型組細胞內(nèi)p62的含量明顯上升，LC3B-Ⅱ與LC3B-Ⅰ比值減少，自噬被抑制；GDF11組p62下降，LC3B-Ⅱ與LC3B-Ⅰ比值增加，自噬增強（圖4a）。免疫熒光檢測結(jié)果與Western Blotting結(jié)果一致（圖5、6）。GDF11＋氯喹組LC3B-Ⅱ的積累高于FFA模型組和對照組（圖4b）。與FFA模型組相比，GDF11組p-AMPK的表達增加（圖4c）。與GDF11組比較，GDF11＋氯喹組細胞內(nèi)甘油三酯含量升高（P＜0.001）（圖7）。

圖4 p62、LCB3、AMPK/p-AMPK表達的Western-Blot檢測結(jié)果Figure 4 Western-Blot results of p62， LCB3， AMPK/p-AMPK expression

圖5 p62的免疫熒光及定量結(jié)果Figure 5 Immunofluorescence and quantitative results of p62

圖6 LC3B的免疫熒光及定量結(jié)果（×100）Figure 6 Immunofluorescence and quantitative results of LC3B（×100）

圖7 各組細胞內(nèi)甘油三酯水平比較Figure 7 Comparison of intracellular triglyceride levels in each group

2.3 GDF11減少FFA誘導(dǎo)脂肪肝細胞ROS的產(chǎn)生在脂肪積累條件下，細胞將產(chǎn)生大量ROS，過量的ROS可導(dǎo)致細胞中DNA、蛋白和脂質(zhì)氧化損傷，并最終導(dǎo)致細胞死亡。通過檢測細胞內(nèi)ROS的變化可見，經(jīng)過GDF11處理后，F(xiàn)FA引發(fā)的氧自由基含量明顯減少（圖8）。

圖8 FFA處理細胞后ROS熒光成像及水平比較（×100）Figure 8 ROS fluorescence imaging and level comparison after FFA treatment（×100）

2.4 GDF11改善FFA誘導(dǎo)條件下細胞的線粒體膜電位改變 FFA誘導(dǎo)過后，胞質(zhì)中的綠色熒光明顯升高，與對照組比較，模型組JC-1單體/聚合物升高（P＜0.000 1），細胞線粒體膜電位下降；加入GDF11后，綠色熒光強度減弱，與模型組比較，GDF11組JC-1單體/聚合物下降（P＜0.05），線粒體膜電位回升（圖9）。

圖9 GDF11改善FFA誘導(dǎo)條件下細胞的線粒體膜電位改變（×400）Figure 9 GDF11 improved the changes of mitochondrial membrane potential in FFA-induced cells（×400）

3 討論

NAFLD是在沒有過量飲酒情況下，肝細胞脂肪堆積，與代謝綜合征密切相關(guān)，例如肥胖（尤其是中樞性肥胖）。隨著肥胖和2型糖尿病（T2DM）患病率持續(xù)上升，NAFLD在發(fā)達國家和發(fā)展中國家的患病率也在升高［16］。自噬是一種進化上保守的管家應(yīng)激誘導(dǎo)的溶酶體降解途徑，可回收大分子、受損蛋白質(zhì)或細胞器、細胞質(zhì)和代謝物以滿足代謝需求，并調(diào)節(jié)細胞能量穩(wěn)態(tài)［17］。受損的自噬與代謝紊亂的發(fā)展有關(guān)［18］。NAFLD的特征是代謝過程的廣泛失調(diào)，包括抑制肝臟中的自噬［19］。增強自噬可以防止肝脂肪變性，既往研究［20］使用雷帕霉素誘導(dǎo)自噬，可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、降低甘油三酯水平和改善高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠的胰島素敏感性以保護肝臟免于脂肪變性。考慮到雷帕霉素對人體免疫系統(tǒng)有不良影響，目前尚無針對NAFLD的特效治療藥物。

有研究［21］表明，GDF11在纖維化的人和小鼠肝臟中升高，并揭示了GDF11在慢性肝病組織重塑中的新的潛在作用，盡管是TGF-β超家族的成員，但功能獲得實驗表明GDF11可通過促進LGR5＋（富含亮氨酸重復(fù)序列G蛋白偶聯(lián)受體5陽性）肝祖細胞的擴增以減輕肝纖維化。

有研究［22］表明，GDF11可能通過促進自噬保護心肌細胞免受缺氧誘導(dǎo)的細胞凋亡。但在肝臟中，GDF11與自噬的關(guān)系從未被探討。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)FFA誘導(dǎo)肝細胞出現(xiàn)脂肪變性時，p62的水平明顯升高，LC3B-Ⅱ水平明顯下降，表明自噬活力受到抑制；在加入GDF11后，LC3B-Ⅱ水平升高，p62水平下降，表明GDF11可恢復(fù)NAFLD肝細胞中受損的自噬功能。自噬是一個動態(tài)過程，細胞將自噬物吞噬到自噬小體，指導(dǎo)自噬溶酶體形成并降解自噬物的過程被稱為自噬流，LC3B-Ⅱ作為自噬小體的標(biāo)志，如果LC3B-Ⅱ表達增加，一方面可能由于前期自噬小體增多導(dǎo)致，另一方面可能由于后期自噬溶酶體清除失敗使其積累，因此單一時間點LC3B-Ⅱ的表達改變并不能體現(xiàn)自噬流的改變。本研究通過氯喹阻斷自噬溶酶體的形成，使LC3B-Ⅱ在細胞內(nèi)積累，以便分析自噬流的改變。加入氯喹后可見GDF11處理后LC3B-Ⅱ的積累明顯要高于FFA模型組，表明GDF11增強了NAFLD細胞的自噬流。此外，本研究證實GDF11通過增強自噬來減少NAFLD細胞的脂質(zhì)積累：首先，在經(jīng)過GDF11處理后，細胞內(nèi)的脂滴含量及脂滴大小明顯小于NAFLD細胞，之后使用氯喹，消除了GDF11對細胞內(nèi)甘油三酯水平的影響。同時，本研究發(fā)現(xiàn)GDF11還可以減弱脂肪肝細胞內(nèi)的ROS水平及改善線粒體膜電位，從而起到保護作用。

綜上所述，GDF11可通過上調(diào)細胞自噬，消除高脂導(dǎo)致的肝細胞脂質(zhì)積累，并減少ROS的積累，提升線粒體膜電位，從而改善NAFLD。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：張濤負責(zé)課題設(shè)計，實驗實施，收集數(shù)據(jù)，資料分析，撰寫論文；殷雪翠參與采集數(shù)據(jù)，分析數(shù)據(jù)；任飛飛、董琳、張佳參與統(tǒng)計分析；盧高峰參與課題設(shè)計，審核論文并對論文負責(zé)。