韓浩章 張麗華 李素華 趙榮 王芳 王曉立

（宿遷學(xué)院，宿遷 223800）

猴樟（Cinnamomun bodinieri Levl.）屬于樟科樟屬常綠喬木，主要分布于我國(guó)南方地區(qū)，為我國(guó)主要的綠化樹(shù)種、經(jīng)濟(jì)樹(shù)種和林用樹(shù)種，還是生物醫(yī)藥、食品添加劑、香料、化妝品、抗菌試劑等的重要來(lái)源［1］。猴樟幼苗的生長(zhǎng)速度和抗寒性優(yōu)于香樟，可以作為綠化樹(shù)種在我國(guó)長(zhǎng)江以北地區(qū)進(jìn)行栽培和應(yīng)用，而我國(guó)部分地區(qū)城區(qū)綠地的鹽堿土壤環(huán)境限制了猴樟的引種推廣，耐鹽堿猴樟品種培育成為當(dāng)務(wù)之急。植物對(duì)鹽堿脅迫響應(yīng)機(jī)制亦十分復(fù)雜，脯氨酸是植物適應(yīng)干旱、鹽堿、高溫等逆境脅迫過(guò)程中主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對(duì)陸地棉（Gossypium hirsutum）、李（Prunus triloba）、羊草（Leymus chinensis）和紫花苜蓿（Medicago sativa）［2-5］的研究結(jié)果也表明，鹽堿脅迫條件下植物體內(nèi)的脯氨酸含量會(huì)顯著提高，抗性強(qiáng)的樹(shù)種具有更高的脯氨酸含量。外源施用脯氨酸能夠促進(jìn)植物光合能力和水分利用能力［6-7］，還能通過(guò)誘導(dǎo)紫花苜?？寡趸富钚蕴岣呖果}堿脅迫能力［5］。脯氨酸的生物合成和積累是植物應(yīng)對(duì)滲透和氧化脅迫的重要反應(yīng)之一，高等植物在滲透脅迫條件和低氮條件下脯氨酸的生物合成以Glu途徑為主導(dǎo)，△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）基因被認(rèn)為是脯氨酸合成的關(guān)鍵基因［8］。目前，已在很多植物中發(fā)現(xiàn)調(diào)控脯氨酸代謝的轉(zhuǎn)錄因子，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）的AtNAC069［9］、bHLH轉(zhuǎn)錄因子MYC2［10］通過(guò)抑制P5CS基因的表達(dá)降低脯氨酸的積累。梨（Pyrus betulifolia）PbNAC1［11］、金柑（Fortunella crassifolia）FcWRKY40［12］通過(guò)上調(diào)脯氨酸合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)促進(jìn)脯氨酸的積累。另外，F(xiàn)aNAC2通過(guò)促進(jìn)NbP5CS1的表達(dá)、降低NbproDH2和NbP5CDH的表達(dá)，從而提高Fragaria×ananassa體內(nèi)脯氨酸的含量［13］，白樺（Betula platyphylla）的BpERF11的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致了脯氨酸合成基因BpP5CS1和BpP5CS2的下調(diào)以及脯氨酸分解基因BpProDH和BpP5CDH的上調(diào)［14］。Qin等［15］發(fā)現(xiàn)檉柳（Tamarix hispida）轉(zhuǎn)錄因子ThCRF1可能通過(guò)與ThP5CS相互作用來(lái)調(diào)節(jié)脯氨酸的積累。

鹽堿脅迫對(duì)植物的影響首先從根系開(kāi)始［16］，植物根系中脯氨酸含量［17］和P5CS表達(dá)量［18］在鹽堿脅迫處理后顯著提高，但植物脯氨酸合成響應(yīng)鹽堿脅迫的分子機(jī)制并不清楚。本研究擬構(gòu)建鹽堿脅迫誘導(dǎo)的猴樟根系酵母cDNA文庫(kù)，克隆CbP5CS啟動(dòng)子序列，采用Y1H酵母單雜交技術(shù)篩選與CbP5CS啟動(dòng)子存在互作的蛋白，再通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)鑒定調(diào)控猴樟脯氨酸合成的轉(zhuǎn)錄因子，以期為進(jìn)一步研究鹽堿脅迫下猴樟脯氨酸合成調(diào)控途徑及其網(wǎng)絡(luò)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料選自宿遷學(xué)院園林實(shí)驗(yàn)基地猴樟苗圃地正常生長(zhǎng)、長(zhǎng)勢(shì)一致的1年生猴樟實(shí)生苗，苗高（30±2）cm，葉片數(shù)量統(tǒng)一為20片。試驗(yàn)材料共90株，分2個(gè)處理，每處理45株，每處理分3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每重復(fù)15株，2021年8月20日將幼苗移入水培箱（600 mm×420 mm×380 mm，營(yíng)養(yǎng)液體積40 L）中培養(yǎng)，采用KT板進(jìn)行固定，利用增氧泵24 h充氧，之后每5 d用蒸餾水補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)液體積至40 L。試驗(yàn)所用的營(yíng)養(yǎng)液配方為1/2霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液，微量元素和鐵鹽配方為通用配方，所用化學(xué)藥品均為分析純，采用蒸餾水進(jìn)行配制。

基于課題組前期研究結(jié)果，試驗(yàn)材料培養(yǎng)3周后，向2個(gè)處理營(yíng)養(yǎng)液中加入Na2CO3，濃度分別為0（對(duì)照）、10 mmol/L，此時(shí)的營(yíng)養(yǎng)液pH分別為7.58、9.49。于處理后的第6小時(shí)、48小時(shí)隨機(jī)選取各處理幼苗根系，液氮速凍后，-80℃凍存，備用。

1.2 方法

1.2.1 猴樟根系組織鹽堿脅迫誘導(dǎo)酵母單雜交核三框cDNA文庫(kù)構(gòu)建 采用Trizol法提取1.0 g猴樟對(duì)照和鹽堿處理后6 h和48 h的根系總RNA。使用Oligotex mRNA Kit（Qiagen）分離純化樣本的mRNA。采用Switching Mechanism At 5′ end of the RNA Transcript（SMART）技術(shù)反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA（引物見(jiàn)表1）。按照ADvantage試劑盒，采用LD-PCR技術(shù)將第一鏈cDNA擴(kuò)增為三框雙鏈cDNA。三框引物分別為P1/P2/P3-F、P4-R（表1），擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 3 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 6 min，進(jìn)行33個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。DSN均一化文庫(kù)構(gòu)建基于雙鏈特異性核酸酶（Duplex-Specific Nuclease, DSN）（Primer M1見(jiàn)表1），使用Clontech CHROMA SPINTM+TE-1000層析柱進(jìn)行純化（TaKaRa）進(jìn)行小片段去除，取2 μL用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。將雙鏈cDNA與 pGADT7（lineared）同源重組，轉(zhuǎn)至大腸桿菌（Escherichia coli）感受態(tài)細(xì)胞DH5α，加入5 mL液體SOC培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)1 h。取上述菌液10 μL稀釋 10 000倍后，從中取100 μL涂布含有Amp+的LB平板，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，將三框文庫(kù)剩余轉(zhuǎn)化液分別加甘油至終濃度為20%保存于-80℃，即為原始文庫(kù)菌液。

1.2.2 文庫(kù)鑒定 取轉(zhuǎn)化后細(xì)菌原液10 μL稀釋100倍后, 從中取出10 μL涂布LB平板（含卡納抗性），第2天計(jì)數(shù)。文庫(kù)滴度（CFU/mL）=平板上的克隆數(shù)/0.1 mL×10 000，文庫(kù)總庫(kù)容量（CFU）=滴度（CFU/mL）×文庫(kù)菌液總體積（mL），庫(kù)容量至少應(yīng)大于106。隨機(jī)挑取24個(gè)單克隆，使用T7/3′AD引物（表1）進(jìn)行菌落PCR鑒定。取100 μL原始庫(kù)液涂布在含100 mg/L Amp+LB的培養(yǎng)基上，30℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600=1，采用高純度質(zhì)粒大提試劑盒（Tiangen, DP116）進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)粒提取，于-20℃保存，即為文庫(kù)質(zhì)粒。

1.2.3 猴樟CbP5CS基因啟動(dòng)子克隆與序列分析 根據(jù)沉水樟（Cinnamomum micarnthum）基因組中的CmP5CS基因上游2 000 bp序列（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/57158），設(shè)計(jì)啟動(dòng)子擴(kuò)增引物（pHIS-cx-F：5′-TTCGCTATTACGCCAGCTG-3′；pHIS-cx-R：5′- GTTTATCTTGCCTGCTCATT-3′，表1），采用雙酶切法（EcoR I、Sac I）構(gòu)建到酵母單雜交啟動(dòng)子載體pHIS2上，測(cè)序正確后，命名為pHIS2-HHZ。利用啟動(dòng)子在線分析軟Plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析該啟動(dòng)子的順式作用元件。

1.2.4 誘餌載體轉(zhuǎn)化酵母菌株及自激活檢測(cè) 為確定能夠抑制HIS3表達(dá)背景的最低3-AT濃度，首先將pHIS2-HHZ質(zhì)粒通過(guò)LiAC的方法轉(zhuǎn)化Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞，分別從轉(zhuǎn)化反應(yīng)的平板上各隨機(jī)挑取3個(gè)單菌落，稀釋后涂板至對(duì)應(yīng)的不添加histidine、但添加不同濃度（0、10、20、30、40、50、75 mmol/L）3AT的缺陷型平板上，30℃恒溫培養(yǎng)3 d。根據(jù)菌落的生長(zhǎng)情況，確定最低3-AT的濃度。

1.2.5 酵母單雜交篩選cDNA文庫(kù) 在確定好3-AT濃度之后，利用共轉(zhuǎn)化的方法進(jìn)行酵母單雜交篩選。用含有正確pHIS2-HHZ誘餌質(zhì)粒的Y187酵母轉(zhuǎn)化子作為受體菌制備感受態(tài)，將文庫(kù)質(zhì)粒pGADT7-樟樹(shù)核文庫(kù)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入其中，涂SD-TLH+適宜濃度3AT平板，30℃恒溫培養(yǎng)3-4 d。將篩庫(kù)平板上長(zhǎng)出的初始陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子劃線于SD-TLH+適宜濃度3AT選擇平板，30℃恒溫培養(yǎng)3-4 d，能夠正常生長(zhǎng)的視為互作蛋白。

1.2.6 酵母陽(yáng)性克隆PCR鑒定、測(cè)序及BLAST比對(duì) 采用快速擴(kuò)增酵母陽(yáng)性克隆試劑盒（yeast colony rapid detection kit，南京瑞源）從酵母細(xì)胞中擴(kuò)增出陽(yáng)性克隆，進(jìn)行NGS測(cè)序，并與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，去除空載和重復(fù)序列最終獲得符合要求的序列，再對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.2.7 酵母陽(yáng)性克隆回轉(zhuǎn)驗(yàn)證 依據(jù)比對(duì)結(jié)果，將劃線于SD-TLH+適宜濃度 3AT缺陷型平板上長(zhǎng)出的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子分別用無(wú)菌水稀釋后點(diǎn)至SD-TL、SD-TLH、SD-TLH+20 mmol/L 3AT缺陷平板，30℃恒溫培養(yǎng)3-4 d，驗(yàn)證酵母陽(yáng)性克隆菌落生長(zhǎng)狀況。

2 結(jié)果

2.1 猴樟葉片RNA提取與質(zhì)量檢測(cè)

為了鑒定所提取的RNA是否能用于下游建庫(kù)，從中分別吸取2 μL進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)和分光光度計(jì)測(cè)量，結(jié)果（圖1）顯示，圖片中能清晰地看到28S和18S兩條帶，5S條帶很弱甚至無(wú)，表明所提RNA完整性好，無(wú)降解。OD260/OD280在1.8-2.2之間，表明RNA純度高。因此，所提取RNA可用于下游建庫(kù)。

圖1 RNA提取電泳圖Fig.1 RNA sample assessment

2.2 ds cDNA均一化與小片段去除

為了判斷所獲得的ds cDNA是否合成，PCR結(jié)束后取5 μL進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)，結(jié)果（圖2）顯示，圖片中ds cDNA呈現(xiàn)彌散條帶，表示合成的cDNA質(zhì)量較好，各個(gè)大小的條帶都有。為了驗(yàn)證均一化與小片段是否去除，從純化后的溶液里吸取5 μL進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)，結(jié)果（圖3）顯示，圖片中ds cDNA呈彌散條帶，且無(wú)明顯亮帶，說(shuō)明均一化成功；500 bp以下幾乎看不到條帶，表明小片段去除干凈。

圖2 ds cDNA瓊脂糖電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of ds cDNA

圖3 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)均一化與去小片段Fig.3 Detection of normalization and removal of small fragments using agarose gel electrophoresis

2.3 克隆計(jì)數(shù)與文庫(kù)質(zhì)量鑒定

為了確定文庫(kù)庫(kù)容，從電轉(zhuǎn)孵育后的菌液中吸取10 μL稀釋10 000倍，從中吸取100 μL涂布與含氨芐的LB平板，37℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)，第2天取出平板后，劃線把平板平均分成4份。統(tǒng)計(jì)其中任意一份的克隆數(shù)目，結(jié)果約為122個(gè)/份，得到平板上克隆總數(shù)約為488個(gè)，根據(jù)公式：文庫(kù)庫(kù)容（CFU/mL）=克隆數(shù)/涂布體積×稀釋倍數(shù)，總克隆數(shù)（CFU）=庫(kù)容×菌液總體積，得到庫(kù)容為4.88×107CFU/mL，總克隆數(shù)為9.76×107CFU，該庫(kù)容量能夠保證酵母單雜交篩選得到可靠結(jié)果。為了檢測(cè)所構(gòu)建文庫(kù)的條帶分布情況，從平板上隨機(jī)挑選24個(gè)克隆進(jìn)行菌落PCR，引物為T(mén)7-F/AD-R（表1），PCR結(jié)束后取5 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖4），從圖中可知，所有泳道均有條帶，cDNA片段重組率為100%，且條帶在1 000 bp上下出現(xiàn)，說(shuō)明文庫(kù)片段平均大小在1 000 bp。

圖4 文庫(kù)質(zhì)量鑒定電泳圖Fig.4 Library quality assessment using agarose gel electrophoresis

2.4 猴樟CbP5CS基因啟動(dòng)子克隆與序列分析

以猴樟根系總DNA為模板克隆 CbP5CS基因啟動(dòng)子，經(jīng)測(cè)序鑒定該序列長(zhǎng)2 012 bp。利用Plant-CARE數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析 CbP5CS基因啟動(dòng)子的順式作用調(diào)控元件（表2）。結(jié)果顯示，共預(yù)測(cè)到15種順式作用調(diào)控元件和3種未知功能順式作用調(diào)控元件，包括CAAT-box和TATA-box組成型調(diào)控元件；光響應(yīng)調(diào)控元件AE-box、AT～TATA-box、Box4、G-Box、TCCC-motif和GT1-motif；茉莉酸甲酯（MeJA）響應(yīng)調(diào)控元件CGTCA-motif和TGACG-motif；脫落酸響應(yīng)元件ABRE；厭氧誘導(dǎo)必需調(diào)控元件ARE；分生組織表達(dá)響應(yīng)元件CAT-box；乙烯響應(yīng)元件ERE；轉(zhuǎn)錄因子MYB和bHLH響應(yīng)元件MYB、MYB-like sequence、MYC、Myb和Myb-binding site；赤霉素響應(yīng)元件P-box和TATC-box；水楊酸響應(yīng)元件SARE和TCA-element；壓力響應(yīng)元件STRE；愈傷調(diào)節(jié)響應(yīng)元件WRE3和WUN-motif。

2.5 誘餌質(zhì)粒pHIS2-CbP5CS構(gòu)建與自激活檢測(cè)

取轉(zhuǎn)化了誘餌載體的大腸桿菌菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定，并對(duì)擴(kuò)增得到陽(yáng)性條帶的克隆質(zhì)粒進(jìn)行抽提和測(cè)序。結(jié)果（圖5）表明，菌落PCR結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致，條帶正確，說(shuō)明CbP5CS啟動(dòng)子片段連接到了表達(dá)載體pHIS2上。

圖5 誘餌質(zhì)粒pHIS2-CbP5CS 菌落PCR鑒定Fig.5 Colony PCR identification of decoy plasmid pHIS2-CbP5CS

3AT是酵母HIS3蛋白合成的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，用于抑制His3基因的泄漏表達(dá)。由于HIS3報(bào)告基因的激活，陽(yáng)性對(duì)照理論上在添加3AT抑制劑的平板上能正常生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化子數(shù)量與不添加3AT相同，但是實(shí)際觀察到的生長(zhǎng)值是比不添加3AT的平板降低約10%，并且隨著3AT濃度增加，降低率會(huì)增長(zhǎng)。由自激活檢測(cè)結(jié)果（圖6）看出，在添加20 mmol/L 3AT 的平板上轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)沒(méi)有菌落生長(zhǎng)，顯示未激活HIS3報(bào)告基因，因此決定在20 mmol/L 3AT的基礎(chǔ)上進(jìn)行酵母單雜篩選。

圖6 自激活檢測(cè)背景篩選和最小3-AT濃度Fig.6 Auto-activation detection background screening and minimal 3-AT concentration

2.6 酵母單雜交篩選候選基因

從SD-T平板挑取單克隆菌種接于50 mL液體SD-T培養(yǎng)基上，于30℃、225 r/min條件下振蕩培養(yǎng)18 h。轉(zhuǎn)接于500 mL液體YPDA培養(yǎng)基上，使初始OD600=0.2，再于30℃、225 r/min條件下振蕩培養(yǎng)4-5 h，至OD600=0.6。文庫(kù)DNA轉(zhuǎn)化后，從中取20 μL培養(yǎng)物梯度稀釋后涂效率平板SD-TL 1塊。其余涂SD-TLH+20 mmol/L 3AT共20塊，30℃恒溫培養(yǎng)3-4 d，觀察轉(zhuǎn)化結(jié)果。將上述SD-TLH +20 mmol/L 3AT篩庫(kù)平板上長(zhǎng)出的初始陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子劃線于SDTLH+20 mmol/L 3AT選擇平板，30℃恒溫培養(yǎng)3-4 d。篩庫(kù)結(jié)果表明，篩庫(kù)的SD-TLH+20 mmol/L 3AT平板上生長(zhǎng)出96個(gè)單克隆菌落（圖7）。將96個(gè)陽(yáng)性酵母克隆全部PCR擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)Seqman、BLAST比對(duì)，去除空載和重復(fù)序列最終獲得31個(gè)不同的序列（圖8）。

圖7 酵母單雜交篩庫(kù)結(jié)果Fig.7 Library results screened by yeast one hybrid

圖8 陽(yáng)性酵母克隆比對(duì)結(jié)果PCR擴(kuò)增圖Fig.8 Colony PCR amplification of the positive yeast cloning alignment

2.7 候選基因的生物學(xué)信息分析

對(duì)NGS測(cè)序獲得的31條EST序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST搜索，篩選出期望值e-10以下的序列進(jìn)行同源對(duì)比和功能注釋（表3）。結(jié)果表明，30條EST被功能注釋，另有1條為未能成功注釋；在獲得注釋的互作蛋白中，共有6個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因，分別為GW020491（鋅指CCCH結(jié)構(gòu)域蛋白25異構(gòu)體 x1）、GW028183（AtbHLH104）、GW000650（轉(zhuǎn)錄因子 TFIIIC）、GW007525（RING/FYVE/PHD鋅指超家族蛋白）、GW015686（GATA型鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白）、GW027120（AtbHLH96）；從Read Count 讀數(shù)來(lái)看，GW028183、GW007525和GW027120基因與CbP5CS基因互作的可能性較高。

表3 EST序列比對(duì)結(jié)果Table 3 EST blast and annotation results

2.8 酵母陽(yáng)性克隆回轉(zhuǎn)驗(yàn)證

將上述劃線于SD-TLH+20 mmol/L 3AT缺陷型平板上長(zhǎng)出的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子分別用無(wú)菌水稀釋，點(diǎn)至SD-TL、SD-TLH、SD-TLH+20 mmol/L 3AT缺陷平板，30℃恒溫培養(yǎng)3-4 d。結(jié)果（圖9）表明，篩選得到的31個(gè)陽(yáng)性克隆均能在SD-TL、SD-TLH、SDTLH+20 mmol/L 3AT缺陷型平板上生長(zhǎng)。

圖9 酵母陽(yáng)性克隆回轉(zhuǎn)驗(yàn)證Fig.9 Rotation and confirmation of yeast positive colonies

3 討論

3.1 鹽堿脅迫誘導(dǎo)的猴樟根系酵母cDNA文庫(kù)構(gòu)建

轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與其調(diào)控的基因啟動(dòng)子區(qū)的相關(guān)順式作用元件進(jìn)行特異性結(jié)合，來(lái)達(dá)到直接調(diào)控植物靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、次生物質(zhì)代謝和抗逆反應(yīng)中起到重要的作用。酵母單雜交技術(shù)通常用于篩選與鑒定轉(zhuǎn)錄因子與下游基因啟動(dòng)子的物理結(jié)合，以cDNA酵母文庫(kù)構(gòu)建為核心，篩選與誘餌DNA特異結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，從而獲得調(diào)控蛋白基因。人們通常采用cDNA文庫(kù)的代表性和重組序列的完整性指標(biāo)對(duì)文庫(kù)的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，文庫(kù)的代表性可用文庫(kù)的庫(kù)容量來(lái)反映，表征來(lái)源組織中所表達(dá)的遺傳信息（即mRNA）的完整性程度，當(dāng)cDNA文庫(kù)中獨(dú)立重組子的克隆總數(shù)量即文庫(kù)滴定濃度大于等于1.7×105CFU/mL時(shí)，此文庫(kù)被稱為有效文庫(kù)，文庫(kù)滴定濃度大于等于1×106CFU/mL時(shí)，此文庫(kù)滿足低豐度mRNA的篩選要求。植物cDNA長(zhǎng)度為0.5-3 kb之間，一般情況下會(huì)大于或等于1 kb，文庫(kù)插入片段過(guò)小或過(guò)大都會(huì)對(duì)文庫(kù)質(zhì)量造成一定的影響，只有插入的cDNA片段大小接近全長(zhǎng)cDNA片段時(shí)，文庫(kù)所體現(xiàn)的遺傳信息才更完整。本研究以猴樟根系組織為材料，利用SMART 技術(shù)成功構(gòu)建了堿脅迫誘導(dǎo)的酵母單雜交核三框cDNA文庫(kù)，文庫(kù)滴定濃度約為4.88×107CFU/mL，文庫(kù)插入片段平均長(zhǎng)度在1 000 bp左右，cDNA片段重組率為100%，符合cDNA文庫(kù)完整性、高質(zhì)量的要求，可用于后續(xù)的酵母雜交試驗(yàn)。

3.2 猴樟CbP5CS基因啟動(dòng)子克隆與序列分析

高等植物的脯氨酸生物合成在滲透脅迫條件和低氮條件下以Glu途徑為主導(dǎo)，P5CS被認(rèn)為是脯氨酸合成的關(guān)鍵基因［8］。Ca2+/CaM、H2O2、NO、ABA、H2S和SA等信號(hào)分子可誘發(fā)高等植物中脯氨酸的大量積累［19］。本研究以沉水樟基因組為參考基因組進(jìn)行猴樟鹽堿脅迫誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組分析，篩選出鹽堿處理后顯著上調(diào)表達(dá)的脯氨酸合成酶基因CbP5CS，根據(jù)沉水樟基因組中的CmP5CS基因上游2 000 bp序列克隆出啟動(dòng)子序列，通過(guò)分析共預(yù)測(cè)到15種已知功能的順式作用調(diào)控元件和3種未知功能順式作用調(diào)控元件，其中包含了多個(gè)參與光響應(yīng)、茉莉酸甲酯（MeJA）響應(yīng)、脫落酸響應(yīng)、厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)、乙烯響應(yīng)、赤霉素響應(yīng)、水楊酸響應(yīng)、愈傷調(diào)節(jié)響應(yīng)、壓力響應(yīng)的元件及多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子MYB 和bHLH 結(jié)合位點(diǎn)?？梢酝茰y(cè)P5CS的轉(zhuǎn)錄表達(dá)與光照、MeJA、SA、ABA、GA、乙烯、缺氧、損傷和環(huán)境脅迫有關(guān)，其轉(zhuǎn)錄表達(dá)可能受到MYB、bHLH等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。

3.3 猴樟CbP5CS基因上游調(diào)控因子篩選

目前，已在很多植物中發(fā)現(xiàn)調(diào)控脯氨酸代謝的轉(zhuǎn)錄因子，但不同植物之間在脯氨酸合成調(diào)控機(jī)制方面存在差異。本研究結(jié)合酵母單雜交技術(shù)和NGS測(cè)序技術(shù)獲得了6 個(gè)調(diào)控猴樟脯氨酸合成的轉(zhuǎn)錄因子，包括4 個(gè)鋅指蛋（zincfinger protein, ZFP）和2個(gè)bHLH 轉(zhuǎn)錄因子。ZFP因具有指狀結(jié)構(gòu)特征且能與鋅結(jié)合而得名，是真核生物中最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，在植物的基因表達(dá)與調(diào)控、生長(zhǎng)發(fā)育與衰老、非生物脅迫及生物脅迫等過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。據(jù)報(bào)道，擬南芥中的AtZFP1在鹽堿脅迫下上調(diào)表達(dá)，過(guò)表達(dá)AtZFP1植株比對(duì)照擁有更高的K+、K+/Na+、葉綠素和脯氨酸含量以及更低的Na+和MDA含量［20］。在另一項(xiàng)研究中，ZFP182的過(guò)度表達(dá)促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因水稻中游離脯氨酸和可溶性糖等滲透劑的積累［21］。bHLH超家族以其高度保守的堿性/螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域命名，在梨、蘋(píng)果、李子、水稻、小麥中和玉米中均鑒定出大量的bHLH基因在植物非生物脅迫響應(yīng)中起作用［22-24］。Verma等［10］發(fā)現(xiàn)鹽脅迫通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活A(yù)tMYC2，AtMYC2可以與限速酶基因P5CS的啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)節(jié)脯氨酸的生物合成。在鹽和干旱脅迫下，過(guò)表達(dá)AHDHL導(dǎo)致黃酮生物合成、脯氨酸生物合成和活性氧清除相關(guān)基因上調(diào)［25］。Zhang等［26］發(fā)現(xiàn)CabHLH035能與P5CS的啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)鹽脅迫下辣椒（Capsicum annuum）體內(nèi)脯氨酸含量提高。這暗示ZFP和bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子均有可能通過(guò)調(diào)控脯氨酸的合成，從而提高植物耐鹽堿性。

4 結(jié)論

構(gòu)建了鹽堿脅迫誘導(dǎo)的根組織酵母cDNA文庫(kù)，克隆出CbP5CS啟動(dòng)子序列，采用Y1H酵母單雜交技術(shù)篩選出與CbP5CS啟動(dòng)子存在互作的蛋白，并通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)鑒定出6個(gè)與CbP5CS啟動(dòng)子存在互作的轉(zhuǎn)錄因子，包括4個(gè)ZFP和2個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子。推測(cè)ZFP和bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子均有可能通過(guò)調(diào)控脯氨酸的合成代謝，從而提高植物耐鹽堿能力。