林紅妍 郭曉蕊 劉迪 李慧 陸海

（1.林木育種與生態(tài)修復(fù)國(guó)家工程研究中心，北京 100083；2.樹木花卉育種生物工程國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；3.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083）

植物細(xì)胞壁是由纖維素（cellouse）、半纖維素（hemicellouse）、果膠（pectin）、木質(zhì)素（lignin）多糖和蛋白質(zhì)等物質(zhì)組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，在植物細(xì)胞和組織中發(fā)揮機(jī)械支撐、水分和物質(zhì)運(yùn)輸、防御脅迫的作用［1-2］。纖維素是由纖維素合酶復(fù)合體（cellulose synthase complex，CSC）催化的葡聚糖鏈經(jīng)多次聚合而成。每個(gè)CSC是由18-24個(gè)纖維素合成酶（cellulose synthase，CesA）組成的花環(huán)結(jié)構(gòu)［3］。在擬南芥中，不同的CesA在初生壁和次生壁中發(fā)揮不同的功能［4］。半纖維素是由木聚糖（xylan）、木葡聚糖（xyloglucan）和甘露聚糖（mannan）等組成，木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶/水解酶（xyloglucan endotransglucosylase / hydrolase，XTH）是一類細(xì)胞壁修飾酶，催化小分子木葡聚糖發(fā)生水解或轉(zhuǎn)移［5-6］。木質(zhì)素主要存在于特定細(xì)胞的次生壁中，包括導(dǎo)管細(xì)胞、纖維細(xì)胞等。木質(zhì)素經(jīng)過(guò)苯丙烷途徑合成，苯丙氨酸經(jīng)過(guò)脫氨、羥基化和甲基化修飾以及氧化還原反應(yīng)形成3種木質(zhì)醇（monolignol），香豆醇、松柏醇和芥子醇，分泌到質(zhì)外體后在過(guò)氧化物酶（peroxidase superfamily protein，PER）或漆酶（laccases，LAC）的作用下聚合形成H型、G型和S 型木質(zhì)素［7］。果膠是一類富含半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）的分支雜多糖，在高爾基體中合成時(shí)被高度甲酯化。隨后被分泌到細(xì)胞壁上通過(guò)果膠甲酯酶（pectin methylesterase，PME）作用去甲酯化，該過(guò)程受到果膠甲酯酶抑制劑（pectin methylesterase inhibitor，PMEI）調(diào)控［8-9］。去甲酯化的果膠在多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonases，PG）的作用下被水解成半乳糖醛酸二聚體或單體半乳糖醛酸［10］。果膠裂解酶（pectate lyase，PL）則是通過(guò)β-反式消除作用使GalA的C-5與C-4位生成碳碳雙鍵而導(dǎo)致α-1,4糖苷鍵斷裂，進(jìn)而產(chǎn)生含有不飽和半乳糖醛酸的寡聚糖［11］。細(xì)胞壁中半纖維素與木質(zhì)素共價(jià)連接，而與纖維素則通過(guò)氫鍵或范德華力結(jié)合，它們之間彼此交聯(lián)構(gòu)成細(xì)胞壁骨架［12-13］。果膠則沉積在細(xì)胞壁骨架中，其修飾程度會(huì)影響細(xì)胞壁的強(qiáng)度［14］。細(xì)胞壁作為一個(gè)動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，其發(fā)育受到轉(zhuǎn)錄因子、功能基因和激素等的復(fù)雜調(diào)控［15-16］。

在真核生物中堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）蛋白是一個(gè)龐大的轉(zhuǎn)錄因子家族，擬南芥中133個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子可分為12個(gè)亞家族，AtbHLH68位于第10亞家族［17］。以往研究表明，在棉花中，轉(zhuǎn)錄因子GhbHLH18結(jié)合并激活GhPER8基因表達(dá)，促進(jìn)松柏醇和芥子醇氧化為G型和S型木質(zhì)素，GhbHLH18突變體的棉花纖維更長(zhǎng)且韌性更強(qiáng)［18］。Zhao等［19］研究發(fā)現(xiàn)CmHLB與CmKNAT7相互作用，菊花中過(guò)表達(dá)基因CmHLB導(dǎo)致莖機(jī)械強(qiáng)度，細(xì)胞壁厚度和木質(zhì)素含量上升。在擬南芥中異源表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子SbbHLH1會(huì)導(dǎo)致木質(zhì)素合成基因表達(dá)量以及木質(zhì)素含量下降［20］。Cao等［21］研究表明玉米中的ZmIBH1-1 直接激活次生壁合成基因WAT1，轉(zhuǎn)錄組分析ZmIBH1-1 通過(guò)影響細(xì)胞壁修飾，細(xì)胞發(fā)育和激素相關(guān)基因來(lái)控制玉米葉片角度。以上研究結(jié)果表明bHLHs家族轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控細(xì)胞壁發(fā)育。Le等［22］分別通過(guò)GUS組織定位染色實(shí)驗(yàn)和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AtbHLH68在擬南芥花序莖維管組織中高表達(dá)，因此推測(cè)其在細(xì)胞壁中發(fā)揮主要功能。

為探究轉(zhuǎn)錄因子AtbHLH68通過(guò)哪些途徑參與調(diào)控細(xì)胞壁合成，以pER8-AtbHLH68轉(zhuǎn)基因擬南芥為材料，對(duì)其進(jìn)行雌二醇誘導(dǎo)，獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選差異基因進(jìn)行GO功能和KEGG通路分析，從而探究其影響的下游基因，最后利用RT-qPCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠性，該研究為闡明轉(zhuǎn)錄因子AtbHLH68在細(xì)胞壁發(fā)育方面的分子機(jī)制提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

構(gòu)建pER8-AtbHLH68重組載體，花序侵染法遺傳轉(zhuǎn)化野生型擬南芥獲得轉(zhuǎn)基因pER8-AtbHLH68植株。雌二醇購(gòu)買于上海源葉生物科技有限公司，所有引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 材料種植與樣品處理 pER8-AtbHLH68轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)后將幼苗移栽至無(wú)菌土中，提取葉片DNA，并利用2×M5 Hiper超光速M(fèi)ix試劑盒（聚合酶，北京）通過(guò)PCR法鑒定陽(yáng)性植株，引物如表1所示。培養(yǎng)條件為溫度23℃，光照周期16 h/8 h，光照強(qiáng)度12 000 lx，濕度為70%。擬南芥抽薹15 d左右取其莖并分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組兩組處理，對(duì)照組的處理溶液為DMSO水溶液，實(shí)驗(yàn)組的處理溶液為10 μmol/L的雌二醇溶液。分別取2 h、4 h、6 h、8 h雌二醇處理的擬南芥莖以及DMSO處理的擬南芥莖，去除葉片、果莢和花苞后用錫箔紙包裹迅速投入液氮并存于-80℃冰箱中保存。

表1 引物序列Table1 Primer sequence

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)雌二醇誘導(dǎo)后AtbHLH68表達(dá)量 將2 h、4 h、6 h、8 h雌二醇處理和8 h DMSO處理的擬南芥莖在研缽中用液氮快速粉碎，利用天根公司RNA提取試劑盒（RNAprep Pure 總RNA提取試劑盒，DP441）提取總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fastking cDNA第一鏈合成試劑盒，KR116）反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，使用SuperReal PreMix Plus試劑盒進(jìn)行RT-qPCR，引物如表1，程序?yàn)樘旄镜娜椒?，以Atactin2為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCT方法計(jì)算差異基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 將雌二醇處理以及未處理的擬南芥莖，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書的方法進(jìn)行總RNA提取，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，使用酶標(biāo)儀Agilent 2100檢測(cè)所提RNA的濃度。合格的mRNA使用帶有OligodT的磁珠富集后用打斷Buffer片段化mRNA。片段化的mRNA經(jīng)過(guò)一系列處理建成環(huán)狀RNA文庫(kù)，質(zhì)量檢測(cè)合格后進(jìn)行測(cè)序得到raw reads，利用華大過(guò)濾軟件SOAPnuke篩選得到clean reads。第一次質(zhì)控結(jié)束后將clean reads利用HISAT對(duì)比到參考序列上，讀取比對(duì)率和reads在參考基因上的分布情況判斷第二次質(zhì)控是否合格，如果通過(guò)兩次質(zhì)控則可進(jìn)行后續(xù)分析。基因組測(cè)序部分由華大基因DNBSEQ測(cè)序平臺(tái)完成。

1.2.4 差異基因篩選和分析 經(jīng)雌二醇處理（4 h、6 h、8 h）以及DMSO處理（Control）的4個(gè)樣品表達(dá)水平測(cè)定完成，以Control為參考分別比較4 h、6 h、8 h雌二醇處理的樣品的差異基因，P＜0.05，|log2Ratio|＞1作為篩選差異基因篩選的條件。對(duì)所有顯著差異基因進(jìn)行GO功能富集、KEGG通路富集分析。

1.2.5 RT-qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠性 為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性，隨機(jī)挑取VGD1、PMEI、CAD5、WRKY70、BBE13等基因進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。引物設(shè)計(jì)如表1所示。方法參照1.2.2。

2 結(jié)果

2.1 篩選pER8-AtbHLH68轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗

為篩選轉(zhuǎn)入pER8-AtbHLH68重組載體的陽(yáng)性植株，將所有待測(cè)擬南芥標(biāo)號(hào)并提取葉片基因組DNA，利用PCR法鑒定陽(yáng)性苗。結(jié)果如圖1所示，1-19號(hào)泳道所對(duì)應(yīng)的擬南芥均為pER8-AtbHLH68轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗，鑒定為陽(yáng)性苗的轉(zhuǎn)基因擬南芥可進(jìn)行下一步雌二醇誘導(dǎo)。

圖1 PCR法篩選轉(zhuǎn)基因pER8-AtbHLH68擬南芥陽(yáng)性苗Fig.1 Screening of transgenic pER8-AtbHLH68 Arabidopsis positive plant by PCR

2.2 雌二醇誘導(dǎo)AtbHLH68表達(dá)量檢測(cè)

為了檢測(cè)雌二醇對(duì)AtbHLH68表達(dá)水平的影響，RT-qPCR分析雌二醇誘導(dǎo)2 h、4 h、6 h、8 h后pER8-AtbHLH68轉(zhuǎn)基因擬南芥莖中AtbHLH68的表達(dá)量。結(jié)果如圖2，10 μmol/L雌二醇處理4 h后莖中AtbHLH68表達(dá)量顯著上升，處理8 h后表達(dá)量為對(duì)照組的29倍。

圖2 RT-qPCR分析不同時(shí)長(zhǎng)雌二醇處理下AtbHLH68基因表達(dá)量Fig.2 Expression level of AtbHLH68 under estradiol treatments at different time points by RT-qPCR

2.3 測(cè)序數(shù)據(jù)的過(guò)濾和質(zhì)控

DMSO溶液處理8 h的擬南芥莖作為對(duì)照組和10 μmol/L雌二醇處理4 h、6 h、8 h的擬南芥莖作為實(shí)驗(yàn)組，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。測(cè)序共得到clean date 178.18 M，Q20高于97.78%，Q30高于93.86%，測(cè)序質(zhì)量較高。把每個(gè)樣品中reads對(duì)比到擬南芥基因組上，Total Mapping值均大于96%，Uniquely Mapping值均大于94%（表2）。

表2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)Table 2 Quality control data for transcriptome sequencing

2.4 差異基因分析

與對(duì)照組相比，雌二醇處理4 h的材料有差異基因4 670個(gè)，其中上調(diào)基因923個(gè)，下調(diào)基因3 747個(gè)；雌二醇處理6 h的材料有差異基因4 099個(gè)，其中上調(diào)基因1 325個(gè)，下調(diào)基因2 774個(gè)；雌二醇處理8 h的材料有差異基因2 334個(gè)，其中上調(diào)基因831個(gè)，下調(diào)基因1 503個(gè)（圖3-A, B, C）。與Control相比，對(duì)雌二醇處理4 h、6 h和8 h的差異基因進(jìn)行Venn圖分析，結(jié)果顯示共檢測(cè)到差異基因7 186個(gè)，其中1 037個(gè)差異基因在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均存在顯著差異表達(dá)（圖3-D）。

圖3 4 h、6 h、8 h差異基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)和韋恩圖Fig.3 4 h, 6 h and 8 h DEGs statistical number and Venn diagram

2.5 差異基因GO富集分析

由于10 μmol/L雌二醇處理8 h后AtbHLH68的表達(dá)量達(dá)到對(duì)照組29倍，因此我們對(duì)雌二醇誘導(dǎo)8 h產(chǎn)生的差異基因進(jìn)一步分析。GO功能分類顯示，轉(zhuǎn)錄組中的差異基因富集在細(xì)胞組分（cellular component）、分子功能（molecular function）和生物過(guò)程（biological process）三大類中，共87種功能。在細(xì)胞組分中，主要富集了細(xì)胞壁（cell wall）、植物型細(xì)胞壁（plant-cell wall）、膜錨定成分（anchorde component of membrane）、胞外區(qū)（extracellular regin）、質(zhì)外體（apoplast）等相關(guān)詞條（圖4）。細(xì)胞壁是由果膠、纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等物質(zhì)組成。木葡聚糖是半纖維素的主要組分，編碼木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶/水解酶的差異基因有9個(gè)，其中XTH12、XTH13、XTH14、XTH32基因下調(diào)，XTH8、XTH7、XTH15、XTH11基因上調(diào)。與木質(zhì)素合成相關(guān)差異基因共有21個(gè)，包括PERs基因共9個(gè)，其中PER7、PER33、PER36等基因下調(diào)，PER3、PER52等基因上調(diào)；編碼漆酶的基因LAC17上調(diào)，編碼肉桂醇脫氫酶的基因中CAD7下調(diào)，CAD5、CAD8基因上調(diào)；編碼小檗堿橋酶（berberine bridge enzyme, BBE）基因有8個(gè)，包括BBE7、BBE10、BBE11、BBE13、BBE15、BBE17、BBE25、BBE26等基因均上調(diào)（表3）。

在分子功能中，差異基因主要富集在果膠酶活性（pectinesterase activity）、果膠酶抑制劑活性（pectinesterase inhibitor activity）、FAD結(jié)合活性（FAD banding）、天冬氨酰酯酶活性（aspartl esterase activity）、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的（DNA-banding transcription factor activity）、果膠裂解酶活性等（pectate lyase activity）功能中（圖4）。果膠大量存在于細(xì)胞壁，PMEs主要功能是去除果膠的甲酯基，其中PME4、PME25、PME37、PME43、PME48、PME21、PME12等8個(gè)基因下調(diào)，PME15和PME19基因上調(diào)。差異基因中PMEI19、PMEI14、PMEI11等5個(gè)PMEIs基因上調(diào)，1個(gè)PMEI基因下調(diào)。去甲酯化的果膠會(huì)被果膠裂解酶裂解，其中相關(guān)差異共有基因14個(gè)，5個(gè)基因上調(diào)，9個(gè)基因下調(diào)（表3）。

在生物學(xué)過(guò)程中，差異基因除了被注釋到細(xì)胞壁修飾相關(guān)功能外，在防御響應(yīng)（defense responds）、水楊酸響應(yīng)（response to salicylic acid）和茉莉酸響應(yīng)（response to jasmonic acid）相關(guān)功能中也大量富集（圖4）。茉莉酸途徑標(biāo)志基因VSP1以及參與茉莉酸生物合成基因OPCL1下調(diào)，受水楊酸以及茉莉酸共同誘導(dǎo)響應(yīng)的編碼富含甘氨酸的蛋白的基因GRP23也下調(diào)。此外還有一些響應(yīng)茉莉酸和水楊酸途徑的轉(zhuǎn)錄因子WRKY70、WRKY54、WRKY46表達(dá)量下調(diào)（表3）。

通過(guò)GO功能富集分析顯示，AtbHLH68誘導(dǎo)表達(dá)會(huì)引起擬南芥莖中一些細(xì)胞壁組分合成和修飾相關(guān)基因發(fā)生改變，包括半纖維素代謝、木質(zhì)素合成、果膠修飾和代謝等功能，說(shuō)明AtbHLH68可能通過(guò)影響這些基因的表達(dá)，從而調(diào)控?cái)M南芥細(xì)胞壁的發(fā)育。

2.6 差異基因KEGG通路分析

為了了解AtbHLH68上調(diào)對(duì)擬南芥莖發(fā)育過(guò)程中代謝通路的影響，對(duì)雌二醇誘導(dǎo)8 h產(chǎn)生的差異基因進(jìn)行KEGG通路注釋。分析得出差異基因顯著富集在8條代謝通路中，主要包括戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化（pentose and glucuronate interconversions）、植物病原體互作代謝通路（plant-pathogen interaction）、MAPK信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）、角質(zhì)亞油酸和蠟質(zhì)的生物合成（cutin, suberine and wax biosynthesis）和苯丙烷生物合成途徑（phenylpropanoid biosynthesis）等（圖5）。

圖5 差異基因KEGG富集氣泡圖Fig.5 Bubble diagram of KEGG enrichment of DGEs

果膠修飾與戊糖和葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)化生物學(xué)途徑相關(guān)。果膠修飾與代謝經(jīng)歷了去甲酯化并被降解為多糖片段或者寡糖。PME負(fù)責(zé)去掉果膠上的甲酯基，PMEI通過(guò)翻譯后修飾抑制PME活性。脫甲酯的果膠在PG或是PL的作用下發(fā)生水解或裂解作用（圖6-A）。差異基因富集在果膠修飾的代謝通路中，說(shuō)明AtbHLH68不僅能影響果膠甲酯化修飾程度，還會(huì)影響果膠降解，從而參與果膠的修飾與代謝中來(lái)。

圖6 生物合成通路圖Fig.6 Biosynthetic pathway map

木質(zhì)素的合成通過(guò)苯丙烷生物合成途徑來(lái)完成。產(chǎn)生于莽草酸途徑的苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase, PAL）和肉桂酸4-羥化酶（cinnamate-4-hydroxylase，C4H）作用下形成對(duì)-香豆酸，此后由于對(duì)香豆酰輔酶A3-羥化酶（pcoumaroyl-CoA3-hydroxylase，C3H）、咖啡酸鄰位甲基轉(zhuǎn)化酶（caffeicacid O-methyltransferase，COMT）和阿魏酸五羥化酶（ferulate5-hydroxylase，F(xiàn)5H）3種酶在不同位置羥基化或甲基化導(dǎo)致最后形成3種木質(zhì)素單體結(jié)構(gòu)。在木質(zhì)素單體合成后期，肉桂醇脫氫酶催化香豆醛，松柏醛和芥子醛形成相應(yīng)醇從而促進(jìn)木質(zhì)素單體合成。木質(zhì)素單體在過(guò)氧化物酶或漆酶的作用下聚合為木質(zhì)素。從圖中可以看出，差異基因主要富集木質(zhì)素合成途徑后期，并集中在醛類物質(zhì)催化形成醇類物質(zhì)和不同類型木質(zhì)素單體聚合過(guò)程中（圖6-B）。說(shuō)明AtbHLH68通過(guò)參與苯丙烷生物合成途徑，在木質(zhì)素合成后期發(fā)揮作用，可能會(huì)影響細(xì)胞壁木質(zhì)素單體的生成與聚合。

以上結(jié)果表明AtbHLH68可能在木質(zhì)素單體合成后期及果膠修飾和降解過(guò)程中發(fā)揮作用，從而影響細(xì)胞壁組分和結(jié)構(gòu)。

2.7 RT-qPCR驗(yàn)證

利用RT-qPCR對(duì)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果可靠性進(jìn)行分析。共檢測(cè)6個(gè)基因包括：果膠修飾相關(guān)基因AT5G62350、AT1G56100和VGD1，激素響應(yīng)相關(guān)基因WRKY70，木質(zhì)素合成相關(guān)基因BBE13和CAD5，結(jié)果如圖7，AT5G62350、AT1G56100、BBE13、CAD5表達(dá)量上調(diào)而VGD1、WRKY70表達(dá)量下調(diào)，與轉(zhuǎn)錄組中變化趨勢(shì)一致。

圖7 RT-qPCR檢測(cè)基因的表達(dá)量Fig.7 Detection of genes expressions by RT-qPCR

3 討論

bHLH轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育、光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、脅迫響應(yīng)以及生物合成代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用［23-26］。本研究通過(guò)構(gòu)建雌二醇誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)來(lái)誘導(dǎo)表達(dá)AtbHLH68，利用轉(zhuǎn)錄組篩選AtbHLH68調(diào)控的下游基因，挖掘AtbHLH68在莖發(fā)育中潛在的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示AtbHLH68上調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞壁組分和修飾相關(guān)的基因表達(dá)量發(fā)生變化，主要富集在果膠修飾與代謝和木質(zhì)素合成過(guò)程中。

果膠作為細(xì)胞壁的重要組分，PME通過(guò)影響果膠去甲酯化的模式和程度，從而影響細(xì)胞壁強(qiáng)度和彈性。PME是修飾果膠甲酯化的關(guān)鍵酶，PMEI與PME通過(guò)翻譯后修飾調(diào)控PME活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)果膠甲酯化修飾的穩(wěn)態(tài)［27-28］。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中大多數(shù)PME相關(guān)基因下調(diào)，而PMEI相關(guān)基因上調(diào)。轉(zhuǎn)錄因子如何影響果膠修飾相關(guān)基因表達(dá)從而導(dǎo)致果膠成分改變，有研究顯示AtMYB52可以直接結(jié)合并激活PMEI14和PMEI16，PMEI競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合PME的活性位點(diǎn)從而抑制PME與底物結(jié)合，myb52突變體中PME相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)，果膠甲酯化程度顯著降低［29］。在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，AtbHLH68基因表達(dá)水平上調(diào)后導(dǎo)致PMEI11、PMEI14以及PMEI19的表達(dá)量上調(diào)。然而AtbHLH68是否也能通過(guò)激活PMEIs從而在果膠修飾和降解過(guò)程中起作用值得深入挖掘。

此外，轉(zhuǎn)錄組分析表明，AtbHLH68表達(dá)水平上調(diào)導(dǎo)致次生壁組分合成相關(guān)基因表達(dá)量發(fā)生變化，包括XTHs、BBEs、PERs、CADs以及LACs等眾多基因。研究表明木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶/水解酶在細(xì)胞壁重構(gòu)、松弛細(xì)胞壁以及在細(xì)胞生長(zhǎng)方面起作用［30-31］。BBE通過(guò)氧化苯丙烷途徑中的芳香烯丙基醇（如香豆醇、芥子醇）為相應(yīng)的醛（如香豆醛、芥子醛），影響木質(zhì)素合成［32］。Fernández-Pérez等［33］報(bào)道per52突變體會(huì)導(dǎo)致束間纖維木質(zhì)素含量下降。H2O2能夠激活過(guò)氧化物酶并促進(jìn)木質(zhì)素聚合，而提前清除H2O2則會(huì)使細(xì)胞壁中木質(zhì)素含量降低［34］。AtbHLH68表達(dá)量的改變導(dǎo)致木質(zhì)素合成后期相關(guān)基因表達(dá)量的改變，因此轉(zhuǎn)錄因子AtbHLH68對(duì)木質(zhì)素合成的影響有待探究。

轉(zhuǎn)錄組中還檢測(cè)到激素響應(yīng)、生物和非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)差異基因。細(xì)胞壁作為植物細(xì)胞的保護(hù)屏障，細(xì)胞壁組分變化可能導(dǎo)致植物防御能力改變［35］。水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）參與生物和非生物脅迫響應(yīng)［36］。轉(zhuǎn)錄組分析顯示參與水楊酸和茉莉酸途徑相關(guān)基因在AtbHLH68影響下顯著下調(diào)，轉(zhuǎn)錄因子WRKY70在兩個(gè)激素通路中都被富集并且大量表達(dá)，有研究發(fā)現(xiàn)WRKY70影響植物抵抗非生物脅迫的能力，Chen等［37］研究表明wrky70 wrky54 wrky46三突變體擬南芥抵抗干旱的能力增加，這說(shuō)明WRKY70、WRKY54和WRKY46負(fù)調(diào)控?cái)M南芥抗干旱作用。AtbHLH68表達(dá)量的上調(diào)影響激素響應(yīng)與防御響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，AtbHLH68是否在響應(yīng)生物和非生物脅迫方面發(fā)揮功能還有待研究。

4 結(jié)論

本研究以雌二醇誘導(dǎo)表達(dá)AtbHLH68轉(zhuǎn)基因擬南芥莖為材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，結(jié)果顯示差異基因主要與果膠修飾和代謝、木質(zhì)素合成以及激素響應(yīng)相關(guān)。說(shuō)明轉(zhuǎn)錄因子AtbHLH68可能通過(guò)直接或間接調(diào)控細(xì)胞壁組分合成相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞壁的發(fā)育。