唐雨帆,宋鵬書,李 英,龍俊青

(廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院新陽院區(qū)產(chǎn)二科,南寧 530005)

胎盤早剝是指孕婦妊娠20周后正常位置的胎盤在胎兒娩出前,部分或全部從子宮剝離,發(fā)生率約為2%[1-2]。胎盤早剝的主要病理變化是底蛻膜螺旋小動(dòng)脈痙攣或硬化,引起遠(yuǎn)端毛細(xì)血管變性壞死甚至破裂出血,血液在底蛻膜與胎盤之間形成血腫使該處胎盤從子宮壁剝落,造成這種血管破損的原因尚不明確,目前國內(nèi)外對其機(jī)制的研究熱點(diǎn)為免疫炎癥反應(yīng)[3-4]。細(xì)胞焦亡是一種促炎的程序性死亡方式,其主要依賴于炎性半胱天冬氨酸蛋白酶的活化,進(jìn)而介導(dǎo)白細(xì)胞介素(IL)-1β活化、IL-18分泌,并誘發(fā)炎癥反應(yīng),最終誘導(dǎo)細(xì)胞炎性死亡[5]。細(xì)胞焦亡可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙,在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[6-7]。血管內(nèi)皮損傷是眾多心血管疾病發(fā)生的始動(dòng)因素,而血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡是導(dǎo)致內(nèi)皮損傷的重要原因[8]。本研究推測胎盤組織中發(fā)生細(xì)胞焦亡,進(jìn)而引起血管破損,最終導(dǎo)致胎盤早剝。通過研究細(xì)胞焦亡及其相關(guān)因子,探討胎盤早剝機(jī)制,為胎盤早剝癥狀提供早期的預(yù)警標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年7月至2023年3月在本院定期產(chǎn)檢,并在產(chǎn)檢中通過磁共振成像和彩色多普勒超聲最終確診為胎盤早剝的產(chǎn)婦40例(胎盤早剝組),以及同時(shí)間段妊娠期健康孕婦40例(對照組)。為了防止分娩時(shí)陰道污染胎盤,選擇剖宮產(chǎn)分娩孕婦,所有同意參加本研究的孕婦都簽署《科研知情同意書》。本研究已獲廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[桂婦保院醫(yī)倫快審(2022-2)1號(hào)]。

1.2 方法

1.2.1外周血采集和炎癥因子檢測

兩組孕婦分娩前抽取3 mL外周血,采血管在4 ℃,3 000 r/min離心10 min。收集上層血清轉(zhuǎn)移到凍存管保存于-80 ℃。等所有標(biāo)本收集完畢之后,通過ELISA檢測細(xì)胞焦亡因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1β和IL-18的表達(dá)水平。檢測儀器為美國賽默飛世爾科技公司Multiskan Sky紫外可見光分光光度計(jì)Cary 100,TNF-α(JM-5141H2)、IL-1β(JL13662)和IL-18(JM-1152H1)ELISA試劑盒均購自深圳市優(yōu)里生物科技有限公司。

1.2.2胎盤病理學(xué)形態(tài)分析

剪取娩出胎盤母體面組織塊,置于4%甲醛溶液。組織經(jīng)過脫水和石蠟包埋,切片機(jī)切成2 μm膜片。高溫烘片之后依次浸泡二甲苯和梯度乙醇,流水沖洗,蘇木素液染色5 min,流水清洗膜片,1%鹽酸乙醇浸泡1 s,流水沖洗返藍(lán),0.5%伊紅液染色5 min,80%乙醇、95%乙醇、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ,各浸泡1 s,晾干膜片用中性樹膠封片。

1.2.3電子顯微鏡觀察胎盤早剝患者胎盤組織中細(xì)胞焦亡情況

胎盤組織娩出后快速剪取1 mm×1 mm大小組織塊若干放在3%戊二醛中固定12 h,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次,每次15 min,之后浸泡在1%鋨酸固定2 h,PBS清洗3次,每次15 min。然后乙醇-丙酮逐級(jí)脫水,丙酮和包埋劑(體積比2∶1)滲透2 h,丙酮和包埋劑(體積比1∶3)滲透過夜。環(huán)氧樹脂包埋組織塊,聚合過程需要的溫度和時(shí)間依次為40 ℃ 15 h,48 ℃ 12 h,60 ℃ 48 h,修整組織塊,徠卡UC7超薄切片機(jī)切片,醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色,透射電鏡(日本日立公司,型號(hào):H-7650)觀察細(xì)胞內(nèi)部形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.4Western blot檢測胎盤早剝孕婦胎盤組織細(xì)胞焦亡標(biāo)志蛋白表達(dá)

剪取小塊胎盤組織(避免鈣化區(qū)域),用冷PBS沖洗組織表面的血跡,使用組織研磨機(jī)將胎盤組織在冰上制成勻漿,加入1 mL RIPA裂解緩沖液(含1%蛋白酶抑制劑)。二喹啉甲酸(BCA)法測定提取蛋白水平。蛋白質(zhì)樣品在高溫變性之后通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,100 mA電流持續(xù)120 min將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉孵育30 min,TBST漂洗3次,每次10 min。加入單克隆一抗caspase-1(稀釋比1∶1 000,貨號(hào):ab207802)、Gasdermin D(GSDMD,稀釋比1∶1 000,貨號(hào):ab219800)和NOD樣受體蛋白3(NLRP3,稀釋比1∶1 000,貨號(hào):ab263899),置入4 ℃搖晃孵育12 h,再次TBST漂洗3次,每次10 min,加入二抗(稀釋比1∶8 000,貨號(hào):ab205718)室溫孵育1 h,PVDF膜添加顯色劑孵育5 min,上機(jī)檢測。結(jié)果用凝膠分析軟件處理,Image-Lab軟件計(jì)算標(biāo)志蛋白相對表達(dá)水平。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-qPCR)檢測胎盤早剝孕婦胎盤組織中焦亡因子mRNA的表達(dá)水平

收集胎盤標(biāo)本,100 μg胎盤組織碎塊加入800 μL TRIzol提取RNA,采用美國賽默飛世爾科技公司Nandrop NOE儀器測定RNA水平;按照cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;參照美國賽默飛公司設(shè)計(jì)的反應(yīng)程序加入cDNA、上下游引物、反應(yīng)酶和水進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)程序設(shè)置:85 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性20 s;65 ℃退火40 s;75 ℃延伸35 s;40個(gè)循環(huán),甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因作為管家基因進(jìn)行PCR反應(yīng)。根據(jù)PCR擴(kuò)增曲線,得到兩組標(biāo)本的循環(huán)閾值(Ct值),使用 2-ΔΔCt法計(jì)算兩組胎盤組織中caspase-1、GSDMD和NLRP3 mRNA表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組妊娠期臨床特征比較

兩組身高、體重、BMI、年齡均無明顯差異(P>0.05)。胎盤早剝組孕周屬于孕中期,較對照組明顯縮短(P<0.05);且有疤痕子宮史者占比明顯高于對照組(P<0.05)。統(tǒng)計(jì)兩組妊娠期并發(fā)癥發(fā)生情況,胎盤早剝組腹痛、出血、胎膜早破、子癇前期發(fā)生率均明顯高于對照組(P<0.05),見表1。

表1 兩組妊娠期臨床資料比較

2.2 兩組外周血炎癥因子表達(dá)水平比較

胎盤早剝組外周血TNF-α、IL-1β、IL-18水平均高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 兩組外周血炎癥因子水平比較

2.3 兩組胎盤組織的大體及蘇木素-伊紅(HE)染色病理學(xué)特征

對比妊娠期健康孕婦分娩的胎盤組織,可以發(fā)現(xiàn)胎盤早剝孕婦胎盤組織的母體面有黑褐色血液腫塊,胎兒面血管出現(xiàn)血栓;病理學(xué)染色結(jié)果顯示,胎盤早剝孕婦的胎盤組織內(nèi)部血管破裂和血管溶解,見圖1。

A:對照組胎盤組織母體面;B:對照組胎盤組織胎兒面;C:對照組胎盤組織HE染色; D:胎盤早剝組胎盤組織母體面;E:胎盤早剝組胎盤組織胎兒面;F:胎盤早剝組胎盤組織HE染色。圖1 兩組胎盤組織大體及HE染色病理學(xué)檢測結(jié)果

2.4 電子顯微鏡觀察胎盤早剝孕婦胎盤組織細(xì)胞焦亡情況

在透射電子顯微鏡下,可以觀察到細(xì)胞形態(tài)不完整,細(xì)胞出現(xiàn)溶解,同時(shí)觀察到焦亡小體的出現(xiàn),見圖2。

2.5 兩組胎盤組織細(xì)胞焦亡蛋白表達(dá)水平比較

與對照組比較,胎盤早剝組的胎盤組織中caspase-1和NLRP3表達(dá)水平升高,GSDMD表達(dá)水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見圖3、4。

圖3 兩組胎盤組織細(xì)胞焦亡蛋白灰度圖

a:P<0.001。圖4 兩組胎盤組織細(xì)胞焦亡蛋白相對表達(dá)水平差異柱狀圖

2.6 兩組胎盤組織焦亡基因表達(dá)水平比較

與對照組比較,胎盤早剝組的胎盤組織中caspase-1、NLRP3 mRNA表達(dá)水平升高,GSDMD mRNA表達(dá)水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3。

表3 兩組胎盤組織細(xì)胞焦亡基因相對表達(dá)水平比較

3 討 論

胎盤早剝是指在分娩第2階段完成之前胎盤從子宮內(nèi)膜分離,連接子宮內(nèi)膜和胎盤母體側(cè)的血管網(wǎng)絡(luò)被撕裂[9-10]。目前,胎盤早剝的確切原因尚不清楚,一種普遍的假說認(rèn)為,胎盤早剝繼發(fā)于血管畸形和脆弱的血管系統(tǒng),形成胎盤血管血腫,最終導(dǎo)致胎盤分離[11]。子宮是一種含有肌肉的彈性組織,而胎盤的彈性不如子宮。當(dāng)子宮組織突然拉伸時(shí),胎盤保持穩(wěn)定,連接子宮壁和胎盤的血管結(jié)構(gòu)被撕裂[12-13]。本研究收集胎盤早剝孕婦的胎盤組織發(fā)現(xiàn),胎盤娩出后,胎盤表面出現(xiàn)幾處血凝塊。

最新版《婦產(chǎn)科學(xué)》教材上對于胎盤早剝的病因?qū)W沒有明確定義,不過有文獻(xiàn)闡述胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞通過釋放炎癥因子,誘導(dǎo)免疫細(xì)胞聚集,炎癥反應(yīng)被過度激活,血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,產(chǎn)生血管破裂出血,進(jìn)而導(dǎo)致胎盤與子宮壁發(fā)生剝離[11,14]。本研究檢測胎盤早剝孕婦外周血清炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-18表達(dá)水平均高于妊娠期健康孕婦,同時(shí)胎盤早剝孕婦的胎盤組織病理學(xué)結(jié)果顯示胎盤組織內(nèi)部出現(xiàn)血栓和血管破裂現(xiàn)象,說明炎癥因子可能與血管內(nèi)皮細(xì)胞相互干預(yù)導(dǎo)致蛻膜血管收縮,以及血栓形成伴蛻膜壞死和靜脈出血。血管內(nèi)皮細(xì)胞是覆蓋在血管腔內(nèi)的單層細(xì)胞,為血液和血管壁間的重要物理屏障,其通過產(chǎn)生大量強(qiáng)效血管活性物質(zhì)調(diào)節(jié)血管張力[15-16]。

臨床證實(shí),炎癥或感染與胎盤早剝風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān),在許多胎盤早剝病例中都發(fā)現(xiàn)了無菌炎性改變的特征[17]。ABINAHED等[18]發(fā)現(xiàn),NOD樣受體蛋白7(NLRP7)由滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá),受缺氧調(diào)節(jié),NLRP7的失調(diào)被認(rèn)為可能與胎盤早剝有關(guān)。炎癥變化可能在妊娠前幾周甚至妊娠前就已經(jīng)發(fā)生,潛伏數(shù)周或數(shù)月。細(xì)胞焦亡是由某些炎性小體引發(fā)的細(xì)胞死亡的炎癥形式,導(dǎo)致GSDMD的分裂和非活性細(xì)胞因子如IL-18和IL-1β的激活[19]。細(xì)胞焦亡是血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡的一種形式,參與包括動(dòng)脈粥樣硬化、心力衰竭及心肌梗死等血管損傷性疾病[20-21]。胎盤早剝屬于螺旋動(dòng)脈重構(gòu)不完全和由此引起的胎盤功能障礙導(dǎo)致的妊娠期并發(fā)癥[22]。QIU等[23]發(fā)現(xiàn),高血糖誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活可能是一個(gè)活性氧(ROS)依賴的細(xì)胞焦亡過程,NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)的焦亡加重了糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注損傷。然而,目前尚不清楚胎盤早剝孕婦靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷是否與細(xì)胞焦亡有關(guān)。本研究收集胎盤早剝孕婦的胎盤組織,經(jīng)過電鏡觀察到胎盤組織內(nèi)部細(xì)胞含有少量的焦亡小體。同時(shí)檢測細(xì)胞焦亡的標(biāo)志性分子caspase-1、NLRP3、GSDMD及其mRNA表達(dá)水平,結(jié)果顯示:與妊娠期健康孕婦的胎盤組織相比,胎盤早剝孕婦的胎盤組織中caspase-1、NLRP3及其mRNA表達(dá)水平升高,GSDMD及其mRNA表達(dá)水平降低。結(jié)合外周血清炎癥因子檢測結(jié)果和胎盤組織病理學(xué)染色結(jié)果,表明胎盤早剝孕婦的胎盤組織中發(fā)生細(xì)胞焦亡程序反應(yīng)。發(fā)生在胎盤早剝的免疫學(xué)改變尚不明確,蛻膜組織中NK細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞都有促進(jìn)子宮胎盤螺旋動(dòng)脈重構(gòu)的作用,目前學(xué)界認(rèn)為免疫細(xì)胞(NK細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞)平衡破壞可能導(dǎo)致胎盤早剝[24]。根據(jù)現(xiàn)有資料,觀察到胎盤早剝發(fā)生的同時(shí),子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞的浸潤增加,介導(dǎo)血管成熟、穩(wěn)定過程,啟動(dòng)血管重塑[25]。根據(jù)本研究結(jié)果,作者推測血清TNF-α、IL-1β和IL-18等炎癥因子水平升高抑制血管重塑,造成子宮螺旋動(dòng)脈滋養(yǎng)細(xì)胞無法重鑄,同時(shí)胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的分化和增殖被抑制,侵襲能力降低,促使胎盤血管發(fā)育不良,引發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡,導(dǎo)致胎盤早剝發(fā)生。

綜上所述,胎盤早剝孕婦外周血炎癥因子表達(dá)水平升高,胎盤組織中存在細(xì)胞焦亡小體,細(xì)胞焦亡標(biāo)志性分子的表達(dá)水平也高于健康孕婦。妊娠期胎盤疾病與血管和免疫系統(tǒng)的異常有關(guān),這種異常使得胎盤內(nèi)部血管損傷和壞死等問題發(fā)生,并最終導(dǎo)致胎盤早剝。