萬靜宜，馮 超，陳宇航，徐 騫，林元杰，樂孫陽，盧大勝，邱歆磊

（上海市疾病預(yù)防控制中心，上海 200336）

吡咯里西啶生物堿（Pyrrolizidine alkaloids，PAs）是植物所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，含有該物質(zhì)的植物廣泛分布在世界各地，目前已在6 000多種植物中檢出近600多種不同的PAs及其氮氧化物（PANOs）［1］。攝入高劑量PAs可能導(dǎo)致肝臟損傷，動物實驗發(fā)現(xiàn)其具有遺傳毒性和致癌性，吡咯啶環(huán)的1，2位為雙鍵的PAs 被稱為肝毒性吡咯里西啶生物堿（HPAs），在臨床上可導(dǎo)致肝竇阻塞綜合征（HSOS）［2-5］。茶葉是全球消費最廣泛的飲料之一，其本身不含有PAs，但因茶園中存在含有PAs的植物，可能通過土壤、水等環(huán)境循環(huán)造成茶樹根部吸收從而污染茶葉，同時部分茶園在采摘過程中使用機器收割代替人工采摘可能混入含PAs的雜草從而造成污染［6-8］。

2020年，歐盟發(fā)布相關(guān)條例規(guī)定PAs在茶葉和調(diào)味茶中的限量為150 μg/kg，該限量為21種PAs的總和［9-10］。隨著歐盟法規(guī)頒布，茶葉中PAs的檢測越來越受到關(guān)注。目前PAs的主要檢測方法包括液相色譜法［11］、免疫吸附法［12］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［13-15］等，其中液相色譜法的檢測靈敏度較低，無法對微量或痕量的目標(biāo)物進行準(zhǔn)確檢測，適用于中草藥這類PAs 含量較高的樣品；免疫吸附法雖能夠快速檢測，但無法準(zhǔn)確定量；而高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有靈敏度高［16］、適用范圍廣、選擇性強、操作方便等優(yōu)點，是國際上普遍采用的分析方法［17-19］。目前，我國有關(guān)茶葉中PAs檢測研究的報道較少，且文獻報道的檢測目標(biāo)物未能涵蓋歐盟法規(guī)要求的21種化合物［14］。我國作為茶葉生產(chǎn)與出口大國，亟需建立一種目標(biāo)物能夠涵蓋歐盟限量標(biāo)準(zhǔn)的準(zhǔn)確、高效、批量篩查茶葉中PAs的檢測方法。

本文采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法對促黑激素、石松胺、促黑激素N-氧化物、石松胺N-氧化物和千里光堿等歐盟限量標(biāo)準(zhǔn)中21種PAs進行檢測，可為茶葉等植物源性產(chǎn)品中PAs的來源、組成及風(fēng)險評估提供技術(shù)依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Infinity 1290 高效液相色譜-串聯(lián)Agilent 6490 三重四極桿質(zhì)譜儀（美國Agilent 公司）、Milli-Q 型超純水系統(tǒng)、EZ-2 溶劑蒸發(fā)工作站（英國GeneVac 公司）、Vortex 3 渦旋混合儀（德國IKA 公司）、分析天平（Mettler Toledo公司）、高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）。

甲醇（色譜純，F(xiàn)isher公司）；硫酸（優(yōu)級純，上?？蚂`斯公司）；甲酸（質(zhì)譜級，F(xiàn)isher公司）；其他試劑均為分析純；實驗用水為GB/T 6682-2008［20］規(guī)定的一級水。21 種待測物標(biāo)準(zhǔn)品均購于上海源葉公司。

PTFE 微孔濾膜（13 mm×0.22 μm）、Bond Elut Plexa PCX 固相萃取小柱（200 mg/6 mL，安捷倫公司）、Waters Oasis MCX 固相萃取小柱（150 mg/6 mL，沃特世公司）、Waters Oasis HLB 固相萃取小柱（150 mg/6 mL，沃特世公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（1 000 mg/L）：準(zhǔn)確稱取10 mg（精確至0.1 mg）各PAs 標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至10 mL，得到質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，置于-18 ℃下低溫避光保存，使用時根據(jù)需要混合稀釋。

1.3 樣品前處理

提取：稱取 2.0 g（精確至0.01 g）試樣置于50 mL 聚丙烯離心管中，加入20 mL 0.05 mol/L 硫酸，渦旋振蕩10 min 后靜置過夜，4 ℃下以10 000 r/min 離心5 min，移取10 mL 上清液至15 mL 聚丙烯離心管中。

凈化：使用5 mL甲醇和5 mL 0.05 mol/L 硫酸活化PCX 固相萃取小柱，取10 mL樣品上清液通過活化后的PCX 固相萃取小柱，并用5 mL 甲醇和5 mL 水淋洗，再用10 mL 5%氨水甲醇洗脫。收集全部洗脫液濃縮至近干，10%甲醇水定容至0.50 mL，渦旋振蕩1 min，過0.22 μm濾膜后進樣分析。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件色譜柱：Phenomenex Kinetex F5（150 mm×3.0 mm×2.6 μm）；柱溫：40 ℃；流動相：A 為甲醇，B 為0.1%甲酸水；流速：0.3 mL/min；進樣量：2 μL。梯度洗脫程序：0～1 min，10%～15%A；1～6 min，15%～20% A；6～18 min，20%～50% A；18～24 min，50%～70% A；24～26 min，70%～80% A；26～26.2 min，80%～10% A；26.2～27 min，10% A。

1.4.2 質(zhì)譜條件離子源：ESI（+）；毛細(xì)管電壓：3 000 V；鞘氣溫度：250 ℃；鞘氣流速：11 L/min；干燥氣溫度：200 ℃；干燥氣流速：14 L/min；霧化氣壓力：138 kPa（20 psi）；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。各化合物的保留時間、母離子、子離子和碰撞能量見表1。

表1 21種吡咯里西啶生物堿的質(zhì)譜參數(shù)與保留時間Table 1 MRM parameters and retention times of 21 pyrrolizidine alkaloids

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

由于促黑激素與石松胺的質(zhì)譜碎片一致，兩者無法在質(zhì)譜MRM模式下進行分離，需通過色譜分離后進行定量檢測。國內(nèi)外研究主要使用C18色譜柱對PAs 進行分離［13-14，17］。五氟苯基色譜柱（F5）為基于核-殼技術(shù)的五氟苯基丙基固定相色譜柱，對同分異構(gòu)體的選擇性較好，因此對比了Waters ACQUITY BEH C18柱（100 mm×2.1 mm×1.7 μm）與Phenomenex Kinetex F5 色譜柱（150 mm×3.0 mm×2.6 μm）對21種PAs的分離效果。結(jié)果表明，使用Waters ACQUITY BEH C18（100 mm×2.1 mm×1.7 μm）無法有效分離促黑激素與石松胺。Kinetex F5 色譜柱對促黑激素與石松胺同分異構(gòu)體的分離效果更好，且其余19 種化合物均能實現(xiàn)基線分離。因此，本研究選擇Phenomenex Kinetex F5 色譜柱，21 種PAs 的色譜圖見圖1。

2.2 前處理方法優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑PAs是一類還原性生物堿，其氧化形式（PANOs）也屬于極性分子，易被極性有機溶劑或稀釋后的酸化水溶液提?。?5-16，21］?？紤]到日常生活中人們的泡茶習(xí)慣，本實驗選取1款實際綠茶樣品，比較了0.05 mol/L 硫酸、60 ℃水、80 ℃水及沸水4 種提取溶劑對檢測結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，上述溶劑檢出的PAs 總量分別為85.4、55.6、64.1、60.3 μg/kg，0.05 mol/L硫酸的提取效率最高，這可能是由于硫酸水溶液提高了樣品中PAs 的離子化效率。因此，本研究選用0.05 mol/L 硫酸作為提取溶劑。

2.2.2 凈化方式國內(nèi)外研究主要使用MCX 固相萃取小柱、PCX 固相萃取小柱和HLB 固相萃取小柱對樣品進行凈化處理［14-15，21］。本實驗比較了Bond Elut Plexa PCX 固相萃取小柱（200 mg/6 mL）、Waters Oasis MCX 固相萃取小柱（150 mg/6 mL）和Waters Oasis HLB 固相萃取小柱（150 mg/6 mL）對綠茶加標(biāo)樣品的凈化效果（見圖2）。結(jié)果顯示，21 種PAs 采用上述萃取柱凈化的回收率分別為65.2%～107%、62.4%～105%和46.6%～105%，PCX柱與MCX柱的總體回收率接近，但千里光非林、千里光非林 N-氧化物、千里光堿與春千里光堿采用PCX 柱凈化的回收率比MCX 柱高10%以上，故選擇Bond Elut Plexa PCX柱作為前處理的凈化柱。

圖2 不同SPE凈化柱的回收率比較Fig.2 Comparison of recoveries of different SPE purification cartridges

2.2.3 SPE 洗脫條件經(jīng)前期實驗，本研究選擇5%氨水甲醇作為洗脫溶劑，為了更好地平衡洗脫效率和洗脫體積，對洗脫體積（6～11 mL）進行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，隨著洗脫體積的增加，21 種PAs 的回收率總體呈增加趨勢；10 mL 5%氨水甲醇的洗脫效果達到最佳，21 種PAs 的回收率為74.3%～98.6%，洗脫體積為11 mL與10 mL時目標(biāo)物的回收率無較大差異。因此選擇洗脫體積為10 mL。

2.3 方法評價

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)、線性關(guān)系與檢出限本研究通過比較溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線與基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率評估基質(zhì)效應(yīng)（ME）［22］。計算公式：ME =B/A× 100%（其中A為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，B為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率）。表2結(jié)果顯示，21種PAs的基質(zhì)效應(yīng)為14.3%～153%，表明大部分化合物存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，因此采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線對目標(biāo)物進行定量分析。

表2 目標(biāo)物的線性關(guān)系、基質(zhì)效應(yīng)及檢出限Table 2 Linear relations，matrix effects and LODs of the analytes

以空白茶葉為基質(zhì)，經(jīng)過樣品前處理后得到基質(zhì)空白溶液，配制標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，并采用本方法進行測定。結(jié)果表明，21種PAs在對應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均顯示良好線性關(guān)系（r2≥0.995 0），方法的檢出限（LOD）為0.3～1.0 μg/kg（見表2）。

2.3.2 準(zhǔn)確度與精密度以空白茶葉為基質(zhì)配制低、中、高3個加標(biāo)濃度樣品，進行準(zhǔn)確度與精密度驗證，每個濃度重復(fù)6次（見表3）。結(jié)果顯示，3個加標(biāo)水平下目標(biāo)物的回收率為72.1%～108%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.0%～9.8%。表明本方法的準(zhǔn)確度和精密度較好，能滿足目標(biāo)物的分析要求。

表3 目標(biāo)物的平均回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Average recoveries and relative standard deviations of the analytes（n=6）

2.4 實際樣品測定

采用本方法對市售的60件茶葉樣品進行檢測，包括紅茶、茉莉花茶、鐵觀音、大紅袍、毛尖綠茶等，其中5 件樣品檢出PAs，總含量為1.8～85 μg/kg，結(jié)果均小于歐盟限量標(biāo)準(zhǔn)（150 μg/kg），具體見表4。

表4 樣品中21種PAs的檢出含量（μg/kg）Table 4 Detected contents of 21 PAs in the samples（μg/kg）

3 結(jié) 論

本研究建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）同時檢測茶葉中21種PAs的方法。該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好，通過對市售實際樣品進行檢測，證實了該方法的適用性。此方法涵蓋了21 種PAs，與文獻方法［14］相比，能夠更加準(zhǔn)確地確定樣品中PAs 的總含量，檢測靈敏度達到國際同等水平，為茶葉等植物源性產(chǎn)品中PAs的來源、組成及風(fēng)險評估提供了技術(shù)依據(jù)。