西熱巴姆，尼珍，色珍，格桑頓珠

(西藏藏醫(yī)藥大學，拉薩 850000)

藏藥結血蒿又稱普爾芒那保，是菊科植物毛蓮蒿的干燥地上部分，味苦，有濃烈香氣[1]，有廣譜抗菌作用，被廣泛用于藏醫(yī)臨床，主治蟲病、腦炎、皮膚病、溫毒疔毒瘡、咽喉病等癥，具有清熱解毒、消腫消炎、殺蟲利濕等功效[2]。此外，現代研究發(fā)現毛蓮蒿還具有抗氧化、抗肥胖、抗腫瘤和免疫調節(jié)活性等多種藥用價值[3]。目前其藥效成分和作用機制尚不清楚。筆者利用頂空靜態(tài)加熱萃取技術分離提取結合氣相色譜-質譜聯用技術和超高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱高分辨質譜法，對結血蒿的化學成分進行全面解析，以期為探究結血蒿作用機制研究和藥物的開發(fā)利用提供參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

電子分析天平：CP225D 型，感量為0.01 mg，德國賽多利斯公司。

粉碎機：DFY-1000C 型，溫嶺市林大機械有限公司。

超聲清洗器：KQ-250E 型，昆山市超聲儀器有限公司。

恒溫混勻儀：MSC-100 型，杭州奧盛儀器有限公司。

漩渦混勻器：MX-S 型，美國賽洛捷克公司。

臺式離心機：Heraeus Biofuge Primo R 型，美國賽默飛世爾科技公司。

旋轉蒸發(fā)器：R-300EL 型，瑞士布奇公司。

氣相色譜-質譜聯用儀：7694E-6980 N-5975B型，美國安捷倫科技公司。

液相色譜-質譜聯用儀：Thermo Fisher Ultimate 3000 型及 Q Exactive 型，配套質譜工作站為Xcalibur 3.0 型，美國賽默飛世爾科技公司。

結血蒿樣品：經山東中醫(yī)藥大學劉紅燕教授鑒定為毛蓮蒿的干燥地上部分，標本存放于山東中醫(yī)藥大學藥學院，編號為 2022JXH01。

標準物質：柚皮素、木犀草素、綠原酸、槲皮素、白楊素、阿魏酸、高良姜素、芹菜素、異鼠李素、木犀草苷、橙皮素的質量分數均大于98 %，成都值標化純生物技術有限公司。

甲醇、甲酸、乙腈：HPLC級，美國賽默飛世爾科技公司。

無水乙醇：分析純，吉林省新天龍實業(yè)股份有限公司。

石油醚：分析純，上海滬試化工有限公司。

實驗用水：蒸餾水，廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

1.2 實驗步驟

1.2.1 樣品預處理

氣相色譜-質譜聯用樣品：取10 mg結血蒿粉碎放入30 mL鉗口頂空進樣瓶中備用。

液相色譜-質譜聯用樣品：取20 mg 結血蒿，加200 mL 甲醇超聲60 min，重復3 次得到結血蒿甲醇提取液。蒸干溶劑得浸膏，甲醇復溶至50 mg/mL，過0.22 μm濾膜保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 標準品溶液配制

稱取柚皮素、木犀草素、綠原酸、槲皮素、白楊素、阿魏酸、高良姜素、芹菜素、異鼠李素、木犀草苷和橙皮素1 mg，精確至0.01 mg，以甲醇定容，配制成1 mg/mL 單一標準溶液，各單一標準溶液均取100 μL混合，過0.22 μm濾膜保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 儀器工作條件

1.3.1 氣相色譜-質譜聯用儀

進樣口溫度：250 ℃；柱箱溫度：50 ℃，機箱溫度（Aux-2 溫度）：280 ℃；離子源：EI；掃描模式：全掃描模式；載氣：氮氣，流量為0.5 mL/min；柱溫：初始50 ℃保持3 min，以40 ℃/min 的速度升溫到250 ℃，保持3.5 min；進樣方式：分流進樣，分流比為10：1；溶劑延遲：3 min；離子源溫度：230 ℃；四級桿溫度：150 ℃；電子轟擊能量：70 eV［4］。

1.3.2 液相色譜-質譜聯用儀

色譜柱：ACQUITY UPLC?HSS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國沃特世科技有限公司）；柱溫：35 ℃；流動相：A相為0.05%（質量分數，下同）甲酸-水，B 相為0.05%甲酸-乙腈，流量為0.3 mL/min，梯度洗脫；洗脫程序：0～2.5 min 5% B 相，2.5～4 min 5%～18% B 相，4～18 min 18%～25% B 相，18～21 min 25%～40% B 相，21～29 min 40%～70% B 相，29～32 min 70%～100% B相；掃描模式：全掃/二級質譜掃描（Full MS/dd-MS2）；碰撞能量：20、40、60 eV；掃描范圍：m/z100～1 500。

1.4 成分分析與結構鑒定

1.4.1 揮發(fā)性成分鑒定

利用NIST11譜庫和保留時間、保留指數對所得到的質譜圖進行檢索定性。

1.4.2 非揮發(fā)性成分鑒定

通過UPLC-Q-Orbitrap-MS 對結血蒿甲醇提取物進行正、負模式采集，得到總離子流圖。目前對結血蒿非揮發(fā)性物質成分的研究較少，檢索 TCMSP數據庫，并在 Pubmed 及 CNKI 查閱相關的國內外文獻，在根據結血蒿的種屬、科目，在蒿屬、菊科植物等結血蒿親緣性植物中建立化合物數據庫。使用Xcalibur 3.0 軟件，根據各成分的元素組成計算精確質量數，結合分子離子、碎片離子信息，分析標準品的質譜裂解規(guī)律并比對相關文獻報道內容，從而鑒定化學成分。

首先通過一級 MS 確定準分子離子峰，利用Xcalibur 3.0 質譜工作站中的化學式預測功能，預測出化學式；再根據 MS2裂解碎片信息，進行相關基團和母核結構的推導，總結出特征碎片離子；最后參照結血蒿提取物所含成分的質譜裂解規(guī)律對結構進行推測和指認。

2 結果與討論

2.1 氣相色譜條件

參照文獻[4]色譜條件，結血蒿各組分分離良好。

2.2 液相色譜條件優(yōu)化

為提高離子響應度和改善峰形，并參考前期文獻，選定含0.05%甲酸的水為A 流動相和含0.05%甲酸的乙腈為B流動相[5]。

分別選擇梯度洗脫（1）0 ～ 2 min 5% B，2 ～ 4 min 5% ～ 19% B，4 ～ 13 min 19% ～ 40% B，13 ～22.5 min 40% ～ 100% B，22.5 ～ 24 min 100% B；（2）0 ～ 3 min 5% B，3 ～ 4 min 5% ～ 19% B，4 ～ 21 min 19% ～ 45% B，21 ～ 26 min 45% ～ 100% B，26 ～27 min 100% B；（3）0 ～ 2.5 min 5% B，2.5 ～ 4 min 5% ～18% B，4 ～ 18 min 18% ～ 40% B，18 ～ 26 min 40%～80% B，26 ～ 27 min 80% ～ 100% B；（4）0 ～ 2.5 min 5% B，2.5 ～ 4 min 5% ～ 18% B，4 ～ 15 min、18% ～25% B，15 ～ 18 min 25% ～ 40% B，18 ～ 26 min 40%～ 80% B，26 ～ 27 min 80% ～ 100% B 進行預實驗。根據總離子流圖，在某些時間段出峰少、響應低，適當縮短此段時間；相反，在某些時間段出峰較多、峰形不理想，則適當延長此段時間。最終優(yōu)化的流動相洗脫梯度見1.3.2。

2.3 基于GC-MS分析的結血蒿揮發(fā)性成分鑒定

利用氣相色譜-質譜聯用技術分析，結血蒿樣品的總離子流圖如圖1。在結血蒿中鑒定到62種揮發(fā)性成分，包括19 種醇類、3 種醛類、12 種酯類、酮類等。其中含量較高的成分有2,5-二甲基-3-乙烯基-1,4-己二烯、4-甲基-1-丙-2-基雙環(huán)[3.1.0]己-2-烯、檜烯、反式-2,7-二甲基-4,6-辛二烯-2-醇、二環(huán)[3.1.1]庚-2-烯-4-醇，2,6,6-三甲基乙酸鹽、2-甲基六-3,5-二烯-2-醇、2-甲氧基-1,7,7-三甲基雙環(huán)[2.2.1]庚烷、10-十一烷二烯酸甲酯等，見表1。

表1 結血蒿揮發(fā)性成分鑒定結果

表2 結血蒿非揮發(fā)性成分鑒定結果

圖1 GC-MS分析結血蒿總離子流圖

圖2 LC-MS分析結血蒿總離子流圖

圖3 LC-MS分析混合標準品總離子流圖

2.4 基于LC-MS分析結果的結血蒿非揮發(fā)性成分鑒定

采用 UPLC-Q-Orbitrap-MS 技術分析結血蒿樣品溶液和標準品溶液的化學成分，主要鑒定信息見表 2。結血蒿甲醇提取液的總離子流圖見圖 2?；旌蠘藴势啡芤旱目傠x子流圖見圖 3。

2.4.1 氨基酸類成分鑒定

植物中氨基酸具有調節(jié)免疫功能和保護、改善神經系統(tǒng)等作用[15]，在結血蒿中共鑒定到精氨酸、脯氨酸、纈氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸5種氨基酸。

2.4.2 有機酸類成分鑒定

有機酸是存在于生物中的一種含有羧基的酸性有機化合物，具有促消化、抗氧化、改善心血管功能、抑菌消炎等作用[16-17]。在結血蒿中共鑒定到阿魏酸、沒食子酸、焦性沒食子酸、綠原酸等10種有機酸類化合物。以綠原酸和阿魏酸為例分析結血蒿中有機酸的解列規(guī)律。

2.4.3 苯丙素類成分鑒定

苯丙素常見于玄參科和唇形科植物，在一些藏藥中也廣泛存在[18]。苯丙素具有多種藥理活性，包括抗菌消炎、抗病毒、改善心血管功能等[19-20]。結血蒿中共鑒定到香豆素、6-甲基香豆素、茵陳色原酮3種苯丙素類化合物成分。經典香豆素類化合物裂解規(guī)律強，可以連續(xù)解離[CO]，以化合物17 香豆素為例，母離子m/z147.044 0 連續(xù)兩次解離[CO]，分別得到m/z119.049 4、91.054 8離子。

2.4.4 黃酮類成分鑒定

黃酮類化合物是以C6—C3—C6為基本碳骨架的化合物，是廣泛存在于自然界植物中的次生代謝產物，且存在形式多樣。黃酮有抗菌消炎、抗氧化、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化等多種生物活性，受到人們的廣泛關注[21-23]。在藏藥結血蒿中共有異槲皮苷、忍冬苷、木犀草素、槲皮素、柚皮素、橙皮素、芹菜素、異鼠李素等21 種黃酮化合物被鑒定出。黃酮類化合物質譜圖有較強的特異性，容易辨認識別，多為RDA 裂解伴隨CO2、H2O 的掉落。以柚皮素為例代表黃酮類化合物的裂解規(guī)律，母離子m/z271.061 0經DRA 裂解得到m/z151.002 2、107.012 2，m/z151.002 2 離子，在負離子模式下解離CO 得到m/z119.048 6離子。

3 結語

結血蒿作為一味傳統(tǒng)藏藥，臨床應用十分廣泛，具有抗菌消炎、抗氧化、改善心血管功能等作用。筆者利用 GC-MS 技術和 UPLC-Q-Orbitrap-MS 技術對結血蒿的揮發(fā)性和非揮發(fā)性成分進行全面的鑒定，結果表明，結血蒿中主要含有醇、醛、酯、酮等62種揮發(fā)性成分和氨基酸、有機酸、苯丙素、黃酮等化學成分共62種非揮發(fā)性成分，支持結血蒿發(fā)揮各種藥理活性。結血蒿的物質基礎研究為其進一步的開發(fā)利用和質量控制奠定了基礎，并為其藥理作用的深入研究和藥理活性的深入發(fā)掘提供科學依據。