張小媚，陳桂琴，肖樹雄

（廣東省藥品檢驗所，國家藥品監(jiān)督管理局化妝品風(fēng)險評估重點實驗室，廣州 510663）

艾地苯醌，又名艾地苯，是用于治療老年性癡呆、腦功能代謝及精神癥狀的藥物。近年來隨著對艾地苯醌研究的深入，發(fā)現(xiàn)其具有清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、抑制炎癥、抑制DNA損傷、抑制黑色素生成等多種抗衰老功效，因而逐漸被運用到化妝品領(lǐng)域中[1]。近年來，除了大麻提取物、煙酰胺、多肽類、果酸、積雪草提取物[2]等熱門功效成分，艾地苯醌也憑著優(yōu)秀的抗氧化作用，成為護膚產(chǎn)品中很火的功效成分。

近幾年，化妝品功效越來越受到消費者的重視。功效是化妝品的關(guān)鍵屬性，也是企業(yè)創(chuàng)新的重要載體[3]。然而，功效原料[4]價格昂貴，有些商家為了獲得利潤，會進(jìn)行概念性添加、虛假夸大宣傳效果，欺騙消費者，但添加起效濃度以下的成分根本起不到宣稱的功效作用。這種概念性添加及虛假宣稱的行為嚴(yán)重擾亂了化妝品市場的秩序，損害了消費者的合法權(quán)益。而我國現(xiàn)行《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》[5]中缺少功效成分的檢測項目和方法。因此，化妝品監(jiān)管急需解決的問題之一便是開發(fā)和研究功效成分的檢測方法。目前，功效成分的檢測方法主要有高效液相色譜法［6-8］、超高效液相色譜法［9］、質(zhì)譜法［10-11］等。高效液相色譜法是檢測藥物中艾地苯醌的主要方法，檢測化妝品中艾地苯醌的方法尚未建立[12-14]。艾地苯醌作為近年十分熱門的功效原料之一，急需建立其相應(yīng)的檢測方法以滿足化妝品監(jiān)管的需要。此外，化妝品成分復(fù)雜，目標(biāo)物可能存在基質(zhì)干擾，因此需要優(yōu)化前處理方法以排除基質(zhì)干擾。

筆者建立高效液相色譜法測定化妝品中艾地苯醌的含量，并與其產(chǎn)品標(biāo)簽的成分、含量進(jìn)行比對，對產(chǎn)品是否含有宣稱功效成分、使用量是否與標(biāo)簽標(biāo)識相符等基本情況進(jìn)行考察評估，不僅為政府監(jiān)管部門打擊功效化妝品的虛假宣傳、概念性添加的違法行為提供技術(shù)支持，而且可以此為示范，逐漸形成打擊概念性添加和虛假宣稱等違法行為的新的監(jiān)管模式。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Shimadzu LC-20AT 型，配二極管陣列檢測器（DAD），日本島津公司。

電子分析天平：XS205DU 型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

超聲波清洗器：M8800H-C 型，美國必能信公司。

超純水發(fā)生器：Milli Q 2882 型，美國密理博公司。

渦旋振蕩器：MS 3 digital型，德國艾卡公司。

艾地苯醌標(biāo)準(zhǔn)品：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為98.48%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

甲醇：色譜純，霍尼韋爾（中國）有限公司。

氯化鈉：分析純，廣州化學(xué)試劑廠。

飽和氯化鈉溶液：稱取20 g氯化鈉，置燒杯中，加入40 mL水，邊加邊振搖，靜置。

化妝品樣品：包括精華、面霜，市售，均標(biāo)識含有艾地苯醌成分。

實驗用水為Milli-Q 系統(tǒng)（美國密理博公司）自制超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

艾地苯醌標(biāo)準(zhǔn)儲備液：1 000 mg/L，準(zhǔn)確稱取艾地苯醌標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg（精確至 0.01 mg）于20 mL棕色容量瓶中，以甲醇溶解并定容。

艾地苯醌系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別精密移取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，以甲醇稀釋，質(zhì)量濃度分別為1、10、20、50、100、200 mg/L。

1.3 樣品處理

稱取化妝品樣品 0.5 g（精確至0.000 1 g）于10 mL具塞比色管中，加入飽和氯化鈉溶液1 mL，渦旋30 s，加入甲醇5 mL，渦旋30 s，超聲提取15 min，并用甲醇定容，搖勻，靜置后取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，濾液作為樣品溶液。

1.4 液相色譜條件

色譜柱：OSAKA SODA CAPCELL PAK MGⅡC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，日本資生堂公司）；柱溫：40 ℃；流量：1.0 mL/min；檢測波長：278 nm；流動相：甲醇-水（80∶20）；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.5 樣品測定

分別精密吸取艾地苯醌系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液各10 μL，經(jīng)高效液相色譜儀測定，記錄色譜圖及光譜圖，以保留時間和光譜圖定性，色譜峰面積定量，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以外標(biāo)法計算艾地苯醌的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的選擇

由于艾地苯醌極難溶于水，極易溶于氯仿、甲醇，但氯仿易揮發(fā)、毒性大，因此選擇甲醇作為提取溶劑?？疾炝思状肌?0%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇水溶液、飽和氯化鈉-甲醇溶液3 種溶液體系對目標(biāo)物質(zhì)的提取效果。結(jié)果表明，采用甲醇或80%甲醇水溶液處理的樣品基質(zhì)不能較好地沉淀，且用0.22 μm 濾膜較難過濾；若樣品處理時先加入1 mL飽和氯化鈉溶液對樣品進(jìn)行預(yù)分散，再用甲醇提取，提取液經(jīng)0.22 μm濾膜更容易過濾。此外，同時考察了甲醇、飽和氯化鈉-甲醇作為提取溶劑時的目標(biāo)物回收率，分別向膏霜、乳液、面膜、凝膠、液體水基5種空白基質(zhì)中加入艾地苯醌標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配成質(zhì)量濃度為50 mg/L的加標(biāo)溶液，經(jīng)液相色譜儀測定，計算回收率，結(jié)果見表1。由表1可知，兩種提取溶劑在不同基質(zhì)中的回收率均大于100%，綜合考慮樣品處理過程的便利性，最終選取飽和氯化鈉-甲醇的溶液體系作為提取試劑。

表1 不同提取溶劑艾地苯醌的回收率%

此外，考察了超聲時間對測定結(jié)果的影響。選取含有艾地苯醌的膏霜類陽性樣品，按1.3方法用飽和氯化鈉-甲醇溶液處理后，分別超聲提取15、30 min 后測定并計算艾地苯醌的提取率。結(jié)果表明，樣品超聲15 min 和30 min 的提取效果（測得含量）沒有明顯差異，因此超聲時間選擇15 min。

2.2 色譜柱及柱溫選擇

分別考察Phenomenon Titank C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司）和OSAKA SODA CAPCELL PAK MGⅡ C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，日本資生堂公司）對目標(biāo)物的分離效果。在其它色譜條件一致的情況下，兩個品牌的色譜柱系統(tǒng)適用性參數(shù)（理論塔板數(shù)、對稱因子、分離度等）均能滿足要求，艾地苯醌的色譜峰形及峰面積均無顯著差異，且目標(biāo)物的色譜峰均沒有基質(zhì)雜質(zhì)峰干擾。從檢驗效率及成本方面考慮，最終選取保留時間相對較短的OSAKA SODA CAPCELL PAK MGⅡC18色譜柱進(jìn)行分析。

柱溫是液相色譜儀的重要參數(shù)，控制柱溫可提高保留時間的重現(xiàn)性。一般情況下，較高柱溫能增加樣品在流動相中的溶解度，縮短分析時間。分別考察了OSAKA SODA CAPCELL PAK MGⅡ C18色譜柱柱溫為30 、35、40 ℃時對目標(biāo)物分離效果的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)柱溫為30 、35、40 ℃時，艾地苯醌的保留時間分別為9.1、8.7、8.1 min，保留時間差別不大，且與樣品基質(zhì)均能較好的分離，以較短保留時間為原則，最終柱溫選擇為40 ℃。

2.3 流動相的選擇

考察了常用流動相甲醇-水（72∶28）、甲醇-水（80∶20）和乙腈-水（72∶28）三種流動相體系對艾地苯醌色譜行為的影響。結(jié)果顯示，目標(biāo)物質(zhì)在三種流動相系統(tǒng)都具有良好的保留效果。但以甲醇-水（80∶20）或乙腈-水（72∶28）作流動相時目標(biāo)物質(zhì)的保留時間接近（約8 min），比甲醇-水（72∶28，）作流動相時的保留時間（17.6 min）縮短了將近10 min。其次，乙腈的毒性大，成本較甲醇高，且流動相和提取溶劑種類一致能減小溶劑效應(yīng)，因為實驗中不同基質(zhì)樣品的提取溶劑均采用了甲醇，故綜合考慮，選擇相對低毒、低成本、且與樣品基質(zhì)分離效果良好的甲醇-水（80∶20）作為流動相。艾地苯醌標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖如圖1所示。

圖1 艾地苯醌標(biāo)準(zhǔn)溶液高效液相色譜圖

2.4 檢測波長的選擇

取艾地苯醌標(biāo)準(zhǔn)溶液，以二極管陣列檢測器，在190～400 nm 波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，得到艾地苯醌標(biāo)準(zhǔn)溶液的紫外吸收光譜圖，如圖2 所示。結(jié)果顯示艾地苯醌在278 nm 附近有最大吸收。結(jié)合相關(guān)參考文獻(xiàn)[12-14]，選擇278 nm 作為艾地苯醌的檢測波長。

圖2 艾地苯醌標(biāo)準(zhǔn)溶液紫外吸收光譜圖

2.5 進(jìn)樣體積的選擇

分別考察了進(jìn)樣體積為5、10、20 μL 時對測試結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)進(jìn)樣體積為5 μL 時，信噪比過小影響檢測精度；當(dāng)進(jìn)樣體積為10 μL時，信噪比能達(dá)到要求，且色譜峰形較理想；當(dāng)進(jìn)樣體積為20 μL、進(jìn)樣質(zhì)量濃度達(dá)到1 000 mg/L 時，色譜柱出現(xiàn)樣品過載，色譜圖中出現(xiàn)拖尾峰。綜合考慮，選擇艾地苯醌的進(jìn)樣體積為10 μL。

2.6 線性關(guān)系、檢出限及定量限

精密吸取艾地苯醌系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各10 μL，注入液相色譜儀測定。以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度（x，mg/L）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計算線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

取膏霜、乳液、面膜、凝膠、液體水基5種空白樣品各0.5 g，分別定量添加艾地苯醌標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測。在5種基質(zhì)中，以信噪比為3時對應(yīng)的溶液質(zhì)量濃度確定方法檢出限，以信噪比為10時對應(yīng)的溶液質(zhì)量濃度確定方法定量限。

艾地苯醌線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限和定量限見表2。由表2可知，艾地苯醌質(zhì)量濃度在1～200 mg/L范圍內(nèi)與對應(yīng)色譜峰面積線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，方法檢出限為1.0 mg/kg，定量限為4.0 mg/kg。

表2 艾地苯醌的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限

2.7 加標(biāo)回收試驗

稱取膏霜、乳液、面膜、凝膠、液體水基5種空白樣品各0.5 g，分別加入適量艾地苯醌標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.3 方法處理，制成質(zhì)量濃度分別為0.2、10、50 mg/L 的加標(biāo)樣品溶液，每一加標(biāo)水平平行制備樣品6 份，按1.4 色譜條件測定，計算加標(biāo)回收率及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），測定和計算結(jié)果見表3。由表3可知，艾地苯醌在5種化妝品基質(zhì)中的平均加標(biāo)回收率為95.61%～107.87%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.22%～3.07%，表明該方法精密度、準(zhǔn)確度均較高，可滿足日?；瘖y品中艾地苯醌的檢測要求。5 種化妝品空白基質(zhì)溶液、加標(biāo)樣品溶液色譜圖見圖3～圖7。

圖3 膏霜類化妝品空白基質(zhì)、加標(biāo)樣品色譜圖

圖4 乳液類化妝品空白基質(zhì)、加標(biāo)樣品色譜圖

圖5 面膜類化妝品空白基質(zhì)、加標(biāo)樣品色譜圖

圖6 液體水基類化妝品空白基質(zhì)、加標(biāo)樣品色譜圖

圖7 凝膠類化妝品空白基質(zhì)、加標(biāo)樣品色譜圖

表3 空白樣品加標(biāo)回收試驗結(jié)果

2.8 穩(wěn)定性試驗

分別精密吸取1、10、50 mg/L 3個濃度水平的膏霜、乳液、面膜、液體、凝膠水基5種空白樣品的加標(biāo)溶液各10 μL，分別于0、3、6、12、18、24、48、72 h 各進(jìn)樣一次，在1.4儀器工作條件下，記錄不同時間的色譜峰面積并計算測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，試驗結(jié)果見表5。

表5 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

由表5可知，5種空白樣品的加標(biāo)溶液在72 h內(nèi)測得的艾地苯醌色譜峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.56%～2.32%，表明測試樣品制備后在72 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

3 結(jié)語

建立了高效液相色譜測定膏霜、乳液、面膜、凝膠、液體水基5 種基質(zhì)類型的化妝品中艾地苯醌含量的分析方法。該方法具有操作簡便、分析時間短、靈敏度高、精密度好、穩(wěn)定性強、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點，適用于功效化妝品中艾地苯醌的定性及定量檢測，為打擊化妝品監(jiān)管中概念性添加及虛假宣稱的違法行為提供一定的技術(shù)支持。