劉彤彤，金紹明，曹進(jìn)，寧霄

［中國(guó)食品藥品檢定研究院，國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（食品質(zhì)量與安全），北京 100050］

氫醌（對(duì)苯二酚）長(zhǎng)期以來(lái)被用于美白祛斑類化妝品中，通過(guò)抑制酪氨酸酶活性來(lái)阻止黑色素生成，是一種有效的美白成分。研究和臨床數(shù)據(jù)證實(shí)，氫醌對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有潛在的誘變性[1]，長(zhǎng)期過(guò)量使用會(huì)對(duì)皮膚產(chǎn)生刺激性、致敏性甚至致癌[2-3]。

目前氫醌在國(guó)內(nèi)外被歸為化妝品禁限用成分，歐盟化妝品法規(guī)（EC）No 1223/2009中，氫醌為禁用組分，僅可在染發(fā)劑和人造甲中使用，且用量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))不超過(guò)0.3%和0.02%[4]；美國(guó)化妝品原料評(píng)價(jià)委員會(huì)（CIR）2015 年對(duì)氫醌規(guī)定：用于染發(fā)劑和人造甲的氫醌使用量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))不超過(guò)1%，不得使用于駐留類化妝品中[5]；我國(guó)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015版）規(guī)定：化妝品中禁止使用氫醌[6]。

美白祛斑類化妝品市場(chǎng)規(guī)模大且存在產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊、虛假宣傳等問(wèn)題[7-8]，因而對(duì)禁用成分氫醌的監(jiān)測(cè)十分必要。由于化妝品基質(zhì)復(fù)雜多樣[9]，為避免基質(zhì)效應(yīng)影響檢測(cè)準(zhǔn)確度[10]，滿足檢測(cè)過(guò)程中質(zhì)量控制需求，有必要研制相關(guān)基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，但目前市場(chǎng)上未見乳液中氫醌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)出售，為填補(bǔ)市場(chǎng)空白，筆者研制出乳液基體中氫醌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，可為化妝品中特別是乳液類美白產(chǎn)品中氫醌的檢測(cè)提供質(zhì)量控制，對(duì)化妝品基體標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制流程和方法有一定借鑒作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：UltimateTM3000型，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司。

電子分析天平：（1）XP 205 型，感量為 0.01 mg；（2）AL 204 型，感量為 0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多有限公司。

超純水系統(tǒng)：Milli-Q 型，密理博（中國(guó)）有限公司。

氫醌標(biāo)準(zhǔn)品：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為99.7%，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。甲醇：色譜純，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司。乳液原料：化妝品乳液（不含氫醌的陰性乳液樣品）。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

選用市售化妝品乳液作為加工原料（原料為不含氫醌的陰性乳液樣品）滿足標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備的適用性、代表性原則，及均勻性、穩(wěn)定性的要求[11]。添加一定量的氫醌標(biāo)準(zhǔn)品，充分混合均勻后，再進(jìn)行分裝（5 g/瓶），于棕色塑料瓶密閉儲(chǔ)存，共計(jì)500瓶。

1.2.2 樣品預(yù)處理

稱取樣品1 g（精確至 0.001 g）于具塞比色管中，用甲醇定容至10 mL，常溫超聲提取15 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，濾液作為樣品溶液。

1.2.3 氫醌標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

氫醌標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：1 000 mg/L，稱取氫醌標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g（精確至0.000 1 g）于燒杯中，用少量甲醇溶解后，轉(zhuǎn)移至 100 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至標(biāo)線。于4 ℃暗處保存，在一個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定。

氫醌系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：取適量氫醌標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為1.0、5.0、10.0、50、100 mg/L。

1.2.4 色譜條件

色譜柱：C18柱（150 mm× 3.9 mm，5 μm，賽默飛世爾科技公司）；流動(dòng)相：甲醇-水（體積比為60∶40），流量為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣體積：5 μL。

1.2.5 樣品測(cè)定

在1.2.4色譜條件下，取氫醌系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。取樣品溶液進(jìn)樣，記錄色譜圖，測(cè)得色譜峰面積，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法得到樣品溶液中氫醌的質(zhì)量。

1.3 樣品均勻性和穩(wěn)定性考察

分別參照 CNAS-GL003：2018 《能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指南》[12]、CNAS-GL017：2018《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法》[13]、JJF 1343—2022《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值及均勻性、穩(wěn)定性評(píng)估》[14]中關(guān)于均勻性、穩(wěn)定性檢驗(yàn)的要求進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.1 均勻性檢驗(yàn)

參照J(rèn)JF 1343—2022中均勻性檢驗(yàn)對(duì)抽取單元數(shù)量和重復(fù)測(cè)定次數(shù)的要求，隨機(jī)抽取15 個(gè)樣品，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定2 次，進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)。采用單因素方差分析(ANOVA)的F檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.2 短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)

模擬在40 ℃，濕度80%的運(yùn)輸條件下，以均勻性檢驗(yàn)測(cè)定結(jié)果為初始值（0 天測(cè)定值），分別在1、3、7 天取樣，每次取3個(gè)樣品，每個(gè)樣品測(cè)定2次，采用t檢驗(yàn)法評(píng)價(jià)樣品的短期穩(wěn)定性。

1.3.3 長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢驗(yàn)

在2～8 ℃、避光干燥的保存條件下，按照先密后疏[14]原則，以均勻性檢驗(yàn)測(cè)定結(jié)果為初始值（0 月測(cè)定值），分別在1、2、4、6月取樣，每次取3個(gè)樣品，每個(gè)樣品測(cè)定2次，采用t檢驗(yàn)法評(píng)價(jià)樣品的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。

1.4 定值方法及不確定度評(píng)定

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值參照J(rèn)JF 1343—2022 和ISO Guide35∶2006[15]，采用一種方法多家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值的方式，選擇2家具備檢驗(yàn)資質(zhì)的機(jī)構(gòu)，連同本實(shí)驗(yàn)室，共計(jì)3 家，使用相同方法，對(duì)乳液中氫醌含量進(jìn)行測(cè)定。向另外兩家實(shí)驗(yàn)室分別發(fā)放5 個(gè)樣品，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定2 次，對(duì)回收數(shù)據(jù)使用格拉布斯（Grubbs）檢驗(yàn)剔除組內(nèi)離群值，使用狄克遜（Dixon）法檢測(cè)各組數(shù)據(jù)的中位值是否有顯著性差異。最終使用各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果中位值的中位值作為樣品定值結(jié)果。

參照GB/T 15000.3—2008[16]，對(duì)均勻性、穩(wěn)定性和指定值帶來(lái)的不確定度進(jìn)行定量，并將各來(lái)源不確定度進(jìn)行合成及擴(kuò)展，得到乳液中氫醌含量的擴(kuò)展不確定度。

2 結(jié)果與討論

2.1 均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

按照1.3.1方法，從500個(gè)樣品中隨機(jī)抽取15個(gè)進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)，乳液中氫醌質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果列于表 1，采用單因素方差分析測(cè)定結(jié)果，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示。在α=0.05時(shí)，查表得F0.05(14,15)=2.42，由表2可知，乳液中氫醌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的F計(jì)算值為1.57，F(xiàn)＜F0.05(14,15)，表明組內(nèi)和組間無(wú)明顯差異，乳液中氫醌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性良好。

2.2 穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 短期穩(wěn)定性

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)短期穩(wěn)定性的考察主要是模擬在運(yùn)輸過(guò)程中高溫、高濕條件對(duì)乳液中氫醌含量的影響[17]，因此將分裝好的樣品置于溫度40 ℃、濕度80%的恒溫恒濕箱中，考察其在7天內(nèi)的穩(wěn)定性，按照1.3.2方法考察短期穩(wěn)定性，乳液基體中氫醌質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果見表3。

由表3 可知，均勻性檢測(cè)結(jié)果平均值作為長(zhǎng)期穩(wěn)定性0 天的測(cè)定值，與1、3、7 天的測(cè)定結(jié)果以時(shí)間-測(cè)定值做線性擬合，置信水平為95%時(shí)，斜率P=0.348 9＞0.05，表明在溫度40 ℃、濕度80%條件下，乳液中氫醌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在7天內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.2 長(zhǎng)期穩(wěn)定性

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的長(zhǎng)期穩(wěn)定性主要考察指定儲(chǔ)存條件下，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保持特性值在一定限度內(nèi)的特性[18]。按照1.3.3 方法，考察乳液中氫醌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在2～8 ℃、避光干燥的保存條件下，6個(gè)月內(nèi)的穩(wěn)定性，結(jié)果見表4。

由表4 可知，均勻性檢測(cè)結(jié)果平均值作為長(zhǎng)期穩(wěn)定性0月的測(cè)定值，與1、2、4、6月的測(cè)定結(jié)果以時(shí)間-測(cè)定值做線性擬合，置信水平為95%時(shí)，斜率的P=0.150 2＞0.05，說(shuō)明在推薦儲(chǔ)存條件下，乳液中氫醌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)長(zhǎng)期穩(wěn)定性良好。

2.3 協(xié)作定值結(jié)果及離群值檢驗(yàn)

本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采用多家協(xié)同定值的方式，由兩家業(yè)內(nèi)具備資質(zhì)的檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)（機(jī)構(gòu)A和B）和樣品制備方（機(jī)構(gòu)C）協(xié)作定值，分別向其它兩家機(jī)構(gòu)提供5個(gè)樣品，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定2 次。機(jī)構(gòu)A 和B 對(duì)乳液中氫醌的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果見表5，制備方以均勻性檢驗(yàn)結(jié)果參與定值（測(cè)定結(jié)果見表1）。

表1 均勻性檢驗(yàn)氫醌質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果 μg/g

表2 均勻性檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表3 短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)氫醌質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果 μg/g

表4 長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢驗(yàn)氫醌質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果 μg/g

對(duì)3 家實(shí)驗(yàn)室的測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，利用格拉布斯（Grubbs）檢驗(yàn)剔除組內(nèi)可疑值，未發(fā)現(xiàn)異常值；采用狄克遜（Dixon）法檢測(cè)各組數(shù)據(jù)的中位值是否有顯著性差異，結(jié)果全部通過(guò)狄克遜檢驗(yàn)，表明各組組間中位值無(wú)顯著性差異。通過(guò)上述分析計(jì)算，可保留所有數(shù)據(jù)，樣品定值結(jié)果為各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果中位值的中位值見表6。

表6 氫醌質(zhì)量分?jǐn)?shù)定值結(jié)果 μg/g

2.4 定值不確定度的計(jì)算

對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來(lái)說(shuō)，其定值結(jié)果的不確定度由3部分組成，分別為：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性引起的不確定度，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性引起的不確定度以及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值過(guò)程帶來(lái)的不確定度。在置信水平為95%，k=2 時(shí)，得到乳液中氫醌基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)最終結(jié)果，不確定度表達(dá)采取只進(jìn)不舍的原則進(jìn)行修約，不確定度計(jì)算結(jié)果見表7。

表7 不確定度的計(jì)算結(jié)果

2.5 定值結(jié)果

經(jīng)過(guò)均勻性檢驗(yàn)、短期和長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢驗(yàn)以及3 家實(shí)驗(yàn)室協(xié)作定值，最終確定乳液中氫醌含量指定值為(108±9.86) μg/g（k=2）。

3 結(jié)語(yǔ)

研制了乳液中氫醌的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性、短期和長(zhǎng)期穩(wěn)定性良好，通過(guò)3家實(shí)驗(yàn)室定值，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行不確定度評(píng)估，最終得到標(biāo)準(zhǔn)值為108 μg/g，擴(kuò)展不確定度為9.86 μg/g（k=2）。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)符合基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的要求，可為乳液中氫醌檢測(cè)結(jié)果的質(zhì)量控制提供保障。