劉彤彤,金紹明,曹進(jìn),寧霄
[中國食品藥品檢定研究院,國家市場監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(食品質(zhì)量與安全),北京 100050]
氫醌(對苯二酚)長期以來被用于美白祛斑類化妝品中,通過抑制酪氨酸酶活性來阻止黑色素生成,是一種有效的美白成分。研究和臨床數(shù)據(jù)證實(shí),氫醌對哺乳動物細(xì)胞具有潛在的誘變性[1],長期過量使用會對皮膚產(chǎn)生刺激性、致敏性甚至致癌[2-3]。
目前氫醌在國內(nèi)外被歸為化妝品禁限用成分,歐盟化妝品法規(guī)(EC)No 1223/2009中,氫醌為禁用組分,僅可在染發(fā)劑和人造甲中使用,且用量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))不超過0.3%和0.02%[4];美國化妝品原料評價委員會(CIR)2015 年對氫醌規(guī)定:用于染發(fā)劑和人造甲的氫醌使用量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))不超過1%,不得使用于駐留類化妝品中[5];我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015版)規(guī)定:化妝品中禁止使用氫醌[6]。
美白祛斑類化妝品市場規(guī)模大且存在產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊、虛假宣傳等問題[7-8],因而對禁用成分氫醌的監(jiān)測十分必要。由于化妝品基質(zhì)復(fù)雜多樣[9],為避免基質(zhì)效應(yīng)影響檢測準(zhǔn)確度[10],滿足檢測過程中質(zhì)量控制需求,有必要研制相關(guān)基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),但目前市場上未見乳液中氫醌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)出售,為填補(bǔ)市場空白,筆者研制出乳液基體中氫醌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),可為化妝品中特別是乳液類美白產(chǎn)品中氫醌的檢測提供質(zhì)量控制,對化妝品基體標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制流程和方法有一定借鑒作用。
高效液相色譜儀:UltimateTM3000型,美國賽默飛世爾科技有限公司。
電子分析天平:(1)XP 205 型,感量為 0.01 mg;(2)AL 204 型,感量為 0.1 mg,瑞士梅特勒-托利多有限公司。
超純水系統(tǒng):Milli-Q 型,密理博(中國)有限公司。
氫醌標(biāo)準(zhǔn)品:純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為99.7%,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。甲醇:色譜純,美國賽默飛世爾科技有限公司。乳液原料:化妝品乳液(不含氫醌的陰性乳液樣品)。
實(shí)驗(yàn)用水為超純水。
1.2.1 樣品制備
選用市售化妝品乳液作為加工原料(原料為不含氫醌的陰性乳液樣品)滿足標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備的適用性、代表性原則,及均勻性、穩(wěn)定性的要求[11]。添加一定量的氫醌標(biāo)準(zhǔn)品,充分混合均勻后,再進(jìn)行分裝(5 g/瓶),于棕色塑料瓶密閉儲存,共計(jì)500瓶。
1.2.2 樣品預(yù)處理
稱取樣品1 g(精確至 0.001 g)于具塞比色管中,用甲醇定容至10 mL,常溫超聲提取15 min,取上清液,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾,濾液作為樣品溶液。
1.2.3 氫醌標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
氫醌標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:1 000 mg/L,稱取氫醌標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g(精確至0.000 1 g)于燒杯中,用少量甲醇溶解后,轉(zhuǎn)移至 100 mL 容量瓶中,用甲醇稀釋至標(biāo)線。于4 ℃暗處保存,在一個月內(nèi)穩(wěn)定。
氫醌系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:取適量氫醌標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為1.0、5.0、10.0、50、100 mg/L。
1.2.4 色譜條件
色譜柱:C18柱(150 mm× 3.9 mm,5 μm,賽默飛世爾科技公司);流動相:甲醇-水(體積比為60∶40),流量為1.0 mL/min;檢測波長:280 nm;柱溫:室溫;進(jìn)樣體積:5 μL。
1.2.5 樣品測定
在1.2.4色譜條件下,取氫醌系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別進(jìn)樣,以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。取樣品溶液進(jìn)樣,記錄色譜圖,測得色譜峰面積,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法得到樣品溶液中氫醌的質(zhì)量。
分別參照 CNAS-GL003:2018 《能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價指南》[12]、CNAS-GL017:2018《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法》[13]、JJF 1343—2022《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值及均勻性、穩(wěn)定性評估》[14]中關(guān)于均勻性、穩(wěn)定性檢驗(yàn)的要求進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
1.3.1 均勻性檢驗(yàn)
參照J(rèn)JF 1343—2022中均勻性檢驗(yàn)對抽取單元數(shù)量和重復(fù)測定次數(shù)的要求,隨機(jī)抽取15 個樣品,每個樣品重復(fù)測定2 次,進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)。采用單因素方差分析(ANOVA)的F檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
1.3.2 短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)
模擬在40 ℃,濕度80%的運(yùn)輸條件下,以均勻性檢驗(yàn)測定結(jié)果為初始值(0 天測定值),分別在1、3、7 天取樣,每次取3個樣品,每個樣品測定2次,采用t檢驗(yàn)法評價樣品的短期穩(wěn)定性。
1.3.3 長期穩(wěn)定性檢驗(yàn)
在2~8 ℃、避光干燥的保存條件下,按照先密后疏[14]原則,以均勻性檢驗(yàn)測定結(jié)果為初始值(0 月測定值),分別在1、2、4、6月取樣,每次取3個樣品,每個樣品測定2次,采用t檢驗(yàn)法評價樣品的長期穩(wěn)定性。
標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值參照J(rèn)JF 1343—2022 和ISO Guide35∶2006[15],采用一種方法多家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值的方式,選擇2家具備檢驗(yàn)資質(zhì)的機(jī)構(gòu),連同本實(shí)驗(yàn)室,共計(jì)3 家,使用相同方法,對乳液中氫醌含量進(jìn)行測定。向另外兩家實(shí)驗(yàn)室分別發(fā)放5 個樣品,每個樣品重復(fù)測定2 次,對回收數(shù)據(jù)使用格拉布斯(Grubbs)檢驗(yàn)剔除組內(nèi)離群值,使用狄克遜(Dixon)法檢測各組數(shù)據(jù)的中位值是否有顯著性差異。最終使用各實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果中位值的中位值作為樣品定值結(jié)果。
參照GB/T 15000.3—2008[16],對均勻性、穩(wěn)定性和指定值帶來的不確定度進(jìn)行定量,并將各來源不確定度進(jìn)行合成及擴(kuò)展,得到乳液中氫醌含量的擴(kuò)展不確定度。
按照1.3.1方法,從500個樣品中隨機(jī)抽取15個進(jìn)行均勻性檢驗(yàn),乳液中氫醌質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果列于表 1,采用單因素方差分析測定結(jié)果,統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示。在α=0.05時,查表得F0.05(14,15)=2.42,由表2可知,乳液中氫醌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的F計(jì)算值為1.57,F(xiàn)<F0.05(14,15),表明組內(nèi)和組間無明顯差異,乳液中氫醌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性良好。
2.2.1 短期穩(wěn)定性
標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)短期穩(wěn)定性的考察主要是模擬在運(yùn)輸過程中高溫、高濕條件對乳液中氫醌含量的影響[17],因此將分裝好的樣品置于溫度40 ℃、濕度80%的恒溫恒濕箱中,考察其在7天內(nèi)的穩(wěn)定性,按照1.3.2方法考察短期穩(wěn)定性,乳液基體中氫醌質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果見表3。
由表3 可知,均勻性檢測結(jié)果平均值作為長期穩(wěn)定性0 天的測定值,與1、3、7 天的測定結(jié)果以時間-測定值做線性擬合,置信水平為95%時,斜率P=0.348 9>0.05,表明在溫度40 ℃、濕度80%條件下,乳液中氫醌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在7天內(nèi)穩(wěn)定。
2.2.2 長期穩(wěn)定性
標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的長期穩(wěn)定性主要考察指定儲存條件下,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保持特性值在一定限度內(nèi)的特性[18]。按照1.3.3 方法,考察乳液中氫醌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在2~8 ℃、避光干燥的保存條件下,6個月內(nèi)的穩(wěn)定性,結(jié)果見表4。
由表4 可知,均勻性檢測結(jié)果平均值作為長期穩(wěn)定性0月的測定值,與1、2、4、6月的測定結(jié)果以時間-測定值做線性擬合,置信水平為95%時,斜率的P=0.150 2>0.05,說明在推薦儲存條件下,乳液中氫醌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)長期穩(wěn)定性良好。
本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采用多家協(xié)同定值的方式,由兩家業(yè)內(nèi)具備資質(zhì)的檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)(機(jī)構(gòu)A和B)和樣品制備方(機(jī)構(gòu)C)協(xié)作定值,分別向其它兩家機(jī)構(gòu)提供5個樣品,每個樣品重復(fù)測定2 次。機(jī)構(gòu)A 和B 對乳液中氫醌的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果見表5,制備方以均勻性檢驗(yàn)結(jié)果參與定值(測定結(jié)果見表1)。
表1 均勻性檢驗(yàn)氫醌質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果 μg/g
表2 均勻性檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果
表3 短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)氫醌質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果 μg/g
表4 長期穩(wěn)定性檢驗(yàn)氫醌質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果 μg/g
對3 家實(shí)驗(yàn)室的測定數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選,利用格拉布斯(Grubbs)檢驗(yàn)剔除組內(nèi)可疑值,未發(fā)現(xiàn)異常值;采用狄克遜(Dixon)法檢測各組數(shù)據(jù)的中位值是否有顯著性差異,結(jié)果全部通過狄克遜檢驗(yàn),表明各組組間中位值無顯著性差異。通過上述分析計(jì)算,可保留所有數(shù)據(jù),樣品定值結(jié)果為各實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果中位值的中位值見表6。
表6 氫醌質(zhì)量分?jǐn)?shù)定值結(jié)果 μg/g
對于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來說,其定值結(jié)果的不確定度由3部分組成,分別為:標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性引起的不確定度,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性引起的不確定度以及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值過程帶來的不確定度。在置信水平為95%,k=2 時,得到乳液中氫醌基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)最終結(jié)果,不確定度表達(dá)采取只進(jìn)不舍的原則進(jìn)行修約,不確定度計(jì)算結(jié)果見表7。
表7 不確定度的計(jì)算結(jié)果
經(jīng)過均勻性檢驗(yàn)、短期和長期穩(wěn)定性檢驗(yàn)以及3 家實(shí)驗(yàn)室協(xié)作定值,最終確定乳液中氫醌含量指定值為(108±9.86) μg/g(k=2)。
研制了乳液中氫醌的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性、短期和長期穩(wěn)定性良好,通過3家實(shí)驗(yàn)室定值,并對結(jié)果進(jìn)行不確定度評估,最終得到標(biāo)準(zhǔn)值為108 μg/g,擴(kuò)展不確定度為9.86 μg/g(k=2)。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)符合基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的要求,可為乳液中氫醌檢測結(jié)果的質(zhì)量控制提供保障。