胡玉蓮 安佰麗 劉超 高慧婕

1日照市人民醫(yī)院，日照 276826；2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，日照 276826

炎癥是機(jī)體的一種防御反應(yīng)，主要表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛、功能障礙等，一旦得不到有效控制，將會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的病理反應(yīng)，例如膿毒癥、自身免疫病等［1］。膿毒癥可引起嚴(yán)重的炎癥性組織損傷，主要是由于白細(xì)胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-1β等促炎性因子過(guò)量產(chǎn)生所致［2-3］。在過(guò)去十幾年中，由膿毒癥導(dǎo)致的病死率居高不下，消耗了巨大的醫(yī)療資源［4］。肝臟是調(diào)控免疫和炎性反應(yīng)的主要器官，膿毒癥早期即可由于肝細(xì)胞缺血、缺氧導(dǎo)致肝損傷，發(fā)生嚴(yán)重炎性反應(yīng)和過(guò)度氧化應(yīng)激［5］。肝功能損傷會(huì)嚴(yán)重影響膿毒癥的預(yù)后，可作為引發(fā)多器官功能衰竭和死亡的重要預(yù)測(cè)因子［6］。因此，尋找有效靶點(diǎn)，防治膿毒癥所致肝損傷具有重要臨床意義。

?；撬幔╰aurine）化學(xué)名稱(chēng)是2-氨基乙磺酸，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為H2NCH2CH2SO3H。?；撬峒仁且环N具有廣泛生理、藥理作用的中藥有效成分，是名貴中藥“牛黃”的有效成分之一，又是動(dòng)物體內(nèi)必需營(yíng)養(yǎng)元素，參與動(dòng)物機(jī)體的細(xì)胞體積調(diào)節(jié)、滲透壓調(diào)節(jié)等重要生理過(guò)程，并具有抗氧化和抗炎活性，對(duì)動(dòng)物機(jī)體的穩(wěn)態(tài)具有重要意義［7-9］。因此，?；撬峥寡住⒖寡趸约熬徑饧膊〉墓πС蔀榻┠甑难芯繜狳c(diǎn)。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性菌壁的主要成分，可刺激宿主在膿毒性過(guò)程中釋放多種炎癥介質(zhì)，可用來(lái)建立膿毒癥經(jīng)典模型［10］。本次研究采用LPS構(gòu)建膿毒癥小鼠模型，探討牛磺酸對(duì)由LPS所致膿毒癥肝損傷小鼠的抗炎、抗氧化活性及其分子機(jī)制，為牛磺酸治療膿毒癥肝損傷應(yīng)用于臨床提供有效實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)試劑

?；撬豳?gòu)自上海葉源生物科技有限公司（S20155-25g），4%的多聚甲醛購(gòu)自Biodharp Life Science（BL539A），Mouse IL-10 ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）Kit、Mouse IL-1β ELISA Kit、Mouse IL-6 ELISA Kit購(gòu)自武漢基因美生物科技有限公司，RIPA裂解液、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、SDS-PAGE電泳液（Tris-Gly，Powder）均購(gòu)自Beyotime Biotechnology，HiScript ⅢRT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（R323-01）、SYBR Green Master Mix（Q111-02）購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司，Tubulin抗體（AT819）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）（H+L）（A0216）購(gòu)自Beyotime Biotechnology，核因子（NF）-κB抗體（66535-1）、蛋白激酶B（AKT）抗體（60203-2）均購(gòu)自Proteintech，核因子κB抑制蛋白（IκB）-α抗體（AI096）購(gòu)自Beyotime Biotechnology。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

50只ICR雄性小鼠，4～5周齡，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，許可證號(hào)：SCXK（魯）2022 0006。小鼠自由攝食飲水，室溫（23.00±1.00）℃，晝夜循環(huán)12 h。本次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)過(guò)濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

3.實(shí)驗(yàn)方法

3.1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 本研究于2022年2月至7月進(jìn)行。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組（Control組）、LPS造模組（LPS組）、?；撬岬蛣┝拷M（L+L組）、?；撬嶂袆┝拷M（L+M組）、牛磺酸高劑量組（L+H組）。?；撬岣骨蛔⑸浣o藥，L+L組（100 mg/kg）0.2 ml/d，L+M組（200 mg/kg）0.2 ml/d，L+H組（400 mg/kg）0.2 ml/d，Control組與LPS組每天注射等體積生理鹽水。實(shí)驗(yàn)第7天，Control組注射生理鹽水，LPS組與?；撬嵊盟幗M均注射LPS（10 mg/kg）。6 h后眼球取血，室溫靜置30 min后，以3 500 r/min離心15 min（離心半徑85 mm），取上清液-80 ℃保存；摘取肝臟、腎臟和肺臟。

3.2.臟器指數(shù)計(jì)算 精密天平稱(chēng)量肝臟、腎臟和肺臟，計(jì)算臟器指數(shù)：肝臟（腎臟、肺臟）指數(shù)=肝臟（腎臟、肺臟）質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量×100%。

3.3.小鼠肝臟組織蘇木精-伊紅（HE）染色 小鼠肝臟用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，并切成4 μm矢狀切片。脫蠟處理（20 min/次，共3次）。將切片依次置于100%、100%、95%、80%、70%的乙醇中梯度脫水。HE染色。乙醇中梯度脫水后置于新鮮二甲苯溶液中浸泡（5 min/次，共2次）。中性樹(shù)脂封片，鏡下觀(guān)察。

3.4.小鼠全血血常規(guī)指標(biāo)檢測(cè) 取小鼠全血，按照動(dòng)物血液細(xì)胞分析儀的要求上機(jī)檢測(cè)。

3.5.測(cè)定小鼠肝組織丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活力 使用生理鹽水沖洗0.5 g肝臟組織，制備10%組織勻漿。根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行取樣操作。采用多功能酶標(biāo)儀分別在412 nm、550 nm和532 nm處檢測(cè)SOD和MDA的吸光度值，并根據(jù)公式計(jì)算活性和含量。

3.6.小鼠血清中IL-1β、IL-6和IL-10含量的測(cè)定 按照ELISA試劑盒使用說(shuō)明書(shū)操作，使用酶標(biāo)儀在給定的波長(zhǎng)下測(cè)定加樣后的酶標(biāo)板各孔的吸光度。按照給定公式計(jì)算IL-1β、IL-6和IL-10的濃度。

3.7.Western blot測(cè)定小鼠肝臟NF-κB、IκB和AKT的表達(dá) 使用RIPA裂解液裂解組織，使用前加入蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑混勻。BCA檢測(cè)蛋白濃度。SDS-PAGE電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜。封閉液震蕩封閉2 h。封閉完成后去除封閉液加入一抗（NF-κB 1∶1 000、AKT 1∶2 000和IκB 1∶1 000），室溫下?lián)u洗孵育2 h后過(guò)夜。次日Western洗滌液洗滌3次，每次搖洗10 min。加入二抗（山羊抗小鼠IgG 1∶2 000）孵育后洗滌。ECL顯色，將PVDF膜放入多功能成像儀中檢測(cè)。

3.8.免疫組化檢測(cè)小鼠肝臟組織中NF-κB的表達(dá) 切片脫蠟后浸入二甲苯中3次，每次10 min，而后浸入到無(wú)水乙醇中3次，每次5 min；滴加3%過(guò)氧化氫（H2O2），室溫處理8 min，蒸餾水清洗3次。熱抗原修復(fù)后，滴加封閉液，室溫封閉20 min，滴加NF-κB一抗4 ℃過(guò)夜。PBS清洗3次，滴加稀釋好的二抗，常溫孵育30 min。PBS清洗，后滴加鏈霉親和素工作液，室溫孵育30 min。DAB顯色。蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析進(jìn)行組間比較。所有數(shù)據(jù)使用Prism 9.3.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.牛磺酸對(duì)LPS膿毒癥小鼠臟器指數(shù)的影響（圖1）

圖1 ?；撬釋?duì)膿毒癥小鼠臟器指數(shù)的影響

與Control組相比，LPS組小鼠肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)以及肺臟指數(shù)均顯著升高（均P＜0.001），LPS膿毒癥模型制備成功。與LPS組相比，?；撬嵊盟幗M（L+L組和L+H組）的肝臟指數(shù)降低（P＜0.05，P＜0.001），L+M組肝臟指數(shù)呈下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與LPS組相比，L+M組和L+H組的腎臟和肺臟指數(shù)降低（P＜0.05，P＜0.01），L+L組腎臟和肝臟指數(shù)呈下降趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。從臟器指數(shù)水平顯示出?；撬釋?duì)肝臟、腎臟和肺臟均具有一定的抗炎保護(hù)作用。

2.?；撬釋?duì)小鼠肝臟組織形態(tài)的影響（圖2）

圖2 ?；撬釋?duì)膿毒癥小鼠肝臟組織形態(tài)的影響（A.Control組；B.LPS組；C.L+L組；D.L+M組；E.L+H組）（HE染色 ×100）

HE染色結(jié)果顯示，LPS組小鼠肝組織產(chǎn)生明顯損傷，肝臟結(jié)構(gòu)混亂，肝索紊亂，肝細(xì)胞排列混亂，大小不一，出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，牛磺酸用藥組（L+L組、L+M組和L+H組）小鼠肝臟組織均呈現(xiàn)一定程度的恢復(fù)，肝組織排列較為清晰。

3.?；撬釋?duì)LPS膿毒癥小鼠血常規(guī)指標(biāo)影響（圖3）

圖3 ?；撬釋?duì)膿毒癥小鼠血常規(guī)的影響

與Control組相比，LPS組白細(xì)胞計(jì)數(shù)和粒細(xì)胞比率均顯著升高（均P＜0.001），淋巴細(xì)胞比率顯著降低（P＜0.001）。與LPS組相比，?；撬嵊盟幗M（L+L組、L+M組和L+H組）的白細(xì)胞計(jì)數(shù)和粒細(xì)胞比率顯著降低（P＜0.05，P＜0.001），淋巴細(xì)胞比率均顯著升高（均P＜0.001），顯示牛磺酸可有效改善LPS造成的淋巴細(xì)胞比率與粒細(xì)胞比率的異常，且呈現(xiàn)明顯的濃度依賴(lài)性，高濃度牛磺酸用藥L+H組效果最佳。

4.?；撬釋?duì)LPS膿毒癥小鼠SOD和MDA的影響（圖4）

圖4 牛磺酸對(duì)膿毒癥小鼠SOD（A）和MDA（B）的影響

與Control組相比，LPS組SOD活力顯著下降（P＜0.05）；與LPS組比，L+M組SOD活力升高（P＜0.01），L+L組、L+H組SOD活力有升高趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。與Control組相比，LPS組MDA含量顯著增高（P＜0.01）；與LPS組相比較，L+L組、L+M組MDA含量降低（均P＜0.05），L+H組MDA含量有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

5.?；撬釋?duì)LPS膿毒癥小鼠血清中IL-1β、IL-6和IL-10的表達(dá)影響（圖5）

圖5 ?；撬釋?duì)膿毒癥小鼠IL-1β（A）、IL-6（B）和IL-10（C）的影響

與Control組相比，LPS組IL-1β、IL-6含量顯著升高（P＜0.01，P＜0.001），IL-10含量下降（P＜0.05）。與LPS組比，L+M組和L+H組的IL-1β含量降低（均P＜0.01），L+L組IL-1β含量有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；?；撬嵊盟幗M（L+L組、L+M組和L+H組）IL-6含量降低（均P＜0.05）；L+H組IL-10含量升高（P＜0.05），L+L組、L+M組IL-10含量有上升趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

6.?；撬釋?duì)LPS膿毒癥小鼠肝臟組織中NF-κB、IκB和AKT表達(dá)的影響

與Control組相比較，LPS組的NF-κB、AKT表達(dá)增多，IκB的表達(dá)減少。與LPS組相比，L+H組NF-κB、AKT表達(dá)降低，IκB的表達(dá)升高，見(jiàn)圖6。與Control組相比，LPS組小鼠肝臟組織棕褐色明顯增多，NF-κB表達(dá)升高；L+H組小鼠肝臟棕褐色顆粒表達(dá)下降，NF-κB原位表達(dá)降低，見(jiàn)圖7。

圖6 牛磺酸對(duì)膿毒癥小鼠肝臟NF-κB、IκB和AKT表達(dá)的影響

圖7 ?；撬釋?duì)膿毒癥小鼠肝臟的NF-κB表達(dá)的影響（A.Control組；B.LPS組；C.L+H組）（免疫組化法 ×100）

討論

?；撬崴幱脙r(jià)值廣泛，具有鎮(zhèn)靜催眠、鎮(zhèn)咳祛痰平喘、抗炎、抗過(guò)敏、抗氧化、抗腫瘤、抗輻射等多項(xiàng)藥理活性［7-9］，中國(guó)藥典二部將其歸為鎮(zhèn)靜消炎類(lèi)藥物。牛磺酸主要通過(guò)抗氧化和抗炎活性發(fā)揮對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，對(duì)機(jī)體穩(wěn)態(tài)的維持具有重要意義［11-12］。針對(duì)炎癥性損傷，?；撬崮軌虼龠M(jìn)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的吞噬活力，提升機(jī)體天然免疫應(yīng)答［14］。?；撬岜徽J(rèn)為是一種極具前途的抗炎藥物，但目前有關(guān)?；撬岚l(fā)揮抗炎活性防治膿毒癥致肝損傷的作用機(jī)制尚未明確。

本實(shí)驗(yàn)采用10 mg/kg LPS制備膿毒癥模型，結(jié)果顯示模型組小鼠肝臟、腎臟和肺臟指數(shù)均顯著升高，同時(shí)血清中炎癥性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6的表達(dá)顯著增加，膿毒癥致肝損傷模型制備成功。而?；撬岣深A(yù)能夠有效降低小鼠肝臟、腎臟和肺臟指數(shù)，減少I(mǎi)L-1β、IL-6的產(chǎn)生，降低機(jī)體炎性反應(yīng)，對(duì)膿毒癥產(chǎn)生了良好緩解作用。氧化應(yīng)激與炎癥息息相關(guān)，有研究證明，外源性抗氧化劑可以對(duì)炎癥起到一定治療作用［15］。SOD是一種含有金屬的參與氧化代謝的酶，是清除機(jī)體內(nèi)有害自由基的重要物質(zhì)［16］。MDA是膜脂過(guò)氧化的重要產(chǎn)物之一，可改變膜的通透性，進(jìn)而產(chǎn)生一系列生理生化反應(yīng)［17］。本次研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠肝臟組織SOD活力下降而MDA含量上升，顯示膿毒癥小鼠肝臟抗氧化活性降低。而?；撬岣深A(yù)可提升膿毒癥小鼠肝臟SOD活力，降低MDA含量，表明?；撬峥捎行岣吒螕p傷小鼠的抗氧化活性。

外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)和中性粒細(xì)胞比例升高，淋巴細(xì)胞比率相對(duì)偏低，多見(jiàn)于各種細(xì)菌感染，特別是各種化膿性球菌，如金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌感染。本次實(shí)驗(yàn)顯示膿毒癥模型小鼠外周血淋巴細(xì)胞比率顯著下降，白細(xì)胞計(jì)數(shù)和粒細(xì)胞比率明顯上升，而?；撬岣深A(yù)后，這一現(xiàn)象得到了明顯的糾正，說(shuō)明?；撬峥擅黠@提升機(jī)體產(chǎn)生淋巴細(xì)胞的能力，降低炎癥性粒細(xì)胞的產(chǎn)生，對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生良好調(diào)節(jié)作用。IL-10是一類(lèi)由活化的單核細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等分泌的高活性多功能多肽分子，又稱(chēng)細(xì)胞因子合成抑制因子［18］。IL-10參與Th1向Th2的轉(zhuǎn)化，同時(shí)受到IL-6調(diào)節(jié)，維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)，對(duì)炎性反應(yīng)起到負(fù)向調(diào)控作用。此次研究顯示，?；撬岣深A(yù)可顯著提高IL-10的表達(dá)，降低機(jī)體炎性反應(yīng)。

AKT屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶，是重要的促生存激酶，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)與存活［19］。AKT的磷酸化可以激活下游的NF-κB，從而啟動(dòng)IL-6、TNF-α等炎癥性細(xì)胞因子的產(chǎn)生［20-21］。NF-κB正常形態(tài)下以非活性狀態(tài)與IκB結(jié)合，當(dāng)細(xì)胞受到LPS或促炎因子的刺激的時(shí)候，IκB降解并釋放NF-κB，NF-κB便可以由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核中，調(diào)節(jié)多種促炎細(xì)胞因子表達(dá)［22］。IL-6是NF-κB的靶標(biāo)基因，有研究發(fā)現(xiàn)，LPS在體內(nèi)可以通過(guò)髓分化因子88途徑活化NF-κB導(dǎo)致IL-6等炎癥因子釋放，IL-6含量升高，機(jī)體發(fā)生炎性反應(yīng)［23］。同樣作為促炎性細(xì)胞因子，IL-1β可以通過(guò)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)導(dǎo)致IκB降解，釋放的NF-κB轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄［24-25］。本次研究發(fā)現(xiàn)，?；撬岣深A(yù)后LPS炎癥小鼠肝臟AKT、NF-κB的蛋白表達(dá)均顯著降低，同時(shí)IκB表達(dá)上升，同時(shí)檢測(cè)血清中下游炎癥性細(xì)胞因子IL-6和IL-1β的表達(dá)下降，提示?；撬嵊锌赡苁峭ㄟ^(guò)抑制AKT/NF-κB通路，促使更多的IκB與NF-κB結(jié)合從而抑制了下游炎癥因子的釋放，緩解膿毒癥小鼠肝臟的過(guò)度炎癥狀態(tài)。

綜上所述，?；撬嵊行p輕LPS所致膿毒癥肝損傷小鼠的炎性反應(yīng)，提升肝臟抗氧化活性。?；撬峥赡芡ㄟ^(guò)抑制炎癥AKT/NF-κB信號(hào)通路，降低下游炎癥因子IL-6和IL-1β表達(dá)，從而達(dá)到抑制肝臟過(guò)度炎癥的良好效果。本研究為?；撬嶙鳛榭寡谆钚运幬锏拈_(kāi)發(fā)和利用提供可靠實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明胡玉蓮：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，采集數(shù)據(jù)，分析/解釋數(shù)據(jù)，起草文章，對(duì)文章的知識(shí)性?xún)?nèi)容作批評(píng)性審閱；安佰麗：采集數(shù)據(jù)，支持性貢獻(xiàn)；劉超：統(tǒng)計(jì)分析，行政、技術(shù)或材料支持，支持性貢獻(xiàn)；高慧婕：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，實(shí)施研究，分析/解釋數(shù)據(jù)，對(duì)文章的知識(shí)性?xún)?nèi)容作批評(píng)性審閱