郭彩鳳 譚燕 張岳峰 周華榮 陳國華 方雅秀 藍(lán)曉鳳

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院神經(jīng)科，廣州 510370

癲癇（epilepsy）是大腦神經(jīng)元異常放電引起的神經(jīng)系統(tǒng)常見疾?。?］。癲癇的長期且頻繁發(fā)作會對患者的神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重的損傷，對患者的身心健康及社會功能造成嚴(yán)重的影響［2］。

國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，癲癇動物模型存在血腦屏障損傷［3-4］。而血腦屏障損傷程度與慢性癲癇大鼠癲癇發(fā)作頻次存在明顯相關(guān)［5］。有研究指出：減輕血腦屏障損傷程度、修復(fù)受損血腦屏障、改善血腦屏障功能有助于減少癲癇發(fā)作［6］。

血腦屏障的通透性及其功能的完整性與其血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接（tight junction）有著密不可分的關(guān)系［7］。緊密連接主要由閉鎖蛋白、緊密連接蛋白、claudins、跨膜蛋白和連接黏附分子組成［8］。其中，claudin-5是形成緊密連接初級結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)蛋白，它的分布和表達(dá)的變化可直接導(dǎo)致血腦屏障損傷［9］?；|(zhì)金屬蛋白酶家族（MMPs）中的MMP-9已被證實(shí)可通過降解claudin-5進(jìn)而導(dǎo)致血腦屏障損傷的發(fā)生［10］。除此之外，MMP-9也可通過降解緊密連接蛋白ZO-1進(jìn)而破壞血腦屏障的結(jié)構(gòu)［11］。

姜黃素是一種從姜黃屬類植物根莖中提取出來的多酚化合物［12］。其具有抗炎、抗氧化、保護(hù)或改善血管內(nèi)皮功能等重要作用［13］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可改變血腦屏障的通透性，并對血腦屏障起到保護(hù)作用［14］。然而，姜黃素是否會通過改變影響血腦屏障緊密連接的蛋白酶體系進(jìn)而改變血腦屏障結(jié)構(gòu)及功能仍是不明確的。

本研究通過對慢性顳葉內(nèi)側(cè)癲癇大鼠給予姜黃素干預(yù)，進(jìn)一步探究姜黃素對慢性顳葉內(nèi)側(cè)癲癇大鼠癲癇發(fā)作情況的影響，同時探究姜黃素對慢性顳葉內(nèi)側(cè)癲癇大鼠血腦屏障通透性以及影響血腦屏障緊密連接的MMP-9水平的影響，為進(jìn)一步明確臨床上姜黃素改善血腦屏障功能及治療癲癇的可能性提供有力證據(jù)。

材料與方法

1.材料

1.1.藥物與試劑 姜黃素購自美國TargetMed公司（批號：T1534）。用二甲基亞砜把姜黃素溶解至200 g/L。鋰-匹羅卡品購自上海阿拉丁公司（批號：P129680，規(guī)格：250 mg）。白蛋白檢測試劑盒（BCG法）購自美國BioAssay Systems公司。大鼠MMP-9酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（貨號：XY0001H594）購自上海信裕生物科技有限公司。

1.2.試驗(yàn)動物 Sprague-Dawley大鼠購自廣東省實(shí)驗(yàn)動物中心（SCXK2021-0002）（6～8周，雌性，體質(zhì)量160～180 g），飼養(yǎng)在受控環(huán)境條件下（環(huán)境溫度24～25 ℃；濕度50%～60%；早上7點(diǎn)到晚上7點(diǎn)亮燈），自由獲得食物和水。

2.鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)慢性顳葉內(nèi)側(cè)癲癇大鼠

本研究于2021年2月至2023年2月在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院開展。本研究的所有大鼠均采用目前國內(nèi)外公認(rèn)的成熟的化學(xué)點(diǎn)燃方法（即鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)）構(gòu)建顳葉內(nèi)側(cè)癲癇模型［15］：先用鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)，經(jīng)過一定的潛伏期后待大鼠出現(xiàn)反復(fù)自發(fā)性發(fā)作后。若癲癇持續(xù)狀態(tài)后2個月內(nèi)出現(xiàn)至少2次反復(fù)自發(fā)性發(fā)作，則判定慢性顳葉內(nèi)側(cè)癲癇模型構(gòu)建成功。

3.分組及處理

將所有成功構(gòu)建慢性顳葉內(nèi)側(cè)癲癇大鼠隨機(jī)分為2組：姜黃素組及生理鹽水組，并做好標(biāo)記。對于姜黃素組大鼠每天予以腹腔注射姜黃素溶液，給藥劑量為100 mg/kg，給藥體積為0.5 ml；生理鹽水組大鼠每天予以腹腔注射0.5 ml生理鹽水。干預(yù)期為4周。

4.癲癇發(fā)作監(jiān)測

用錄像設(shè)備記錄各組大鼠的日常狀況，根據(jù)Racine評分系統(tǒng)評分細(xì)則對各組大鼠癲癇發(fā)作情況進(jìn)行判斷并記錄。

5.腦脊液及血標(biāo)本收集

各組大鼠在建模前、藥物干預(yù)前及藥物干預(yù)后分別收集腦脊液及血標(biāo)本各500 μl，用于腦脊液和血漿中白蛋白及MMP-9的檢測。所有收集的血液樣本在進(jìn)行檢測前均進(jìn)行離心（3 000轉(zhuǎn)/min，10 min）并獲取血漿。

6.腦脊液及血漿標(biāo)本中白蛋白和MMP-9水平檢測

使用ELISA對腦脊液及血漿標(biāo)本中白蛋白和MMP-9濃度進(jìn)行檢測。用于檢測大鼠腦脊液及血漿白蛋白濃度的ELISA試劑盒購自泉州市睿信生物科技有限公司（貨號：RX302891R）。用于檢測大鼠腦脊液及血漿MMP-9濃度的ELISA試劑盒購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司（貨號：AE90721Ra-96T）。根據(jù)各劑盒操作步驟進(jìn)行各待測液中白蛋白及MMP-9水平的檢測。

7.統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。兩組間計量資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，干預(yù)前后比較采用配對t檢驗(yàn)。對于建模前、干預(yù)前、干預(yù)后的數(shù)據(jù)比較，我們采用了單因素方差分析進(jìn)行，并進(jìn)行了事后多重比較，以對比不同階段各組大鼠的各項指標(biāo)的變化。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

32只大鼠中成功構(gòu)建顳葉內(nèi)側(cè)癲癇模型大鼠17只，隨其分為兩組。其中，姜黃素組9只，生理鹽水組8只。

1.干預(yù)前后兩組大鼠癲癇發(fā)作頻次改變（表1）

表1 干預(yù)前后兩組慢性顳葉內(nèi)側(cè)癲癇大鼠反復(fù)自發(fā)性發(fā)作頻次比較（次/4周，）

表1 干預(yù)前后兩組慢性顳葉內(nèi)側(cè)癲癇大鼠反復(fù)自發(fā)性發(fā)作頻次比較（次/4周，）

注：姜黃素組大鼠予以腹腔注射姜黃素（100 mg/kg）干預(yù)，生理鹽水組大鼠予以腹腔注射生理鹽水

組別姜黃素組生理鹽水組t值P值只數(shù)9 8干預(yù)前22.330±2.398 22.750±2.375 0.382 0.723干預(yù)后21.670±2.121 21.500±2.449 0.153 0.881 t值0.618 1.035 P值0.545 0.318

干預(yù)前兩組大鼠癲癇發(fā)作頻次差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。干預(yù)后，兩組大鼠癲癇發(fā)作頻次差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），兩組大鼠癲癇發(fā)作頻次與干預(yù)前相比無顯著改變（均P＞0.05）。

2.建模前及干預(yù)前、后兩組大鼠白蛋白商變化情況（表2）

表2 建模前及干預(yù)前、后兩組慢性顳葉內(nèi)側(cè)癲癇大鼠腦脊液及血漿中白蛋白濃度變化（）

表2 建模前及干預(yù)前、后兩組慢性顳葉內(nèi)側(cè)癲癇大鼠腦脊液及血漿中白蛋白濃度變化（）

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建模前，兩組大鼠腦脊液白蛋白濃度、血漿白蛋白濃度、白蛋白商（白蛋白商=腦脊液白蛋白濃度/血清白蛋白濃度）差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。建模成功后，兩組大鼠的腦脊液白蛋白濃度及白蛋白商均高于建模前（均P＜0.05）。給予不同的干預(yù)后，姜黃素組大鼠的白蛋白商較干預(yù)前顯著下降（P＜0.05），而生理鹽水組干預(yù)前、后的白蛋白商差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3.建模前及干預(yù)前、后兩組大鼠腦脊液、血漿中MMP-9變化情況（表3）

表3 建模前及干預(yù)前、后兩組慢性顳葉內(nèi)側(cè)癲癇大鼠腦脊液及血漿中MMP-9變化情況（μg/L，）

表3 建模前及干預(yù)前、后兩組慢性顳葉內(nèi)側(cè)癲癇大鼠腦脊液及血漿中MMP-9變化情況（μg/L，）

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建模前，兩組間腦脊液和血漿中MMP-9濃度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。建模成功后（干預(yù)前），兩組大鼠腦脊液中MMP-9濃度均顯著高于建模前（均P＜0.05）。給予干預(yù)后，姜黃素組大鼠腦脊液中MMP-9濃度較干預(yù)前顯著降低（P=0.027）。與此同時，該組大鼠血漿中MMP-9濃度也有下降的趨勢，但該變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。而生理鹽水組無論是腦脊液中還是血漿中MMP-9濃度與干預(yù)前相比，干預(yù)后均無顯著改變（均P＞0.05）。

討論

自1970年起，陸續(xù)有研究報道癲癇會影響血腦屏障的完整性及功能［16］。在動物模型中發(fā)現(xiàn)，在癲癇發(fā)作后的幾分鐘內(nèi)，血腦屏障便出現(xiàn)不同程度的損傷，這種損傷可持續(xù)數(shù)小時甚至數(shù)天［3］。van Vliet等［6］的研究發(fā)現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)會導(dǎo)致血腦屏障損傷的發(fā)生，并且這種損傷的發(fā)生和發(fā)展會蔓延至慢性期，持續(xù)時長達(dá)數(shù)周至數(shù)個月不等。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)血腦屏障的損傷一定程度上影響著癲癇發(fā)作的頻次。這提示癲癇病情的持續(xù)可能與血腦屏障的損傷有關(guān)。

姜黃素作為從姜黃屬類植物根莖中提取出來的多酚化合物，具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基等功能，對神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等均有著保護(hù)作用［17］。本研究發(fā)現(xiàn)：給予姜黃素干預(yù)后，模型鼠白蛋白商（腦脊液白蛋白/血漿白蛋白比值）較干預(yù)前顯著下降。這提示姜黃素在一定程度上改變了血腦屏障的通透性，這與先前的研究結(jié)果是相類似的。既往的研究表明，姜黃素可以降低氧化應(yīng)激反應(yīng)造成的神經(jīng)系統(tǒng)損傷，并對受損的血腦屏障起到修復(fù)作用［18］。與此同時，本研究還發(fā)現(xiàn)姜黃素對腦脊液MMP-9水平有著顯著的影響。而既往的研究已經(jīng)指出：MMP-9可降解緊密連接中重要組成部分——claudin-5和ZO-1，從而降低血腦屏障的結(jié)構(gòu)完整性，進(jìn)而造成血腦屏障通透性改變和血腦屏障損傷［11］。因此，姜黃素除了通過減少因氧化應(yīng)激反應(yīng)造成的血腦屏障損傷外，還可能通過調(diào)節(jié)影響緊密連接結(jié)構(gòu)的蛋白酶表達(dá)水平進(jìn)而對血腦屏障起到保護(hù)作用。

此外，本研究結(jié)果顯示：姜黃素并未對慢性顳葉內(nèi)側(cè)癲癇大鼠癲癇發(fā)作頻次起到顯著的影響。既往的研究結(jié)果表明：白蛋白通過破損的血腦屏障進(jìn)入大腦細(xì)胞外空間后可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β/ALK5信號通路的激活，進(jìn)而誘導(dǎo)興奮性的突觸形成，從而導(dǎo)致自發(fā)性癲癇的發(fā)生［19］。而當(dāng)使用AT1受體拮抗劑阻斷TGF-β信號通路后，有效抑制了大腦細(xì)胞外間隙中的白蛋白對腦內(nèi)TGF-β通路激活的誘導(dǎo)作用，從而達(dá)到減少自發(fā)性癲癇發(fā)作的作用［20］。因此，血腦屏障受損修復(fù)后，白蛋白從血液中滲入腦內(nèi)減少，從而一定程度地抑制癲癇發(fā)作。本研究中，所有模型鼠在接受姜黃素干預(yù)前已經(jīng)存在血腦屏障損傷，即已存在白蛋白從血液中滲入到腦內(nèi)的現(xiàn)象。而模型鼠接受姜黃素干預(yù)的時間是相對局限的，僅有14 d時間。雖然結(jié)果顯示姜黃素對血腦屏障損傷程度有所逆轉(zhuǎn)，但逆轉(zhuǎn)的程度是否已經(jīng)到達(dá)有效抑制白蛋白從血液中向腦內(nèi)滲透的程度仍是不確定的。此外，姜黃素可能是通過對血腦屏障損傷進(jìn)行修復(fù)并減少刺激因素——白蛋白入腦，進(jìn)而進(jìn)一步抑制癲癇發(fā)生，而并不一定對干預(yù)前已滲入到腦內(nèi)并可引起癲癇發(fā)作的白蛋白起到清除作用。在有限的干預(yù)時間內(nèi)，姜黃素的修復(fù)效果還未達(dá)到完成修復(fù)且腦內(nèi)滲入的白蛋白仍未被有效清除，模型鼠的癲癇發(fā)作狀況也可能因此而未有明顯改善。因此，姜黃素對癲癇發(fā)作的影響是否受到療程和治療劑量的影響仍需進(jìn)一步研究和探討。

姜黃素可能通過改變腦脊液中MMP-9水平來改變慢性顳葉內(nèi)側(cè)癲癇大鼠血腦屏障緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能，從而改變血腦屏障的通透性，進(jìn)而對受損的血腦屏障起到一定的修復(fù)作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明郭彩鳳：起草文章，獲取研究經(jīng)費(fèi)；譚燕：行政、技術(shù)或材料支持，支持性貢獻(xiàn)；張岳峰：行政、技術(shù)或材料支持，指導(dǎo)，支持性貢獻(xiàn)；周華榮：分析/解釋數(shù)據(jù)；陳國華：采集數(shù)據(jù)；方雅秀：分析/解釋數(shù)據(jù)；藍(lán)曉鳳：醞釀和設(shè)計試驗(yàn)，實(shí)施研究，對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱，獲取研究經(jīng)費(fèi)