李靜純 龍其雄 馮峰 孫偉

1廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣州 510800；2廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，廣州 510800

結(jié)直腸癌是全球第三常見的惡性腫瘤，病死率位居第二，盡管常規(guī)治療有明顯改善，但由于頻繁復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，5年生存率仍低于20%，而被診斷為4期結(jié)直腸癌患者5年生存率低于10%［1-3］。中國正處于癌癥高發(fā)期，據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)直腸癌發(fā)病率迅速增加，且病死率高［4］。傳統(tǒng)中醫(yī)藥在中國已被廣泛使用數(shù)千年，由于中藥具有較少的毒性作用被應(yīng)用于多種疾病治療［5］。大量數(shù)據(jù)表明中藥是一種潛在的有效抗癌藥物［6］，中藥具有多成分、多靶點(diǎn)等特點(diǎn)，臨床治療大多以復(fù)方形式，有實(shí)驗(yàn)研究表明中藥復(fù)方在抑制小鼠腫瘤生長的效果較單味中藥好［7］。黃芪、半枝蓮均具有清熱解毒、抗炎抗癌等功效，但黃芪聯(lián)合半枝蓮抗結(jié)直腸癌的機(jī)制尚未闡明。隨著生物信息的發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是代表一種基于“疾病-基因-藥物”相互作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系方法，能系統(tǒng)從分子水平角度分析中藥復(fù)方對疾病靶點(diǎn)的影響［8-9］。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法探討黃芪-半枝蓮抗結(jié)直腸癌的有效成分及潛在分子機(jī)制，為中藥復(fù)方治療疾病提供依據(jù)。

材料與方法

1.黃芪-半枝蓮有效活性成分篩選與蛋白靶點(diǎn)獲取

通過中藥藥理學(xué)分析平臺數(shù)據(jù)庫（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）檢索黃芪、半枝蓮成分，設(shè)置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）值≥30，類藥性（druglikeness，DL）值≥0.18，篩選有效活性成分以及相關(guān)作用靶點(diǎn)，利用UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）對靶點(diǎn)進(jìn)行匹配。

2.結(jié)直腸癌相關(guān)基因靶點(diǎn)獲取

通過孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）（https：//omim.org/）、GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）、治療目標(biāo)數(shù)據(jù)庫（Therapeutic Target Database，TTD）（http：//db.idrblab.net/ttd/）和Drug-bank數(shù)據(jù)庫（https：//www.drugbank.ca/）結(jié)直腸癌靶點(diǎn)，并且與藥物靶點(diǎn)繪制韋恩圖，篩選交集基因，即藥物作用疾病的潛在靶點(diǎn)。

3.“藥物-活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建以及分析

利用Cytoscape_v3.9.1軟件繪制可視化“藥物-活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，通過軟件中的Network Analyzer工具及cytoNCA插件分析對網(wǎng)絡(luò)圖每個(gè)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分析，以3個(gè)參數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，分別為：（1）連接度中心性（degree centrality，DC）；（2）緊密度中心性（closeness centrality，CC）；（3）中介中心性（betweeness centrality，BC），DC值越高，BC值和CC值就越大，以此來篩選網(wǎng)絡(luò)圖中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，即活性成分中的關(guān)鍵成分。

4.構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

將潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）構(gòu)建蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖，將PPI網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape_v3.9.1軟件，使用cytoNCA插件計(jì)算各個(gè)靶點(diǎn)的DC、BC、CC值，最終篩選出核心靶點(diǎn)，并且用Cytoscape_v3.9.1構(gòu)建關(guān)鍵成分與核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

5.基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析

將潛在靶點(diǎn)列表導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫（https：//metascape.org/），收集細(xì)胞生物進(jìn)展（biological processes，BP）、細(xì)胞成分（cellular component）、分子功能（molecular function，MF）數(shù)據(jù)，同時(shí)對潛在靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析，制作富集分析圖。

結(jié)果

1.黃芪與半枝蓮有效成分及潛在靶點(diǎn)（表1）

表1 黃芪-半枝蓮有效成分

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索黃芪與半枝蓮的成分，將條件設(shè)置為OB值≥30且DL值≥0.18進(jìn)一步篩選兩者的有效成分，結(jié)果黃芪共篩出17種有效活性成分，半枝蓮篩出28種有效成分，并且黃芪獲得蛋白作用靶點(diǎn)463個(gè)，半枝蓮獲得589個(gè)作用靶點(diǎn)。將靶點(diǎn)與UniProt數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配。

2.黃芪-半枝蓮抗結(jié)直腸癌的潛在靶點(diǎn)（圖1）

圖1 黃芪-半枝蓮抗結(jié)直腸癌的潛在靶點(diǎn)交集。A：黃芪；B：半枝蓮；C：結(jié)直腸癌

通過GeneCards、OMIM、TTD和Drug-bank數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)直腸癌相關(guān)靶點(diǎn)，共獲取9 117個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，與黃芪-半枝蓮作用靶點(diǎn)相互匹配后，交集得到24個(gè)共同靶點(diǎn)，即黃芪-半枝蓮作用于結(jié)直腸癌的潛在靶點(diǎn)。

3.構(gòu)建“黃芪/半枝蓮-有效成分-藥物靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖并且篩選關(guān)鍵成分（圖2、表2）

圖2 黃芪-半枝蓮抗結(jié)直腸癌的“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

表2 DC值最高的前5種關(guān)鍵成分具體信息

利用Cytoscape_v3.9.1軟件構(gòu)建黃芪-半枝蓮的有效活性成分與潛在靶點(diǎn)的關(guān)系圖，通過Network Analyzer工具及cytoNCA插件分析網(wǎng)絡(luò)圖每個(gè)節(jié)點(diǎn)的DC、BC、CC值，篩選DC值最高的前5種關(guān)鍵成分。

4.PPI網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建以及核心靶點(diǎn)篩選（圖3、圖4）

圖3 黃芪-半枝蓮抗結(jié)直腸癌的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

圖4 黃芪-半枝蓮抗結(jié)直腸癌的關(guān)鍵成分與核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

將24個(gè)潛在靶點(diǎn)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并篩選出5個(gè)核心靶點(diǎn)，繪制關(guān)鍵成分與核心靶點(diǎn)關(guān)系圖。

5.對潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析（圖5～7）

圖5 基因本體論（GO）富集分析細(xì)胞成分條形圖

圖6 基因本體論（GO）富集分析細(xì)胞生物進(jìn)展（BP）條形圖

圖7 基因本體論（GO）富集分析分子功能（MF）條形圖

通過Metascape數(shù)據(jù)庫對潛在基因進(jìn)行GO富集分析，其中細(xì)胞成分富集到20項(xiàng)，BP富集到337項(xiàng)，MF富集到30項(xiàng)，選擇其中P值最小的前20項(xiàng)以條形圖進(jìn)行展示。通過富集分析發(fā)現(xiàn)，黃芪-半枝蓮抗結(jié)直腸癌主要作用于溶酶體、黑素小體、膜筏、微膜區(qū)、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)、核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、轉(zhuǎn)錄復(fù)合物等；生物進(jìn)展方面，主要表現(xiàn)在對外界刺激反應(yīng)、參與凋亡調(diào)控過程、調(diào)節(jié)酶活性等生物過程；分子功能方面，主要與蛋白激酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、ATP依賴性活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等功能相關(guān)。

6.對潛在靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG信號通路富集分析（圖8）

圖8 京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路富集氣泡圖

通過Metascape數(shù)據(jù)庫對潛在基因進(jìn)行KEGG信號通路富集分析，共富集到89項(xiàng)，主要富集于小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、胰腺癌等，信號通路主要富集于磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路等，選擇富集程度最高的前20項(xiàng)繪制氣泡圖。

討論

結(jié)直腸癌是全球第三常見的惡性腫瘤，病死率位居第二，中國正處于結(jié)直腸癌發(fā)病率迅速增加時(shí)期［1-2］。近年研究顯示，中藥是一種潛在的有效抗癌藥物［6］，本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法系統(tǒng)闡述黃芪-半枝蓮與結(jié)直腸癌靶點(diǎn)之間相互作用及潛在機(jī)制。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法，能系統(tǒng)呈現(xiàn)中藥的生物活性化合物與目標(biāo)之間的相互作用，和各目標(biāo)之間的交互作用，并找出關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，為中藥復(fù)方治療疾病提供理論依據(jù)［6］。

通過TCMSP平臺我們檢索到黃芪活性成分17種，半枝蓮活性成分28種以及相關(guān)靶點(diǎn)。其中DC值最高的關(guān)鍵成分包括槲皮素、木犀草素、黃芩素等5種，槲皮素是一種水溶性糖苷，也是一種植物雌激素，能抑制結(jié)直腸癌發(fā)展，促進(jìn)凋亡［10］；木犀草素是有效的抗癌類黃酮，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期阻滯、凋亡和細(xì)胞增殖來達(dá)到抗結(jié)直腸癌效果［11］；黃芩素和漢黃芩素是從黃芩中提取的有效活性成分，能有效抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞活性和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡［12-13］；山柰酚屬于多酚類，能有效抑制結(jié)直腸癌生長，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［14］。

通過韋恩圖交集，分析PPI網(wǎng)絡(luò)圖，我們篩選出黃芪-半枝蓮抗結(jié)直腸癌5個(gè)核心基因，包括MYC、TP53、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）9等。MYC基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著核心作用，MYC基因失調(diào)與結(jié)直腸癌的侵襲性和不良預(yù)后相關(guān)，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蟲草素通過下調(diào)MYC表達(dá)從而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖［2，15］。TP53基因是腫瘤抑制因子，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、DNA損傷修復(fù)等功能，對臨床用藥及預(yù)后監(jiān)測具有指導(dǎo)意義［16-17］。Bian等［18］研究結(jié)果顯示川芎嗪抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，隨著藥物劑量性依賴可上調(diào)P53表達(dá)，阻滯細(xì)胞周期。MMP9基因是MMP家族成員之一，MMP9在各種腫瘤中表達(dá)以及活性顯著上調(diào)，被認(rèn)為是結(jié)直腸癌等腫瘤的潛在標(biāo)志物［19］。Wang等［20］通過體內(nèi)體外試驗(yàn)顯示，華蟾素可顯著下調(diào)MMP9的表達(dá)，明顯抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制腫瘤生長。AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，在細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物過程中發(fā)揮著重要作用，是PI3K/AKT/MTOR信號通路的一部分，刺激細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤進(jìn)展［21］。王璐等［22］通過研究發(fā)現(xiàn)，人參多糖可能通過下調(diào)PI3K/AKT信號通路抑制結(jié)腸癌發(fā)展，發(fā)揮對結(jié)腸癌的治療作用。caspase蛋白酶家族在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。caspase缺乏與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，caspase3是caspase家族關(guān)鍵成員，在細(xì)胞凋亡執(zhí)行階段發(fā)揮著核心作用，可促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡并抑制腫瘤發(fā)展［23］。Feng等［24］結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸補(bǔ)血湯抗結(jié)腸癌作用與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，通過上調(diào)caspase3、cl-caspase3蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，抑制疾病進(jìn)展。綜上分析，黃芪-半枝蓮可能通過多個(gè)蛋白靶點(diǎn)發(fā)揮抗結(jié)直腸癌作用。

通過KEGG信號通路富集分析顯示，主要涉及非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌等疾病通路，PI3K/AKT、MAPK和TNF信號通路等。PI3K/AKT是腫瘤相關(guān)重要通路，與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、耐藥等相關(guān)，并且是細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)控因子，一旦該通路被過度激活，將促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，抑制凋亡［25-26］。Sheng等［27］通過試驗(yàn)驗(yàn)證半枝蓮可減弱PI3K/AKT信號通路，從而抑制前列腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。MAPK信號通路參與一系列細(xì)胞反應(yīng)，包括細(xì)胞增殖、分化、炎癥和凋亡，細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinas，ERK）、c-Jun N端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、P38激酶是MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白［28-29］。在腫瘤發(fā)生過程中往往觀察到ERK過度激活；P38與炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和自噬有關(guān)，是腫瘤進(jìn)展的抑制劑；JNK是一種應(yīng)激激酶，在腫瘤細(xì)胞中主要參與細(xì)胞凋亡過程。大量試驗(yàn)證明ERK的激活與促進(jìn)細(xì)胞增殖密切相關(guān)，P38和JNK的激活可促進(jìn)炎癥和細(xì)胞凋亡［28］。王加茹等［30］通過試驗(yàn)研究表明，隱丹參酮對食管癌細(xì)胞具有較好殺傷作用，促進(jìn)p-JNK、p-P38表達(dá)，下調(diào)p-ERK表達(dá)，提示可能通過MAPK途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。TNF-α是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的炎性細(xì)胞因子，可能是腫瘤的抑制劑。Hsuan等［31］研究顯示，山葵提取物可激活TNF-α，TNF-α與其相應(yīng)的受體相結(jié)合，促進(jìn)caspase3、caspase8、Bid等蛋白表達(dá)，進(jìn)而促使結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，抑制疾病進(jìn)展。綜合分析可知，黃芪-半枝蓮可通過影響多條疾病通路、多條相關(guān)信號通路達(dá)到抗癌的效果

綜上所述，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法，對黃芪-半枝蓮的抗結(jié)直腸癌作用機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)分析，從理論基礎(chǔ)上闡述黃芪-半枝蓮抗結(jié)直腸癌是通過“多成分、多靶點(diǎn)、多通路”協(xié)同發(fā)揮治療抗腫瘤效應(yīng)，但仍需進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)體外試驗(yàn)研究，為臨床治療提供理論依據(jù)。

作者貢獻(xiàn)聲明李靜純：采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)，起草文章；龍其雄：統(tǒng)計(jì)分析，指導(dǎo)；馮峰：指導(dǎo)；孫偉：對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱，指導(dǎo)