曹鵬飛　吳華芬　陳銀華

摘要：桃樹(shù)細(xì)菌性穿孔病發(fā)生普遍，嚴(yán)重制約了桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。為研究植物內(nèi)生菌對(duì)桃樹(shù)細(xì)菌性穿孔病病原菌的抑制作用，從健康桃樹(shù)、博落回、金銀花、板栗等健康植物材料中分離篩選出優(yōu)勢(shì)拮抗內(nèi)生菌株，并測(cè)定其胞外代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌細(xì)胞膜與細(xì)胞壁通透性、纖維素酶活性、胞外多糖（EPS）含量、呼吸代謝、核酸含量的影響。結(jié)果表明，分離得到的45株內(nèi)生菌中，從金銀花植株中分離的曲霉屬JYY-3菌株抑菌效果最好，其最小抑菌濃度（MIC）、最低殺菌濃度（MBC）分別為50、200 mg/mL。經(jīng)該菌株胞外代謝產(chǎn)物處理后，桃樹(shù)細(xì)菌穿孔病病原菌核酸泄漏量、AKP活性和電導(dǎo)率顯著提高，且濃度越高效果越明顯。此外，JYY-3菌株胞外代謝產(chǎn)物能顯著降低病原菌纖維素酶活性、EPS含量、DNA和RNA含量，抑制其琥珀酸脫氫酶（SDH）、蘋(píng)果酸脫氫酶（MDH）活性，且濃度越高作用越強(qiáng)，經(jīng)2.0MIC 菌株JYY-3代謝產(chǎn)物處理12 h后，桃樹(shù)細(xì)菌穿孔病病原菌的SDH、MDH活性較對(duì)照組分別降低107.644、13.729 U/mg?？梢?jiàn)，金銀花內(nèi)生菌株JYY-3對(duì)桃樹(shù)細(xì)菌性穿孔病病原菌有顯著的抑制作用，可通過(guò)抑制纖維素酶活性及EPS合成以減弱病原菌入侵植物能力，增大細(xì)胞壁和細(xì)胞膜通透性使內(nèi)容物外泄，抑制核酸合成以及呼吸酶活性等途徑抑制病原菌的繁殖。本研究結(jié)果為植物內(nèi)生菌防治桃樹(shù)細(xì)菌性穿孔病的進(jìn)一步研究奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：桃樹(shù)細(xì)菌性穿孔?。恢参飪?nèi)生菌；抑菌活性；抑菌機(jī)制；胞外代謝產(chǎn)物

中圖分類(lèi)號(hào)：S436.621.1+9文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2023）17-0131-07

桃樹(shù)細(xì)菌性穿孔病是由黃單胞桿菌屬甘藍(lán)黑腐黃單胞菌（Xanthomonas campestris pv. pruni）侵染造成的劣性病害［1］。該病害在全國(guó)各地普遍發(fā)生，發(fā)病時(shí)間多在4—5月中旬，8月為發(fā)病盛期。若該病防治不及時(shí)，常造成大量落葉，營(yíng)養(yǎng)累積減少，花芽形成異常，最終導(dǎo)致樹(shù)勢(shì)衰落，嚴(yán)重制約桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前針對(duì)桃樹(shù)細(xì)菌性穿孔病的防治主要以傳統(tǒng)防治和化學(xué)防治為主，常用的化學(xué)農(nóng)藥主要有葉枯唑可濕性粉劑、二氯異氰酸鈉、波爾多液及噻菌銅等［2］。這些化學(xué)農(nóng)藥主要在植株發(fā)病初期使用才能達(dá)到較好的防效，但隨著病害的大面積暴發(fā)，防效會(huì)明顯降低。同時(shí)，隨著化學(xué)農(nóng)藥的反復(fù)使用常造成農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等一系列問(wèn)題。因此，尋找低毒、高效的防治手段迫在眉睫。

植物內(nèi)生菌（endophyte）是存活于健康植物組織內(nèi)部、不引發(fā)宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的微生物類(lèi)群，是其微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分［3-4］。據(jù)研究表明，許多內(nèi)生菌能產(chǎn)生抗生素、水解酶類(lèi)、黃酮和生物堿等次級(jí)代謝產(chǎn)物，可抵抗宿主植株中致病菌引起的病害發(fā)生［5］。目前已有學(xué)者對(duì)內(nèi)生菌防治果樹(shù)細(xì)菌性病害做了一定的研究，如劉冰等從臍橙中分離獲得1株對(duì)柑橘潰瘍病防效達(dá)89.4%的內(nèi)生細(xì)菌［6］；崔麗紅等通過(guò)拮抗活性試驗(yàn)從9株絞股藍(lán)根際內(nèi)生菌中篩選出3株對(duì)獼猴桃潰瘍病致病菌有明顯抑制效果的內(nèi)生菌，經(jīng)盆栽試驗(yàn)表明這3株菌均可降低致病菌入侵植物體內(nèi)的概率［7］。近年來(lái)，雖已分離出一些拮抗作用較強(qiáng)的內(nèi)生菌，但主要用于果樹(shù)潰瘍病的防治，對(duì)于桃樹(shù)細(xì)菌性穿孔病防治及其機(jī)制研究少有報(bào)道。因此，本研究從健康植株中分離篩選出對(duì)桃樹(shù)細(xì)菌性穿孔病有拮抗作用的菌株，并對(duì)其抑菌機(jī)制進(jìn)行初步研究，旨在為桃樹(shù)細(xì)菌性穿孔病提供新的防治途徑，為內(nèi)生菌防治桃樹(shù)細(xì)菌性穿孔病提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 植物材料與供試菌株

1.1.1 植物材料

健康的桃樹(shù)、板栗植株，采自浙江省麗水市蓮都區(qū)雙黃鄉(xiāng)雨傘崗；金銀花和博落回采自蓮都區(qū)白云山。以上樣品均于2022年3月5日采回進(jìn)行內(nèi)生菌的分離。

1.1.2 供試菌株

桃樹(shù)穿孔病病原菌甘藍(lán)黑腐黃單胞菌，從患病的桃樹(shù)莖部分離獲得。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

1.2.1 培養(yǎng)基

試驗(yàn)主要培養(yǎng)基有牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基，分別用于植物內(nèi)生細(xì)菌、真菌和放線菌的分離與培養(yǎng)。

1.2.2 主要試劑

試驗(yàn)主要試劑有堿性磷酸酶（AKP）、蘋(píng)果酸脫氫酶（MDH）、琥珀酸脫氫酶（SDH）等試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，DAPI熒光染料購(gòu)自Gen-View科技有限公司。

1.3 主要儀器

試驗(yàn)主要儀器有熒光分光光度計(jì)（天津拓普儀器有限公司，F(xiàn)97）、顯微鏡（徠卡顯微系統(tǒng)，DMi8）、電導(dǎo)率儀（上海雷磁新涇儀器有限公司）、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司，SP-756P）等。

1.4 植物內(nèi)生菌的分離與優(yōu)勢(shì)拮抗菌株的篩選

1.4.1 植物內(nèi)生菌株的分離及其胞外代謝產(chǎn)物的制備

采用組織塊分離法［8］，將健康桃樹(shù)、板栗、博落回、金銀花等植物的根、莖、葉消毒后，接種于牛肉膏蛋白胨、PDA、高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板上，于適宜溫度培養(yǎng)1～7 d，每天觀察各平板上的菌落形態(tài)、顏色等特征，挑取菌落形態(tài)明顯不同的單菌落經(jīng)純化后于4 ℃保存。將各菌株接入相應(yīng)的培養(yǎng)液，于適宜溫度振蕩培養(yǎng)1～5 d，4 000 r/min離心10 min，取上清于55 ℃蒸發(fā)濃縮至20 mL后冷凍干燥，配成0.2 g/mL母液，用0.22 μm的無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾除菌后低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 優(yōu)勢(shì)拮抗菌株的篩選及MIC、MBC測(cè)定

取活化24 h的桃樹(shù)穿孔病病原菌甘藍(lán)黑腐黃單胞菌于牛肉膏液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，稀釋成2×107 CFU/mL。用濾紙片法［9］測(cè)定各內(nèi)生菌菌株對(duì)病原菌的抑菌圈大小，初步篩選出優(yōu)勢(shì)菌株。用二倍稀釋法［10］將初篩菌株胞外代謝產(chǎn)物稀釋成1.562 5～400.000 0 mg/mL，每管加入2.5 mL對(duì)數(shù)期病原菌菌懸液（濃度為107 CFU/mL），以未接菌的培養(yǎng)液為對(duì)照，28 ℃ 振蕩培養(yǎng)24 h后加入配制好的 2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染液? 5 μL，2 h后觀察培養(yǎng)液顏色的變化，以未出現(xiàn)顏色的最低濃度為該菌株的最小抑菌濃度（MIC）［11］。以MIC最小的菌株為優(yōu)勢(shì)拮抗菌株。取優(yōu)勢(shì)菌株無(wú)色菌懸液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，以剛好無(wú)菌落生長(zhǎng)的濃度為最低殺菌濃度（MBC）。

1.5 優(yōu)勢(shì)拮抗菌株 JYY-3的鑒定

參考《真菌鑒定手冊(cè)》［12］，通過(guò)觀察優(yōu)勢(shì)拮抗菌株 JYY-3 菌落的形態(tài)、大小、顏色以及菌絲、孢子和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等顯微特征，以初步鑒定其種屬。

1.6 優(yōu)勢(shì)拮抗菌株 JYY-3抑菌機(jī)制確定

1.6.1 菌株JYY-3胞外代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌生長(zhǎng)曲線的影響

將培養(yǎng)好的甘藍(lán)黑腐黃單胞菌菌懸液與菌株JYY-3胞外代謝產(chǎn)物等體積混合培養(yǎng)，使胞外代謝產(chǎn)物終濃度分別為0.5、1.0、2.0倍MIC，以不加胞外代謝產(chǎn)物為對(duì)照，28 ℃振蕩培養(yǎng)0、1、2、4、6、8、10、14、18、24 h后進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)［13］，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、菌落數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制菌株 JYY-3不同濃度胞外代謝產(chǎn)物作用下病原菌的生長(zhǎng)曲線。

1.6.2 菌株JYY-3胞外代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌細(xì)胞膜、細(xì)胞壁的影響

取病原菌菌懸液加入胞外代謝產(chǎn)物，使其終濃度為分別為0.5、1.0、2.0倍MIC，振蕩培養(yǎng)0、1/6、1/3、1/2、2/3、5/6、1、2、8 h后取菌懸液，10 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液測(cè)定電導(dǎo)率。取培養(yǎng)好的病原菌菌液于4 000 r/min離心 10 min，取沉淀用1×PBS緩沖液洗滌2次后用PBS緩沖液制成2×107CFU/mL菌懸液，加入胞外代謝產(chǎn)物，使其終濃度分別為0.5、1.0、2.0倍MIC，振蕩培養(yǎng)0、1、2、3、4、5、6 h后取菌懸液，離心取上清液于260 nm處測(cè)定吸光度。另外按上述方法配制混合培養(yǎng)液，培養(yǎng) 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h后離心取上清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定堿性磷酸酶的活性。

1.6.3 菌株JYY-3胞外代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌致病能力的影響

取病原菌菌液加入胞外代謝產(chǎn)物，配制混合培養(yǎng)液，培養(yǎng)2、4、12、24 h后取菌懸液，用二硝基水楊酸（DNS）法［14］測(cè)定纖維素酶活力。取病原菌菌液加入胞外代謝產(chǎn)物，使其終濃度分別為 1/128MIC、1/64MIC、1/32MIC，培養(yǎng)0、6、12、24、48 h后取菌懸液，3 000 r/min離心10 min，取沉淀，蒸餾水洗滌3次（10 000 r/min，10 min），合并上清液，取1 mL加入4 mL無(wú)水乙醇沉淀多糖，3 000 r/min離心10 min，1 mL 蒸餾水復(fù)溶多糖，采用濃硫酸苯酚法［15］測(cè)定病原菌的胞外多糖（EPS）含量。

1.6.4 菌株JYY-3胞外代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌呼吸代謝的影響

取病原菌菌懸液加入胞外代謝產(chǎn)物，使其終濃度分別為0.5、1.0、2.0倍MIC，振蕩培養(yǎng)2、6、12、24 h后取菌懸液，于5 000 r/min，4 ℃條件下離心5 min，參照黃燕飛的方法［16］制備粗酶液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定琥珀酸脫氫酶（SDH）和蘋(píng)果酸脫氫酶（MDH）的活性，其活性以1 mg蛋白所含的活力單位數(shù)表示（U/mg）。

1.6.5 菌株JYY-3胞外代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌核酸合成的影響 取病原菌菌懸液加入胞外代謝產(chǎn)物，使其終濃度分別為0.5、1.0、2.0倍MIC，振蕩培養(yǎng)4、12、24 h后取菌懸液稀釋至600 nm下吸光度為0.5，用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色法［17］處理病原菌，于倒置熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度；用熒光分光光度計(jì)分別于364、400 nm 下測(cè)定病原菌 DNA和RNA的熒光強(qiáng)度。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物內(nèi)生菌的分離與優(yōu)勢(shì)拮抗菌株的篩選

本試驗(yàn)從健康桃樹(shù)、博落回、板栗和金銀花中共分離出45株內(nèi)生菌，其中內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生真菌各19株，內(nèi)生放線菌7株。在4種植株中，從桃樹(shù)上分離得到的內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生真菌最多，分別為6、8株，內(nèi)生放線菌于板栗中未有分離獲得，在其余植株中分離得也較少，總計(jì)僅7株。拮抗試驗(yàn)結(jié)果表明，在這45株內(nèi)生菌中共有38株對(duì)桃樹(shù)穿孔病病原菌甘藍(lán)黑腐黃單胞菌有抑制效果，其中15株內(nèi)生細(xì)菌，18株內(nèi)生真菌，5株內(nèi)生放線菌。抑制效果較好的菌株分別為分離自桃樹(shù)的內(nèi)生菌株TY-1和TG-6及金銀花內(nèi)生菌株JYY-3，其抑菌圈直徑分別達(dá)9.98、10.18、20.50 mm。經(jīng)TTC染色法分析可知，分別經(jīng)1.562 5～400.000 0 mg/mL 內(nèi)生菌株TY-1、TG-6、JYY-3 代謝產(chǎn)物處理后，桃樹(shù)細(xì)菌穿孔病病原菌培養(yǎng)液顏色隨胞外代謝產(chǎn)物濃度增大而變淺直至無(wú)色，其中JYY-3菌株處理組在 50 mg/mL 時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)無(wú)色，TY-1、TG-6菌株2個(gè)處理組均在400 mg/mL時(shí)才呈無(wú)色。這表明3個(gè)菌株的胞外代謝產(chǎn)物均能抑制桃樹(shù)細(xì)菌穿孔病病原菌生長(zhǎng)，其中JYY-3菌株MIC為50 mg/mL，TY-1與TG-6菌株MIC均為400 mg/mL。MIC越小，說(shuō)明其拮抗能力越強(qiáng)，故金銀花內(nèi)生菌株JYY-3為優(yōu)勢(shì)拮抗內(nèi)生菌。由平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果可知，當(dāng)菌株JYY-3代謝產(chǎn)物終濃度≥200 mg/mL時(shí)，平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)，因此其MBC為200 mg/mL。

2.2 優(yōu)勢(shì)拮抗菌株JYY-3的鑒定

金銀花內(nèi)生菌株JYY-3的菌絲白色，疏松，菌落形態(tài)為圓形，向四周擴(kuò)散，產(chǎn)綠色孢子；孢子梗光滑，呈桿狀，頂端著生分生孢子團(tuán)；孢子呈球形或卵狀（圖1），根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》可初步確定JYY-3菌株為曲霉屬內(nèi)生真菌。

2.3 優(yōu)勢(shì)拮抗菌株JYY-3對(duì)甘藍(lán)黑腐黃單胞菌的抑菌機(jī)制

2.3.1 對(duì)桃樹(shù)細(xì)菌穿孔病病原菌生長(zhǎng)曲線的影響

由圖2可知，對(duì)照組幾乎觀察不到遲緩期，在4 h處即開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)期，病菌大量繁殖，菌體數(shù)量迅速增加。經(jīng)各濃度JYY-3菌株胞外代謝產(chǎn)物處理后，病原菌菌體濃度較對(duì)照組極顯著下降（P<0.01），0.5MIC、1.0MIC 胞外代謝產(chǎn)物處理組的病原菌菌體均在4 h處進(jìn)入對(duì)數(shù)期，但菌體數(shù)量增加較對(duì)照組??；2.0MIC處理組的病原菌增長(zhǎng)最為緩慢，10 h后開(kāi)始明顯下降。各濃度處理組在14 h時(shí)的病原菌菌濃度與對(duì)照差異較大，分別減少10.23%、21.42%、36.36%，表明金銀花內(nèi)生菌株JYY-3胞外代謝產(chǎn)物可通過(guò)延長(zhǎng)遲緩期或減弱穿孔病菌對(duì)數(shù)期，有效抑制菌體增長(zhǎng)，達(dá)到抑菌效果，且濃度越大，抑制作用越明顯。

2.3.2 對(duì)桃樹(shù)細(xì)菌穿孔病病原菌細(xì)胞膜的影響

細(xì)胞通透性的改變會(huì)引起胞內(nèi)成分如鉀離子、鈉離子、核酸等物質(zhì)的釋放［18］，因此，可通過(guò)測(cè)定 JYY-3 菌株胞外代謝產(chǎn)物作用后穿孔病病原菌培養(yǎng)液電導(dǎo)率和核酸含量的變化來(lái)研究其對(duì)菌體細(xì)胞膜的影響。由圖3可知，隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組電導(dǎo)率于80 min內(nèi)穩(wěn)步上升，之后趨于穩(wěn)定，這可能與病原菌菌體濃度的升高有一定的關(guān)系［19］。而在0～40 min內(nèi)，各濃度JYY-3菌株胞外代謝產(chǎn)物處理組的電導(dǎo)率較對(duì)照組極顯著上升（P<0.01），在40 min時(shí)達(dá)到最大，分別比對(duì)照組高0.94、1.06、3.47 μS/cm，說(shuō)明高濃度的胞外代謝產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞膜的影響較大，能使原生質(zhì)及電解質(zhì)外滲，增大細(xì)胞膜的通透性。之后隨作用時(shí)間延長(zhǎng)，2.0MIC組電導(dǎo)率略有下降，但高于對(duì)照組。1.0MIC、0.5MIC組電導(dǎo)率顯著下降，明顯低于對(duì)照組，這可能是由于JYY-3菌株代謝產(chǎn)物濃度較小，致使后期隨著藥效下降使其對(duì)病原菌細(xì)胞膜的作用減弱；反而可能由于對(duì)金屬離子有螯合作用，使其電導(dǎo)率降低［19］。由圖4可知，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)照組胞外大分子物質(zhì)核酸含量維持在較低水平，而經(jīng)JYY-3菌株胞外代謝產(chǎn)物處理后，菌體在260 nm處的吸光度顯著高于對(duì)照組（P<0.05），在6 h時(shí)0.5MIC、1.0MIC、2.0MIC 組分別較對(duì)照高0.85、1.06、1.16，可見(jiàn)JYY-3菌株胞外代謝產(chǎn)物濃度越高，從菌體內(nèi)流出的 DNA、RNA 等大分子物質(zhì)成分越多，菌體細(xì)胞膜受損越嚴(yán)重。

2.3.3 對(duì)桃樹(shù)細(xì)菌穿孔病病原菌細(xì)胞壁的影響

堿性磷酸酶（AKP）是存在于細(xì)菌細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間的一種酶，在菌體正常生長(zhǎng)時(shí)胞外不能檢測(cè)到該酶活性，但當(dāng)細(xì)胞壁破壞后，將大量泄漏到胞外［20］。由圖5可知，在0～4.0 h的處理時(shí)間內(nèi)，對(duì)照組AKP活性始終較低，表明病原菌生長(zhǎng)較好，細(xì)胞壁完整。但經(jīng)不同濃度JYY-3菌株胞外代謝產(chǎn)物處理后，在最初的3.0 h內(nèi)AKP活性迅速上升，之后趨于穩(wěn)定，且胞外代謝產(chǎn)物濃度越高，AKP活性越高。這說(shuō)明金銀花內(nèi)生菌株JYY-3胞外代謝產(chǎn)物能破壞桃樹(shù)細(xì)菌穿孔病病原菌細(xì)胞壁的完整性，并且在較短的時(shí)間內(nèi)就能造成菌體細(xì)胞壁通透性的增加。

2.3.4 對(duì)桃樹(shù)細(xì)菌穿孔病病原菌纖維素酶的影響

纖維素酶是病原物產(chǎn)生的、能引起植物致病的重要因子，可通過(guò)水解宿主植物細(xì)胞壁組分使病原菌穿入并侵染宿主組織［21］。因此可通過(guò)測(cè)定纖維素酶的活性來(lái)研究JYY-3菌株胞外代謝產(chǎn)物對(duì)穿孔病菌侵入能力的影響。由圖6可知，試驗(yàn)組穿孔病菌纖維素酶活性極顯著低于對(duì)照組（P<0.01），且胞外代謝產(chǎn)物濃度越高，其活性越低。隨胞外代謝產(chǎn)物處理時(shí)間的延長(zhǎng)，纖維素酶活性不斷下降，在12 h時(shí)與對(duì)照組差異最大，經(jīng)0.5MIC、1.0MIC、2.0MIC胞外代謝產(chǎn)物作用后的菌體纖維素酶活性分別下降了50.43%、58.81%和74.87%。這表明金銀花內(nèi)生菌株JYY-3胞外代謝產(chǎn)物能通過(guò)抑制纖維素酶的活性來(lái)減弱桃樹(shù)細(xì)菌穿孔病病原菌對(duì)宿主細(xì)胞細(xì)胞壁的破壞作用，從而削弱病原菌入侵能力，且胞外代謝產(chǎn)物濃度越高，效果越好。

2.3.5 對(duì)桃樹(shù)細(xì)菌穿孔病病原菌胞外多糖（EPS）的影響

EPS是病原菌的致病生化因子，可導(dǎo)致宿主局部組織壞死，有助于病原菌抵御宿主細(xì)胞產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)或氧化劑的攻擊，也能干擾宿主對(duì)病原菌的免疫識(shí)別［22］。由圖7可知，經(jīng)JYY-3菌株胞外代謝產(chǎn)物處理后穿孔病病原菌菌體EPS含量極顯著的低于對(duì)照組。隨著濃度的升高，EPS含量逐漸降低，其中1/20MIC組含量最低。這說(shuō)明金銀花內(nèi)生菌株JYY-3胞外代謝產(chǎn)物能抑制桃樹(shù)細(xì)菌穿孔病病原菌胞外多糖的合成，使其毒性和擴(kuò)散能力降低，起到抑制病原菌致病性的作用，且胞外代謝產(chǎn)物濃度越高，抑制作用越強(qiáng)。

2.3.6 對(duì)桃樹(shù)細(xì)菌穿孔病病原菌呼吸代謝的影響

琥珀酸脫氫酶（SDH） 和蘋(píng)果酸脫氫酶（MDH）存在于所有氧呼吸細(xì)胞中，是三羧酸循環(huán)中的2種關(guān)鍵酶類(lèi)，在電子傳遞與能量轉(zhuǎn)換中起著關(guān)鍵作用［23-24］。由圖8、圖9可知，0～2 h內(nèi)，不同濃度JYY-3菌株胞外代謝產(chǎn)物處理組的SDH、MDH活性極顯著低于對(duì)照組。在12 h，2種酶活性下降最大，其中2.0MIC處理組SDH、MDH的活性最低，較對(duì)照組分別降低107.644、13.729 U/mg。這表明金銀花內(nèi)生菌株JYY-3可通過(guò)抑制SDH、MDH活性以抑制桃樹(shù)細(xì)菌穿孔病病原菌的呼吸作用，從而對(duì)能量代謝系統(tǒng)產(chǎn)生影響，且濃度越高，影響越大。

2.3.7 對(duì)桃樹(shù)細(xì)菌穿孔病病原菌胞內(nèi)核酸含量的影響 蛋白質(zhì)、DNA和RNA是衡量菌體生長(zhǎng)狀況的重要生物大分子，三者合成若受到影響會(huì)造成代謝紊亂［24-25］。由圖10可知，經(jīng)JYY-3菌株胞外代謝產(chǎn)物處理后，病原菌熒光強(qiáng)度明顯降低，且濃度越高，熒光亮度越弱。由圖11、圖12可知，胞外代謝產(chǎn)物處理組DNA、RNA含量均極顯著減少（P<0.01），經(jīng)2.0MIC胞外代謝產(chǎn)物作用24 h后，穿孔病菌DNA、RNA含量分別減少了58.46%、77.8%，表明JYY-3菌株胞外代謝產(chǎn)物對(duì)桃樹(shù)細(xì)菌穿孔病病原菌DNA、RNA的合成有抑制作用，且胞外代謝產(chǎn)物濃度越大，對(duì)病原菌正常生長(zhǎng)代謝影響越嚴(yán)重。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)從健康金銀花、桃樹(shù)、博落回、板栗植株中共分離得到45株內(nèi)生菌，包括19株內(nèi)生細(xì)菌，19株內(nèi)生真菌，7株內(nèi)生放線菌，其中抑菌活性最強(qiáng)的為從金銀花植株中分離的JYY-3菌株，經(jīng)鑒定為曲霉屬。李瑾也證實(shí)金銀花內(nèi)生真菌JY-2也具有較好抑菌活性，但經(jīng)鑒定其為鐮刀菌屬［26］。MIC測(cè)定結(jié)果表明，JYY-3菌株胞外代謝產(chǎn)物對(duì)桃樹(shù)細(xì)菌穿孔病病原菌甘藍(lán)黑腐黃單胞菌的最低抑菌濃度為50 mg/mL，當(dāng)其等于或高于此濃度時(shí)能延長(zhǎng)穿孔病菌遲緩期或減弱其對(duì)數(shù)期，使菌濃度保持在較低水平，以此達(dá)到抑制病原菌生長(zhǎng)的目的。

病原菌在生長(zhǎng)和繁殖過(guò)程中釋放的代謝產(chǎn)物對(duì)于菌體吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、吸附和入侵宿主機(jī)體以及抵抗宿主免疫因子的反應(yīng)等具有極為重要的作用［27-29］。如林海云等在青枯雷爾氏菌致病機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，病菌分泌的胞外多糖及纖維素酶可加快其在植物體內(nèi)的擴(kuò)散，進(jìn)而造成植株萎蔫或死亡［30］。因此，可通過(guò)抑制纖維素酶、胞外多糖等物質(zhì)合成來(lái)抑制病原菌對(duì)植物的入侵作用，如王芳研究發(fā)現(xiàn)，從苦參中篩選出的B36菌株能有效抑制葉霉病菌纖維素酶活性，從而降低其入侵番茄植株能力［31］。黃青春發(fā)現(xiàn)，拌種靈可通過(guò)抑制柑橘潰瘍病病原菌胞外多糖分泌從而抑制該病害在植株中生長(zhǎng)［32］。本試驗(yàn)研究結(jié)果也顯示，經(jīng)JYY-3菌株胞外代謝產(chǎn)物處理后，病原菌胞外多糖合成和纖維素酶活性在24 h較對(duì)照組分別降低58.81%、74.87%，這表明金銀花內(nèi)生菌株JYY-3胞外代謝產(chǎn)物可通過(guò)弱化胞外多糖的分泌及纖維素酶的活性來(lái)抑制桃樹(shù)細(xì)菌穿孔病病原菌在植株中的生長(zhǎng)及致病能力。

已有研究證實(shí)，許多活性成分的抑菌機(jī)制主要是通過(guò)破壞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的完整性和抑制蛋白、核酸的合成等途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)［33］。細(xì)胞膜和細(xì)胞壁是許多藥物發(fā)揮抑菌作用的靶點(diǎn)，如謝晶等研究植酸對(duì)腐敗希瓦氏菌的抑菌機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，藥物作用會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的破壞，使通透性增大，導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)容物的外漏，使培養(yǎng)液電導(dǎo)率和AKP活性上升［19］。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)JYY-3菌株胞外代謝產(chǎn)物處理后，桃細(xì)菌穿孔病病原菌培養(yǎng)液中電導(dǎo)率和核酸含量、AKP活性均較對(duì)照組顯著上升，這說(shuō)明金銀花內(nèi)生菌株JYY-3可通過(guò)破壞病菌的細(xì)胞膜及細(xì)胞壁完整性以抑制桃樹(shù)細(xì)菌穿孔病病原菌的生長(zhǎng)。

蛋白質(zhì)是生物生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，而核酸是遺傳信息的攜帶者，核酸含量的減少，會(huì)直接導(dǎo)致蛋白合成量的降低，從會(huì)嚴(yán)重影響菌體細(xì)胞的各項(xiàng)生理機(jī)能［34］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)JYY-3菌株胞外代謝產(chǎn)物作用后，桃細(xì)菌穿孔病病原菌DNA和RNA含量極顯著低于對(duì)照組，這說(shuō)明金銀花內(nèi)生菌株JYY-3胞外代謝產(chǎn)物可明顯抑制病原菌核酸的合成，從而影響其各項(xiàng)生理機(jī)能。另一方面，呼吸代謝是生物體進(jìn)行各項(xiàng)生命活動(dòng)的重要基礎(chǔ)，若病原菌的呼吸鏈被阻斷，其生長(zhǎng)所需的能量就無(wú)法合成［23-24］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)菌株JYY-3胞外代謝產(chǎn)物處理后，桃細(xì)菌穿孔病病原菌呼吸代謝所必需的琥珀酸脫氫酶、蘋(píng)果酸脫氫酶活性被顯著抑制。這表明，金銀花內(nèi)生菌株JYY-3可通過(guò)抑制琥珀酸脫氫酶和蘋(píng)果酸脫氫酶活性以阻斷桃細(xì)菌穿孔病病原菌的呼吸鏈，進(jìn)而抑制其生長(zhǎng)。其作用機(jī)制可能是胞外代謝產(chǎn)物中的有效成分與這2個(gè)酶?jìng)?cè)鏈的氨基酸結(jié)合，改變其構(gòu)象，使酶活性降低，從而抑制病原菌的呼吸代謝，但其具體的作用機(jī)制尚未明確。

綜上所述，從金銀花健康植株中篩選出的曲霉屬JYY-3菌株對(duì)桃樹(shù)細(xì)菌性穿孔病有較強(qiáng)抑制作用，其抑菌機(jī)制主要是通過(guò)抑制病原菌胞內(nèi)DNA、RNA的合成，破壞細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的完整結(jié)構(gòu)，抑制胞外多糖和纖維素酶合成，抑制菌體的呼吸代謝等途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。因此曲霉屬JYY-3菌株有望用于桃樹(shù)細(xì)菌性穿孔病的防治，但其抑菌活性物質(zhì)的確定及分離還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

［1］何 敬. 秦安縣桃樹(shù)細(xì)菌性穿孔病的發(fā)生及防治［J］. 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2019（7）：88-89.

［2］秦 霞，楊紅芳，劉清瑞. 桃樹(shù)細(xì)菌性穿孔病的發(fā)生因素與綜合防治［J］. 種業(yè)導(dǎo)刊，2016（7）：13-14.

［3］Wilson D. Endophyte：the evolution of a term，and clarification of its use and definition［J］. Oikos，1995，73（2）：274-276.

［4］Jia M，Chen L，Xin H L，et al. A friendly relationship between endophytic fungi and medicinal plants：a systematic review［J］. Frontiers in Microbiology，2016，7：906.

［5］尹雁玲，蔡 然，張功良，等. 植物內(nèi)生菌增強(qiáng)植物對(duì)生物脅迫抗性的研究進(jìn)展［J］. 廣西植物，2023，43（2）：212-220.

［6］劉 冰，李冬植，胡長(zhǎng)志，等. 柑橘可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌與寄主品種抗?jié)儾∠嚓P(guān)性的初步研究［J］. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35（2）：319-323，418.

［7］崔麗紅，宋金秋，陳繼富，等. 根際內(nèi)生菌對(duì)獼猴桃潰瘍病生防作用研究初探［J］. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，33（6）：28-32.

［8］黃海東，楊紅澎，王 玉，等. 云霧龍膽內(nèi)生菌的分離鑒定及抗菌活性分析［J］. 微生物學(xué)通報(bào)，2010，37（7）：1017-1021.

［9］譚才鄧，朱美娟，杜淑霞，等. 抑菌試驗(yàn)中抑菌圈法的比較研究［J］. 食品工業(yè)，2016，37（11）：122-125.

［10］曾范利，于 錄，葛 發(fā)，等. MABA法與二倍稀釋法測(cè)定齊墩果酸體外抗結(jié)核菌活性［J］. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（7）：22-25.

［11］張 燕. 酸馬奶源乳酸乳球菌代謝物和大黃聯(lián)合作用對(duì)小鼠盲腸微生物以及營(yíng)養(yǎng)代謝的影響［D］. 呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016：16-17.

［12］魏景超. 真菌鑒定手冊(cè)［M］. 上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1979：1-10.

［13］朱艷蕾. 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定實(shí)驗(yàn)方法的研究［J］. 微生物學(xué)雜志，2016，36（5）：108-112.

［14］韓學(xué)易，陳 惠，吳 琦，等. 產(chǎn)纖維素酶枯草芽孢桿菌C-36的產(chǎn)酶條件研究［J］. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，24（2）：178-181.

［15］李佳佳，鞠玉琳，李 楊. 樺褐孔菌多糖的提取及含量測(cè)定方法的研究［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，48（12）：3133-3135.

［16］黃燕飛. 黃連水提物對(duì)痢疾桿菌的抑菌機(jī)制研究［D］. 合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016：16.

［17］王海濤，王 倩，謝明杰. 大豆異黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)制研究［J］. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42（7）：2586-2591.

［18］謝 強(qiáng)，林玉桓，苗淑萍，等. 香芹酚對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的影響［J］. 食品工業(yè)科技，2014，35（23）：54-58，62.

［19］謝 晶，侯偉峰，湯 毅，等. 植酸對(duì)腐敗希瓦氏菌的抑菌機(jī)理［J］. 食品工業(yè)科技，2011，32（10）：85-88.

［20］李昌勤，趙 琳，薛志平，等. 隱丹參酮抑菌作用機(jī)制研究［J］. 中國(guó)藥學(xué)雜志，2012，47（21）：1706-1710.

［21］趙 蕾，張?zhí)煊? 植物病原菌產(chǎn)生的降解酶及其作用［J］. 微生物學(xué)通報(bào)，2002，29（1）：89-93.

［22］葛紅娟，龍桂友，戴素明，等. 冰糖橙與枸櫞 C-05 對(duì)潰瘍病菌生長(zhǎng)特性的影響［J］. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，48（7）：1383-1391.

［23］徐明生，陳錦屏，上官新晨. 魚(yú)精蛋白對(duì)黑曲霉細(xì)胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶和蘋(píng)果酸脫氫酶的影響［J］. 食品科學(xué)，2005，26（4）：48-51.

［24］曹鵬飛，劉青娥. 楊梅枯萎病拮抗內(nèi)生菌的分離及其抑菌機(jī)制研究［J］. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，50（ 4）：96-105.[HJ1.7mm]

［25］周 磊，云寶儀，汪業(yè)菊，等. 大黃素對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用機(jī)制［J］. 中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2011，27（12）：1156-1160.

［26］李 瑾. 金銀花內(nèi)生真菌的分離鑒定和抗菌性研究［D］. 鄭州：河南工業(yè)大學(xué)，2010：60-61.

［27］周 晶. 病原菌致病性胞外產(chǎn)物（ECP）的研究進(jìn)展［J］. 畜牧與飼料科學(xué)，2009，30 （1）：8-9.

［28］陳 成. 擬態(tài)弧菌感染黃顙魚(yú)的組織嗜性與動(dòng)態(tài)病理?yè)p傷研究［D］. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016：5-6.

［29］婁喜艷，郭洋洋，裴冬麗. 河南商丘月季黑斑病病原菌鑒定及生物學(xué)特性［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，49（19）：138-143.

［30］林海云，車(chē)建美，劉 波，等. 青枯雷爾氏菌致病機(jī)制及其相關(guān)基因的研究進(jìn)展［J］. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，26（5）：899-906.

［31］王 芳. 苦參內(nèi)生拮抗細(xì)菌篩選及其抗菌物質(zhì)純化鑒定［D］. 沈陽(yáng)：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009：125-127.

［32］黃青春. 拌種靈（Amicarthiazol）對(duì)柑橘潰瘍病菌作用機(jī)制研究［D］. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2001：59-70.

［33］鄧 超，付海田，谷 鵬. 長(zhǎng)裙竹蓀子實(shí)體乙醚和乙酸乙酯提取物的化學(xué)組成分析及抑菌活性研究［J］. 食品工業(yè)科技，2014，35（22）：128-134.

［34］吳華彰，費(fèi)鴻君，趙云利，等. 蘿卜硫素對(duì)大腸桿菌抑菌機(jī)制的研究［J］. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2012，43（3）：386-390.

收稿日期：2022-10-08

基金項(xiàng)目：浙江省麗水市重大科技計(jì)劃（編號(hào)：2019ZDYF01）。

作者簡(jiǎn)介：曹鵬飛（1978—），男，陜西旬邑人，副研究員，從事園藝植物病理研究工作。E-mail：297473247@qq.com。

通信作者：吳華芬，高級(jí)農(nóng)藝師，從事植物資源研究推廣工作。E-mail：631154131@qq.com。