何佳利,甘雨滿,白 猛,高程海,張文飛,王銳萍

(1.海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,海南?？?571158;2.海南師范大學(xué),熱帶島嶼生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南?？?571158;3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)海洋藥物研究院,廣西南寧 530200;4.廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530200)

弧菌(Vibrio)是一類革蘭氏陰性細(xì)菌,是海洋環(huán)境中最常見(jiàn)的細(xì)菌類群。迄今為止,全球范圍內(nèi)已有100多種弧菌,廣泛分布于海灣、近海岸海域河口和海底沉積物中[1,2]。部分弧菌是常見(jiàn)的水產(chǎn)養(yǎng)殖致病菌,如副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、哈維氏弧菌(V.harveyi)、鰻弧菌(V.anguillarum)和歐文氏弧菌(V.owensii)等[3-6]。其中,鰻弧菌是最早發(fā)現(xiàn)的魚(yú)類細(xì)菌病原,可感染海水魚(yú)、蝦等多種水產(chǎn)動(dòng)物,對(duì)海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[7,8]。目前,抗生素是治療水產(chǎn)動(dòng)物疾病的主要手段,如果大量使用抗生素使耐藥性菌株不斷涌現(xiàn),水產(chǎn)病害就愈加難以控制。因此,亟需尋找綠色環(huán)保的生物殺菌劑來(lái)防治水產(chǎn)養(yǎng)殖中的弧菌疾病。

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)是一種普遍存在的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌[9],屬于芽孢桿菌屬(Bacillus),與蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)、炭疽芽孢桿菌(B.anthracis)等物種具有許多共同的表型和基因型特性,具有對(duì)環(huán)境無(wú)污染、生物靶向性強(qiáng)、效果顯著和持久的生物防治優(yōu)點(diǎn),有開(kāi)發(fā)成綠色環(huán)保的生物殺菌劑的潛力[10-12]。此外,研究表明蠟樣芽孢桿菌能產(chǎn)生高活性的激素、細(xì)菌素、多肽抗生素、殺蟲(chóng)外毒素以及揮發(fā)性抗菌物質(zhì)等[13,14]。蠟樣芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類型及生物活性多樣,關(guān)于其代謝產(chǎn)物的研究備受關(guān)注。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),熱帶雨林土壤來(lái)源的芽孢桿菌代謝產(chǎn)物具有多種生物活性[15]。經(jīng)過(guò)前期活性篩選發(fā)現(xiàn),蠟樣芽孢桿菌BWL-001的代謝提取物對(duì)副溶血弧菌有微弱活性。為深入研究蠟樣芽孢桿菌BWL-001代謝產(chǎn)物中抗海洋弧菌活性的化學(xué)成分,運(yùn)用多種色譜分離方法,從菌株提取物中分離具有抗海洋弧菌活性的先導(dǎo)化合物,為研發(fā)防治水產(chǎn)養(yǎng)殖中弧菌疾病的綠色環(huán)保的生物殺菌劑提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源

土壤樣品于2016年7月采自中國(guó)海南島霸王嶺熱帶雨林(19°4′11″N,109°10′37″E),從中分離出蠟樣芽孢桿菌BWL-001,菌種一直存放于海南師范大學(xué)熱帶島嶼生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要儀器與試劑

ZYJ-S型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司),高效液相色譜儀(日本島津公司),中壓制備色譜儀(瑞士布奇公司),EYELAN-1100V-W型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化器械株式會(huì)社),YOKO-ZK暗箱式紫外分析儀(武漢藥科新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司),Sephadex LH-20凝膠(上?？评噭┯邢薰?,YMC-Pack ODS-A色譜柱(10 mm×250 mm,5 μm,日本YMC公司),Bruker AV-500 MHz 超導(dǎo)核磁共振儀(瑞士Bruker公司),色譜柱硅膠(青島海洋化工有限公司),核磁所用的氘代試劑購(gòu)自艾覽(上海)化工科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種發(fā)酵培養(yǎng)

在滅菌后的超凈工作臺(tái)內(nèi)用LB培養(yǎng)基(胰蛋白10 g/L,酵母提取粉5 g/L,氯化鈉10 g/L,pH值為7.2-7.4)大規(guī)模發(fā)酵,共發(fā)酵100瓶。每1 000 mL的三角錐形瓶中加入300 mL的培養(yǎng)液,在121 ℃的高溫滅菌鍋中滅菌20 min,待培養(yǎng)基冷卻后接種,室溫120 r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)3 d,共發(fā)酵30 L。

1.2.2 提取與分離

大規(guī)模發(fā)酵后,加入等體積的乙酸乙酯萃取發(fā)酵液(30 L),反復(fù)萃取多次至萃取液顏色變淺。萃取液通過(guò)減壓濃縮得到總浸膏(17.8 g),將總浸膏用200-300目的正相硅膠拌樣,進(jìn)行中壓正相硅膠柱色譜分離,采用石油醚-乙酸乙酯(100∶0-0∶100,V/V)和乙酸乙酯-甲醇(100∶0-0∶100,V/V)體系進(jìn)行梯度洗脫,收集得到6個(gè)小組分(Fr.1-Fr.6)。

Fr.5 (1.7 g)經(jīng)過(guò)Sephadex LH-20凝膠柱色譜(純甲醇)等梯度洗脫分離,再通過(guò)高效液相色譜(水-甲醇15∶5,V/V)梯度洗脫制備得到化合物1(4.3 mg)、2(3.7 mg)、3(4.0 mg)和4(3.5 mg)。Fr.6 (3.4 g)首先經(jīng)過(guò)反相硅膠柱色譜(水-甲醇7∶3-2∶8,V/V)梯度洗脫分離,然后經(jīng)過(guò)Sephadex LH-20(純甲醇)凝膠柱色譜等梯度洗脫分離,最后經(jīng)過(guò)高效液相色譜(水-甲醇9∶11,V/V)等梯度洗脫制備得到化合物5(3.9 mg)。Fr.4 (4.0 g)經(jīng)過(guò)Sephadex LH-20 (氯仿-甲醇1∶1,V/V)凝膠柱色譜等梯度洗脫,然后通過(guò)高效液相色譜(水-甲醇1∶4,V/V)等梯度分離制備得到化合物6(3.1 mg)、7(4.2 mg)和8(4.5 mg)。Fr.3 (2.6 g)經(jīng)過(guò)正相硅膠柱色譜梯度洗脫分離,以乙酸乙酯-甲醇(5∶1-1∶1,V/V)體系梯度洗脫,再經(jīng)高效液相色譜(水-甲醇7∶13,V/V)制備得到化合物9(3.2 mg)和10(5.3 mg)。

1.2.3 抗菌活性測(cè)定

采用96孔板微量稀釋法測(cè)定所有化合物對(duì)歐文氏弧菌(ATCC 25919)、哈維氏弧菌(ATCC 14126)、副溶血弧菌(ATCC 17802)和溶藻弧菌(ATCC 17749)的抗菌活性,測(cè)定化合物的最小抑菌濃度(Minimal Inhibit Concentration,MIC)值。上述4種菌為海洋致病弧菌,目前所有弧菌菌株均保存于廣西中醫(yī)藥大學(xué)海洋藥物研究院?？咕钚詼y(cè)定以氯霉素(Chloramphenicol)為陽(yáng)性對(duì)照,二甲基亞砜(DMSO)為陰性對(duì)照,具體實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

從霸王嶺熱帶雨林土壤來(lái)源的蠟狀芽孢桿菌B.cereusBWL-001中分離鑒定出10個(gè)化合物,結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 化合物1-10的結(jié)構(gòu)

2.2 化合物波譜數(shù)據(jù)

化合物1。淺黃色油狀,ESI-MSm/z:211.1 [M+H]+;1H-NMR (600 MHz,CDCl3)δH:4.11 (1H,m,H-6),4.00 (1H,m,H-3),3.56 (2H,m,H-9),2.33 (1H,m,H-7a),1.74-2.11 (5H,m,H-7b,H-8,H-10),1.52 (1H,m,H-11),0.95 (3H,d,J=4.4 Hz,H-12 or H-13),0.85 (3H,d,J=4.4 Hz,H-12 or H-13);13C-NMR (125 MHz,CDCl3)δC:170.4 (C-2),166.4 (C-5),59.2 (C-6),53.6 (C-3),45.7 (C-9),38.9 (C-10),28.4 (C-7),24.9 (C-11),23.5 (C-8),22.9 (C-12 or C-13),21.4 (C-12 or C-13)。上述核磁波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道一致,因此鑒定該化合物為3-異丁基吡咯并哌嗪-2,5-二酮。

化合物2。淺黃色油狀,ESI-MSm/z:211.1 [M+H]+;1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δH:8.00 (1H,s,NH),4.19 (1H,m,H-6),3.99 (1H,m,H-3),3.37 (2H,m,H-9),2.11 (1H,m,H-7a),1.76-1.91 (5H,m,H-7b,H-8,H-10),1.35 (1H,m,H-11),0.86 (3H,t,J=4.4 Hz,H-12),0.85 (3H,d,J=4.4 Hz,H-13);13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δC:170.3 (C-2),166.5 (C-5),58.5 (C-6),52.6 (C-3),44.8 (C-9),37.8 (C-10),27.5 (C-7),24.1 (C-11),22.8 (C-8),22.5 (C-13),21.9 (C-12)。上述核磁波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道一致,故鑒定該化合物為cyclo-(Pro-lle)。

化合物3。淺黃色油狀,ESI-MSm/z:261.1 [M+H]+;1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δH:7.06 (2H,d,J=8.0 Hz,H-2′,6′),6.66 (2H,d,J=8.0 Hz,H-3′,5′),4.25 (1H,m,H-9),4.02 (1H,t,J=7.4 Hz,H-6),3.62 (1H,m,H-5a),3.40 (1H,m,H-5b),324 (1H,m,H-10a),2.94 (1H,dd,J=14.4,9.2 Hz,H-10b),1.99 (1H,m,H-3a),1.69 (2H,m,H-4),1.38 (1H,m,H-3b);13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δC:169.9 (C-1),164.7 (C-7),155.9 (C-4′),130.7 (C-2′,6′),126.9 (C-1′),115.1 (C-3′,5′),58.3 (C-6),55.9 (C-9),44.5 (C-3),34.7 (C-10),27.8 (C-5),21.7 (C-4)。上述核磁波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道一致,因此鑒定該化合物為maculosin。

化合物4。淺黃色油狀,ESI-MSm/z:245.1 [M+H]+;1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δH:7.30 (2H,br t,J=7.2 Hz,H-2′,6′),7.22 (1H,br t,J=7.2 Hz,H-4′),7.19 (2H,d,J=7.2 Hz,H-3′,5′),4.22 (1H,dt,J=6.7,4.3 Hz,H-9),3.62 (1H,ddd,J=12.0,9.4,8.4 Hz,H-3a),3.39 (1H,ddd,J=12.0,8.4,3.0 Hz,H-3b),3.15 (2H,m,H-10),3.06 (1H,dd,J=10.4,6.6 Hz,H-6),2.18 (1H,m,H-5a),1.94 (1H,m,H-4a),1.79 (1H,m,H-5b),1.69 (1H,m,H-4b);13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δC:169.4 (C-1),164.9 (C-7),135.4 (C-1′),130.1 (C-2′,6′),128.9 (C-3′,5′),127.7 (C-4′),59.2 (C-6),57.9 (C-9),45.3 (C-3),40.6 (C-10),29.1 (C-5),21.8 (C-4)。上述核磁波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道一致,故鑒定該化合物為trans-cyclo-(Pro-Phe)。

化合物5。黃色油狀物,ESI-MSm/z:138.0 [M+H]+;1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δH:7.75 (1H,dd,J=4.0,8.0 Hz,H-7),7.21 (1H,t,J=8.0 Hz,H-5),6.76 (1H,d,J=4.0 Hz,H-4),6.50 (1H,t,J=8.0 Hz,H-6);13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δC:169.9 (C-1),151.7 (C-3),133.9 (C-5),131.5 (C-7),116.6 (C-6),114.9 (C-4),109.7 (C-2)。上述核磁波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道一致,因此鑒定該化合物為anthranilic acid。

化合物6。淡黃色固體,ESI-MSm/z:212.1 [M+Na]+;1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δH:7.48 (1H,d,J=5.2 Hz,H-4),7.35 (1H,d,J=4.6 Hz,H-7),7.24 (1H,s,H-2),7.08 (1H,td,J=4.6,0.8 Hz,H-6),6.98 (1H,td,J=5.2,0.8 Hz,H-5),3.74 (2H,s,H-1′),3.60 (3H,s,H-3′);13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δC:172.0 (C-2′),136.1 (C-7a),127.1 (C-3a),124.1 (C-2),121.0 (C-6),118.5 (C-5),118.4 (C-4),111.4 (C-7),106.9 (C-3),51.5 (C-3′),30.6 (C-1′)。上述核磁波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報(bào)道一致,故鑒定該化合物為indole-3-meth-ylethanoate。

化合物7。棕色晶體(甲醇),mp.168-172 ℃;ESI-MSm/z:174.1 [M-H]-;1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δH:7.51 (1H,d,J=7.8 Hz,H-4),7.35 (1H,d,J=8.4 Hz,H-7),7.23 (1H,d,J=2.4 Hz,H-2),7.08 (1H,td,J=7.8,0.6 Hz,H-6),6.98 (1H,td,J=7.2,1.2 Hz,H-5),3.64 (2H,s,H-1′);13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δC:173.3 (C-2′),136.1 (C-7a),127.2 (C-3a),123.9 (C-2),121.0 (C-6),118.5 (C-5),118.4 (C-4),111.4 (C-7),107.7 (C-3),31.1 (C-1′)。上述核磁波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]報(bào)道一致,故鑒定該化合物為indole-3-acetic acid。

化合物8。黃色油狀,ESI-MSm/z:201.1 [M-H]-;1H-NMR (600 MHz,CDCl3)δH:9.02 (1H,brs,1-NH),7.59 (1H,d,J=8.0 Hz,H-4),7.35 (1H,d,J=8.0 Hz,H-7),7.20 (1H,dd,J=8.0,8.0 Hz,H-6),7.11 (1H,dd,J=8.0,8.0 Hz,H-5),6.93 (1H,d,J=2.2 Hz,H-2),6.08 (1H,brs,12-NH),3.55 (2H,dt,J=6.5 Hz,H-11),2.94 (2H,t,J=6.5 Hz,H-10),1.88 (3H,s,H-14);13C-NMR (125 MHz,CDCl3)δC:170.9 (C-13),136.6 (C-8),127.4 (C-9),122.4 (C-6),121.9 (C-2),119.3 (C-5),118.6 (C-4),112.5 (C-3),111.5 (C-7),40.1 (C-11),25.2 (C-10),23.2 (C-14)。上述核磁波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]報(bào)道一致,因此鑒定該化合物為nb-acetyltryptamine。

化合物9。白色固體,ESI-MSm/z:125.1 [M-H]-;1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δH:11.00 (1H,s,2-NH),10.58 (1H,s,4-NH),7.25 (1H,s,H-5),1.72 (3H,s,H-7);13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δC:165.1 (C-1),151.3 (C-3),137.6 (C-5),107.5 (C-6),11.8 (C-7)。上述核磁波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[25]報(bào)道一致,故鑒定該化合物為thymine。

化合物10。白色固體,ESI-MSm/z:82.1 [M+Na]+;1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δH:6.86 (2H,brs,1-NH),1.77 (3H,s,H-2);13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δC:173.5 (C-1),22.6 (C-2)。上述核磁波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[26]報(bào)道一致,故鑒定該化合物為acetamide。

2.3 抗菌活性測(cè)定結(jié)果

抗海洋弧菌活性測(cè)試結(jié)果表明,化合物6-8對(duì)副溶血弧菌有弱的抑制活性,其MIC值均為12.5 μg/mL,其他化合物的MIC值均大于25 μg/mL,陽(yáng)性對(duì)照氯霉素的MIC值為0.78 μg/mL。

3 結(jié)論

本研究對(duì)海南霸王嶺熱帶雨林土壤來(lái)源的蠟樣芽孢桿菌BWL-001代謝產(chǎn)物進(jìn)行系統(tǒng)研究,從該菌株LB培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物中共分離鑒定出10個(gè)化合物,包括4個(gè)二酮哌嗪類化合物(1-4)、3個(gè)吲哚生物堿衍生物(6-8)以及3個(gè)其他類化合物(5、9和10),所有化合物均首次從該菌株中分離得到,化合物6-8對(duì)副溶血弧菌有弱的抑制活性。此外,據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,化合物1和4對(duì)鰻弧菌有微弱抑制活性[18];化合物2和3未見(jiàn)相關(guān)抗弧菌活性數(shù)據(jù)的報(bào)道;化合物6具有生長(zhǎng)促進(jìn)活性,對(duì)小麥胚芽生長(zhǎng)有促進(jìn)作用[22];化合物8對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌,如金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)等有弱的抑制活性[27],推測(cè)該化合物結(jié)構(gòu)中乙?；鶠橹饕钚曰鶊F(tuán)。本研究?jī)H從蠟樣芽孢桿菌BWL-001代謝產(chǎn)物中分離出10個(gè)單體化合物,仍有很多微量成分未被分離鑒定出來(lái),后續(xù)可以對(duì)該菌株代謝產(chǎn)物中的微量成分進(jìn)行分離,以期獲得更多結(jié)構(gòu)新穎的化合物。本研究豐富了海南霸王嶺熱帶雨林土壤來(lái)源的蠟樣芽孢桿菌中活性代謝產(chǎn)物的研究,為充分挖掘蠟樣芽孢桿菌中抗海洋弧菌的活性物質(zhì)提供了科學(xué)依據(jù)。